具有腫瘤靶向的pamam-fa/黃芩苷納米藥物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種具有腫瘤靶向的PAMAM-FA/黃芩苷納米 藥物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃芩苷化&1(^1111，841)，又名黃金茶，山茶根，爛心草(河北），屬黃銅類化合物。其 化學名為:5，6-二羥基-7-0-葡萄糖醛酸黃酮苷，分子式為C21H18O11，分子量為446.36，其結(jié) 構(gòu)式如下：
[0003] 黃芩苷是從黃芩根中提取分離出來的一種黃酮類化合物，黃芩苷(Baicalin，BAI) 是唇形科植物黃苳(8〇1^61131^3&3；[031611818 860坪；0的有效成分之一，具有清熱、抗炎、 抗病毒、抗氧化等作用(文敏，李雪，付守廷.黃芩苷藥理作用研究新進展[J].沈陽藥科大 學學報，2008,25(2) : 158)，同時具有較強的抗癌反應等生理效能。但黃芩苷屬于黃酮類 化合物，存在水溶性差，生物利用度低等問題（Y.Y. Wang. Advances in research of baicalin absorption and pharmacokinetics. Chin. J. Curr. Pract. Med, 4 (2005) 44-45)。因此，開發(fā)一種能改善水溶性和提高生物利用度的黃芩苷制劑尤為必要。
[0004] 在腫瘤治療領(lǐng)域，納米給藥系統(tǒng)具有不可比擬的優(yōu)越性。納米載體通過增加滲透 性和滯留效應（ERP效應）優(yōu)先地聚集在腫瘤部位（Y. Matsumura, H. Maeda. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteinsand the antitumor agent smancs. Cancer Res, 46 (1986) 6387-6392)。使得腫瘤部位的血藥濃度明顯高于血漿和其他組織。因此納 米給藥系統(tǒng)對腫瘤組織有被動祀向作用(Grobmyer SR, Zhou G, Gutwein LG, Iwakuma N, Sharma P, Hochwald SN. Nanomedicine. 2012, 8 Suppl 1:S21_30)。由于在腫瘤細 胞表面往往過表達與腫瘤生長密切相關(guān)的一系列受體，例如葉酸受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、半乳 糖受體等，將識別這些受體的配體修飾到納米載體表面，實現(xiàn)腫瘤的主動靶向 (Egusquiaguirre SP, Igartua M, Hernandez RM, Pedraz JL. Clin Transl Oncol. 2012，14(2):83-93)。目前有很多改善黃芩苷生物利用度的納米制劑如黃芩苷納晶混懸劑 (CN 102824356A)、黃芩苷元脂質(zhì)體組合藥物（CN 103919724A)、黃芩苷納米結(jié)晶（CN 103637984A)等都被開發(fā)出來。但這些制劑均不具備主動靶向到腫瘤組織的能力。
[0005] 聚酰胺-胺型樹枝狀高分子(Polyamidoamine，PAMAM)是近年來出現(xiàn)的一類新型聚 合物，由活性中心乙二胺，內(nèi)體重復酰胺單元和外表面氨基三部分組成的一類新型納米級 合成高分子。樹狀大分子這種獨特的結(jié)構(gòu)，決定了其表面的大量官能團可以被修飾而功能 化，而其內(nèi)部具有的空腔結(jié)構(gòu)可以包裹藥物。葉酸受體是一種糖蛋白，在腫瘤細胞膜表面高 度表達，而在絕大多數(shù)正常組織中幾乎不表達。利用葉酸受體在不同細胞中表達的差異性 達到主動靶向腫瘤細胞的目的。葉酸(FA)結(jié)構(gòu)式如下：
