靶向脂肪細胞的非病毒基因遞送體系的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及靶向脂肪細胞的非病毒基因遞送體系和用于使用該基因遞送體系來 治療肥胖和肥胖誘導的代謝綜合征的治療體系。更具體地，本發(fā)明涉及包括靶向脂肪細胞 的序列（ATS)和九聚精氨酸（R9)肽的非病毒基因遞送體系，其中基因遞送體系直接靶向已 分化的肥胖（成熟）脂肪細胞。
【背景技術】
[0002] 已經開發(fā)了各種基因治療方法作為傳統(tǒng)蛋白質治療方法的替代。然而，在基因治 療中仍存在重要挑戰(zhàn)。基因治療的主要挑戰(zhàn)之一是在最小細胞毒性下實現基因穿過質膜 (在動物細胞中）和核膜的有效注入。
[0003] 在廣義上，基因治療體系可以被分成病毒載體介導的體系和非病毒載體介導的體 系。病毒載體是使用逆轉錄酶病毒或腺病毒構建的，并具有高轉染到細胞中的效率的優(yōu)勢。 然而，病毒載體具有與體內免疫原性相關的問題并且遭受與基因重組相關的固有問題。在 克服這種病毒載體的穩(wěn)定性問題的嘗試中，已經開發(fā)多種等效異位基因遞送體系作為傳統(tǒng) 基于病毒載體的基因遞送策略的替代方案。為了有效的基因遞送，等效異位載體需要克服 細胞內的轉運障礙，如內體逃逸和核定位。
[0004] 另一方面，在低pH下在內體膜中從基于合成肽的基因遞送體系發(fā)生基因泄漏，這 導致DNA縮合和快速的內體逃逸。因此，基于合成肽的基因遞送體系的使用可以克服等效 異位基因遞送體系遇到的問題。因此，已經開發(fā)多種合成肽以在數種細胞系中促進體外基 因遞送。然而，這些合成肽在體內應用中也遭受毒性和血清不穩(wěn)定性的問題。
[0005] 如上所述，病毒載體具有免疫應答、自我復制和體內穩(wěn)定性的問題，而普通等效異 位載體具有以下問題：高細胞毒性和生物毒性以及由于其差的生物相容性引起的低核酸遞 送效率。
[0006] 關于這點，正在進行關于使用短陽離子肽的載體的研究。即使在這種情況下，也存 在一些問題，如在細胞外空間不穩(wěn)定的DNA。載體的其他問題是與DNA的復合物的穩(wěn)定性差 和基因表達水平低。
[0007] 在這些環(huán)境下，存在開發(fā)一種特異性針對特定細胞的基因遞送載體的需求，所述 基因遞送載體具有靶向特定細胞的能力，并有利于DNA到靶向細胞中的注入和DNA從復合 物的釋放，實現期望基因的高表達水平。
[0008] 在這一點上，脂肪細胞、特別是成熟的肥胖脂肪細胞是最終分化的細胞并因此很 難轉染。在先前的研究中，已經使用電穿孔法來轉染脂肪細胞，但是所報道的轉染效率僅為 約10%。此外，在體內基因遞送體系中，該方法還沒有嘗試選擇性地將基因遞送到目標脂肪 組織。
[0009] 因此，本發(fā)明人研究了非病毒基因遞送體系，結果首次發(fā)現以下機制：其中由 特定肽和靶向脂肪細胞的序列（ATS)構成的肽復合物與成熟脂肪細胞中表達的阻抑素 (prohibitin)結合，直接靶向肥胖脂肪細胞，將基因遞送到脂肪細胞中，并促進基因的表 達，因此適合于治療肥胖和肥胖誘導的代謝綜合征。基于該發(fā)現完成了本發(fā)明。

【發(fā)明內容】

[0010] 本發(fā)明要解決的問題
[0011] 本發(fā)明的一個主要目的是提供一種靶向脂肪細胞的基因遞送體系和其中將期望 的基因與基因遞送體系結合的復合物。
[0012] 本發(fā)明的另一目的是使用基因遞送體系來遞送用于治療肥胖和肥胖誘導的代謝 綜合征的治療基因。
[0013] 本發(fā)明的又一目的是提供用于預防或治療肥胖和肥胖誘導的代謝綜合征的藥物 組合物。
[0014] 用于解決問題的手段
[0015] 本發(fā)明的一個方面提供含有靶向脂肪細胞的序列（ATS)和九聚精氨酸（R9)肽的 靶向脂肪細胞的基因遞送體系。
[0016] 靶向脂肪細胞的序列和九聚精氨酸（R9)肽結合至阻抑素，并內化到脂肪細胞中。