[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明人制備了具有腫瘤靶向的PAMAM-FA/黃芩苷納 米藥物，既克服了BAI水溶性差的缺陷，同時利用納米載體表面的葉酸與腫瘤細胞表面葉酸 受體的主動靶向作用選擇性地濃集于腫瘤細胞，從而有效地提高了藥物的生物利用度，提 升其臨床應用價值。檢索國內(nèi)外相關(guān)文獻和專利結(jié)果表明：具有腫瘤靶向性的PAMM-FA/黃 芩苷納米藥物及其制備方法，尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有腫瘤靶向的PAMAM-FA/ 黃芩苷納米藥物及其制備方法，既克服了BAI水溶性差的缺陷，同時利用納米載體表面的葉 酸與腫瘤細胞表面葉酸受體的主動靶向作用選擇性地濃集于腫瘤細胞，從而有效地提高了 藥物的生物利用度，提升其臨床應用價值。
[0008] 為達到上述目的，本發(fā)明采取了如下技術(shù)方案： 本發(fā)明提出的一種PAMM-FA/黃芩苷納米藥物，它是黃芩苷(BAI)、葉酸(FA)和聚酰胺-胺型樹枝狀大分子(PAMAM)反應得到的納米藥物，F(xiàn)A的接枝率為0.5%-5%，BAI的包封率為 10%-30%〇
[0009] -種制備如上所述的PAMAM-FA/黃芩苷納米藥物的方法為:先將PAMAM表面的氨基 置換成羥基，再將葉酸與PAMM表面的羥基反應，形成PAMM-FA運載體，包載藥物黃芩苷。
[0010] 所述的PAMAM-FA/黃芩苷納米藥物的制備方法，包括以下步驟： (1) 將PAMAM溶于無水甲醇中，逐滴加入縮水甘油的無水甲醇溶液，室溫N2保護下攪拌 反應過夜，旋蒸除甲醇，粘稠物用純水溶解，裝入透析袋中透析，凍干，得到PAMAM-OH聚合 物； (2) 將PAMAM-OH聚合物和葉酸溶于二甲基亞砜中，放入塞有膠塞的小圓底燒瓶中，充 N2保護，邊攪拌邊逐滴加入含碘代2-氯-1-甲基吡啶(CMPI)和對二甲氨基吡啶(DMAP)的二 甲基亞砜溶液，常溫反應48 h，將反應液用純水稀釋后裝入透析袋中，先用磷酸鹽緩沖液透 析后再用純水透析48 h，離心除去沉淀物，將上清液凍干，得到PAMAM- FA運載體。
[0011] (3)將PAMM- FA運載體和黃芩苷溶于無水甲醇中，放入圓底燒瓶中，密封攪拌，旋 蒸除甲醇，粘稠物用純水溶解，離心除去沉淀物，將上清液凍干，得到PAMM-FA/黃芩苷納米 藥物。
[0012] 步驟⑴中所采用的PAMAM的代數(shù)為3代，4代，5代和6代。
[0013] 步驟(1沖PAMAM:縮水甘油的質(zhì)量比為1:〇.5~1。
[0014] 步驟(1)中PAMAM和縮水甘油在反應液中的總濃度為1~5wt%。
[0015] 步驟⑵中PAMAM-〇H:FA:碘代2-氯-1-甲基吡啶:對二甲氨基吡啶的質(zhì)量比為1: 0.05~0.3：0.87：0.83〇
[0016] 步驟(2)中PAMAM-〇H、FA、黃芩苷、碘代2-氯-1-甲基吡啶、對二甲氨基吡啶在反 應液中的總濃度為1~20wt%。
[0017] 步驟(3)中PAMAM-FA:黃芩苷的質(zhì)量比為1:0.1~0.5。
[0018] 步驟(3)中PAMAM-FA和黃芩苷在反應液中的總濃度為0.1~0.5wt%。
[0019] 步驟(3)中PAMAM-FA:黃芩苷的反應時間為1~8h。
[0020] 所述步驟(1 )、（ 2 )中的透析袋截留分子量為1000~14000。
[0021]本發(fā)明的作用原理是： 第一，利用PAMAM在水溶液中很好的單分散性，通過包載難溶于水的黃芩苷，解決黃芩 昔水溶性差的問題； 第二，由于PAMAM具有納米級別的尺寸，可使納米藥物利用腫瘤組織的增強的滲透和 滯留效應(EPR)被動靶向到腫瘤組織中，提高黃芩苷對腫瘤組織的靶向性； 第三，利用納米載體表面的葉酸與腫瘤細胞表面葉酸受體的主動靶向作用選擇性地濃 集于腫瘤細胞，有效地提高了藥物的生物利用度； 本發(fā)明的有益效果是： 第一，本發(fā)明選用聚酰胺-胺樹狀大分子作為藥物載體，將它與能特異性識別腫瘤細 胞的葉酸共價偶聯(lián)，形成PAMAM-FA運載體，包載藥物黃芩苷，利用運載體在水中很好的單分 散性，解決黃芩苷水溶性差的問題，同時還能通過其表面所修飾的葉酸主動靶向到腫瘤細 胞，增加對腫瘤組織的靶向性； 第二，本發(fā)明的PAMAM-FA/黃芩苷納米藥物的粒徑小于300nm，不會形成給藥栓塞，可用 于患者的靜脈給藥或者腹腔給藥，能夠在腫瘤部位濃集，特異性識別并抑制腫瘤細胞，增強 抗腫瘤效果。
【附圖說明】
[0022]圖1實施例3制備的PAMAM-FA/黃芩苷納米藥物的1H-NMR譜圖，其中A為第5代 PAMAM(G5-NH2)的1H-NMR譜;B為將PAMAM與縮水甘油反應后將PAMAM表面的氨基置換成 羥基的產(chǎn)物(G5-OH)的 1H-NMR譜;C為PAMAM-葉酸運載體(G5-FA)的1H-NMR譜； 圖2實施例5制備的PAMM-FA/黃芩苷納米藥物的釋放曲線； 圖3實施例7制備的PAMM-FA/黃芩苷納米藥物的體外細胞毒性，A為Hela細胞，B為 A549細胞。
【具體實施方式】
[0023]下面，將通過實施例，對本發(fā)明進行進一步說明，但發(fā)明并不局限于這些實施例， 在本發(fā)明權(quán)利要求所闡明的范圍內(nèi)，可進行各種改變或等同替換。
[0024] 實施例1 稱取IOOmg第三代PAMAM(G3-NH2)溶于IOmL無水甲醇中，逐滴加入縮水甘油(85mg)的 無水甲醇溶液，室溫N2保護下攪拌反應過夜。旋蒸除甲醇，粘稠物用純水溶解，裝入透析袋 中透析2天，凍干，得到PAMAM-OH聚合物(G3-OH)。稱取IOOmg G3-OH、5mg葉酸溶于5mL DMSO中，裝入圓底燒瓶中，充氮氣保護。稱取87mg碘代2-氯-1-甲基吡啶(CMPI)和83mg對 二甲氨基吡啶(DMAP)溶于DMSO中，將此DMSO溶液逐滴加入到含G3-OH的圓底燒瓶中，常 溫反應48 h后。將反應液用純水稀釋后裝入透析袋中，先用磷酸鹽緩沖液(PBS)透析后再用 純水透析48 h，離心除去沉淀物，將上清液凍干，得到PAMAM-FA運載體(G3-FA)。稱取IOOmg G3-FA、20mg黃苳苷溶于40mL無水甲醇中，裝入圓底燒瓶中，密封攪拌反應lh。旋蒸除甲 醇，粘稠物用純水溶解，離心除去沉淀物，將上清液凍干，得到PAMAM-FA/BAI (G3-FA/BAI)納 米藥物。
[0025] 實施例2 稱取IOOmg第四代PAMAM(G4-NH2)溶于IOmL無水甲醇中，逐滴加入縮水甘油(85mg)的 無水甲醇溶液，室溫N2保護下攪拌反應過夜。旋蒸除甲醇，粘稠物用純水溶解，裝入透析袋 中透析2天，凍干，得到PAMAM-OH聚合物(G4-OH)。稱取IOOmg G4-OH、10mg葉酸溶于5mL DMSO中，裝入圓底燒瓶中，充氮氣保護。稱取87mg碘代2-氯-1-甲基吡啶（CMPI)和83mg 對二甲氨基吡啶(DMAP)溶于DMSO中，將此DMSO溶液逐滴加入到含G4-OH的圓底燒瓶中， 常溫反應48h后。將反應液用純水稀釋后裝入透析袋中，先用磷酸鹽緩沖液(PBS)透析后再 用純水透析48h，離心除去沉淀物，將上清液凍干，得到PAMAM-FA運載體(G4-FA)。稱取 IOOmg G4-FA、20mg黃苳苷溶于40mL無水甲醇中，裝入圓底燒瓶中，密封攪拌反應lh。旋蒸 除甲醇，粘稠物用純水溶解，離心除去沉淀物，將上清液凍干，得到PAMAM-FA/BAI (G4-FA/ BAI)納米藥物。通過核磁譜圖分析，在一定范圍內(nèi)，提高FA的投料比，可提高FA在PAMAM表 面的接枝率。
[0026] 實施例3 稱取IOOmg第五代PAMAM(G5-NH2)溶于IOmL無水甲醇中，逐滴加入縮水甘油(85mg)的