[0017] 特別地，九聚精氨酸（R9)肽優(yōu)選具有CyS-(D-R)9-CyS結構，而靶向脂肪細胞的序 列可以由SEQIDNO: 1中所述的氨基酸序列構成。
[0018] 脂肪細胞優(yōu)選為已分化的成熟肥胖脂肪細胞，特別是在分化開始后第9至11天的 成熟肥胖脂肪細胞。
[0019] 本發(fā)明還提供含有靶向脂肪細胞的序列、九聚精氨酸（R9)肽、和用于治療肥胖和 肥胖誘導的代謝綜合征的靶向脂肪細胞的治療基因的復合物。
[0020] 具體地，復合物具有其中用于治療肥胖和肥胖誘導的代謝綜合征的治療基因如 DNA、siRNA或shRNA與基因遞送體系結合的結構。基因遞送體系的構成與以上所述的相同。 用于肥胖治療的治療基因最優(yōu)選為iRNA(RNA干擾基因），如siRNA或shRNA。
[0021] 用于治療肥胖和肥胖誘導的代謝綜合征的治療基因的復合物具有200nm或更小 的直徑。特別地，納米尺寸的復合物具有3:1至8:1的電荷比（+/_)。在該范圍內，確保高 轉染效率。更優(yōu)選地，復合物具有5:1至8:1的電荷比（+/-)。因為細胞膜帶負電荷，所以 當基因遞送復合物作為整體帶正電荷時獲得高的遞送效率。帶正電荷的復合物可以通過電 荷與電荷的相互作用容易地穿過細胞膜。如果復合物帶負電荷，則其不容易地穿過細胞膜。 復合物的電荷的量影響復合物穿過細胞膜的能力。越大量的電荷顯示越好的穿過細胞膜的 能力。
[0022] 本發(fā)明還提供用于治療肥胖和肥胖誘導的代謝綜合征的治療組合物，其含有靶向 脂肪細胞的序列、九聚精氨酸（R9)肽、和作為活性成分的用于治療肥胖和肥胖誘導的代謝 綜合征的靶向脂肪細胞的治療基因。用于治療肥胖和肥胖誘導的代謝綜合征的治療基因可 以是DNA或iRNA，如siRNA或shRNA。
[0023] 本發(fā)明的ATS-R9與脂肪組織脈管系統(tǒng)中的阻抑素結合，之后內化到脂肪細胞中。 簡言之，本發(fā)明的ATS-R9通過阻抑素靶向成熟脂肪組織脈管系統(tǒng)并與成熟脂肪組織脈管 系統(tǒng)結合，穿過血管，并內化到脂肪細胞中。因此，本發(fā)明的ATS-R9特異性地靶向脂肪細 胞，特別是其中大量表達阻抑素的已分化的成熟肥胖脂肪細胞，使得其可以將期望的基因 遞送至脂肪細胞。
[0024] 本發(fā)明的靶向脂肪細胞的非病毒基因遞送體系具有期望基因的高轉染效率、低細 胞毒性和高表達效率。由于這些優(yōu)勢，本發(fā)明的基因遞送體系在期望基因的遞送中是有效 的。
[0025] 本發(fā)明的效果
[0026] 本發(fā)明的ATS-R9肽結構能夠通過阻抑素在分化后的脂肪細胞中的過表達的機制 直接靶向成熟肥胖脂肪細胞，以將基因遞送到脂肪細胞。因為該特異性功能和效果，本發(fā)明 的ATS-R9肽結構在用于肥胖的基因治療中會非常有用。
【附圖說明】
[0027] 圖1是示出通過本發(fā)明的ATS-R9寡肽復合物將靶向基因遞送至脂肪細胞的機制 的示意圖。
[0028] 圖2示出根據脂肪細胞分化程度的關于3T3-L1脂肪細胞的定量分析和油紅0染 色的結果。
[0029] 圖3和4示出ATS-R9的時間依賴的細胞內分布（內化）以證明ATS-R9對脂肪細 胞的特異性結合親和力。
[0030] 圖5示出根據3T3-L1脂肪細胞分化程度的阻抑素的分布。
[0031] 圖6將通過蛋白質印跡確定的非肥胖小鼠中阻抑素和肌細胞的表達與肥胖小鼠 中阻抑素和肌細胞的表達進行比較。
[0032] 圖7示出ATS-R9濃縮和保護DNA的能力的凝膠阻滯分析和小鼠血清中DNA降解 的測試的結果。
[0033] 圖8示出ATS-R9/DNA寡肽復合物的ζ電勢和平均直徑。
[0034] 圖9示出細胞活性分析的結果以評價ATS-R9/DNA寡肽復合物的毒性。
[0035] 圖10示出寡肽復合物的轉染效率。
[0036] 圖11示出使用食源性肥胖（DI0)小鼠的情況下ATS-R9對脂肪組織的靶向效果。
[0037] 圖12和13將ATS-R9的體內歸巢能力與R9的體內歸巢能力進行比較。
[0038] 圖14示出ATS-R9的體內基因表達效果。
[0039] 圖15示出ATS-R9在體外和體內遞送sh-RNA和沉默基因的能力。
[0040] 圖16示出在用sh-FABP4-ATS-R9寡肽復合物處理后體重的減少。
[0041] 圖17和18示出在用sh-FABP4-ATS-R9寡肽復合物處理后胰島素和葡萄糖耐受性 的改變。
[0042] 圖19示出比較ATS-R9遞送基因的能力與作為對照的PEI和lipofectamine遞送 基因的能力的圖。
[0043] 圖20是比較在脂肪細胞分化之前和之后ATS-R9的基因遞送效力的圖。
[0044] 實施發(fā)明的最佳方式
[0045] 本文中所使用的術語的定義如下。
[0046] "基因"意思是在編碼或轉錄蛋白質、或者調節(jié)其他基因表達中具有功能作用的任 何核酸序列或其部分?；蚩梢杂韶撠熅幋a功能性蛋白質的全部核酸或者負責編碼或表達 蛋白質的核酸的僅一部分組成。核酸序列可以包含在外顯子、內含子、起始區(qū)域或終止區(qū) 域、啟動子序列、其他調節(jié)序列或基因的獨特相鄰區(qū)域內的基因異常。
[0047] 術語"多核苷酸"或"核酸"是指任意長度的核苷酸的聚合形式，如脫氧核糖核苷酸 以及核糖核苷酸。該術語僅指分子的一級結構，因此包括雙鏈和單鏈的DNA和RNA。其還包 括已知的修飾類型，例如現有技術中已知的標記、甲基化、"帽"、用類似物取代一種或更多 種天然存在的核苷酸、核苷酸間修飾如利用不帶電荷的連結（例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷 酰胺酯、氨基甲酸酯等）和利用帶電荷的連結（例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）的那些 修飾、含側基團例如蛋白質（包括例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、多聚-L-賴氨酸等）的 那些、利用嵌入劑（例如吖啶、補骨脂素等）的那些、含有螯合物（例如金屬、放射性金屬、 硼、氧化性金屬等）的那些、含有烷化劑的那些、利用修飾連接（例如α異頭核酸等）的那 些，以及未修飾形式的多核苷酸。一般地，本發(fā)明提供的核酸片段可以由基因組的片段和短 的寡核苷酸連接子、或由一系列寡核苷酸、或由單個核苷酸組成，以提供能夠在包括來源于 微生物或病毒操縱子、或真核基因的調控因子的重組轉錄單元中表達的合成核酸。
[0048] 術語"載體"是指能夠將另一種核酸輸送到其已經連接的核酸的核酸分子。術語 "表達載體"意在包括質粒、黏?；蚴删w，其可以合成由載體攜帶的重組基因編碼的神經 突蛋白（Neuritin，CPG15)。優(yōu)選的載體是可以自我復制并表達與其結合的核酸的載體。
[0049] "轉染"意思是以下這種方法：通過該方法，將核酸（例如DNA或RNA)直接引入到 動物培養(yǎng)細胞以表達其基因特性。當目標是植物細胞時，在許多情況下將細胞壁去除并將 核酸引入到原生質體。該方法使得能夠研究醫(yī)學科學和生物學中的許多問題，例如在細胞 水平上的致癌機制、感染、免疫、生成和信息遞送。一般地，將期望的基因包含在運載體如質 粒中，并引入到核酸中。在許多情況下，當在細胞中穩(wěn)定化時將引入的基因插入到染色體 中。已經將核酸引入到其中的細胞被稱為"轉導體"。已經開發(fā)數個方法來克服低轉導效率 的問題。這種方法的實例包括磷酸鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖處理、電穿孔和重分配（稱作脂 質體的人工膜與細胞的融合以用于DNA絡合）。
[0050] "ζ電勢"意思是由在結合至帶電顆粒表面的固定水與可從顆粒容易地分開的可 移動水的擴散雙層中正電荷的密度梯度引起的電動電勢。ζ電勢也表示為細胞表面與周圍 培養(yǎng)流體之間的電勢差。
[0051] 在用作基因遞送體系的復合物中術語"電荷比"意思是當帶負電的DNA與帶正