本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種荷載乳腺癌靶向磁性納米藥物的纖維素膜的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

乳腺癌是全球范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤之一，近幾年逐漸躍居女性惡性腫瘤的首位。據(jù)有關(guān)統(tǒng)計(jì)，我國許多大城市的乳腺癌發(fā)病率正在以快速增長的趨勢逐年上升，年平均增長速度遠(yuǎn)高于世界平均增長速度。同時，我國乳腺癌的死亡率也呈緩慢的上升趨勢，而且乳腺癌的發(fā)病年齡出現(xiàn)了年輕化的傾向，其發(fā)病的中位年齡是48歲，比西方國家提早了10年，對女性的身心健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。

目前乳腺癌的治療是以手術(shù)為主，配合術(shù)后放化療、內(nèi)分泌治療及靶向治療等的綜合療法，雖然治法已經(jīng)比較完善，但仍有許多患者會發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，而且放、化療的不良反應(yīng)及藥物的耐藥也成為許多患者治療上的障礙。

納米生物技術(shù)作為納米技術(shù)與生物技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，在疾病的診斷及治療方面具有十分廣闊的應(yīng)用前景，應(yīng)用納米材料作為藥物載體早已成為納米醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的前沿方向。國內(nèi)外更是開展了很多用靶向納米藥物抑制各類癌細(xì)胞生長的研究。近年來由于乳腺癌發(fā)病率的持續(xù)高升，針對乳腺癌靶向治療的研究方興未艾，出現(xiàn)了抗體介導(dǎo)的靶向、微載體介導(dǎo)的靶向、乳腺癌干細(xì)胞靶向等研究領(lǐng)域，為乳腺癌的治療研究奠定了理論基礎(chǔ)。近幾十年研究發(fā)現(xiàn)，納米技術(shù)聯(lián)合藥物對退行性疾病，如腫瘤、糖尿病和心血管疾病等的預(yù)防以及治療有著不容忽視的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有惡性腫瘤尤其是乳腺癌的治療藥物的缺陷和不足，提供一種荷載腫瘤靶向磁性納米藥物的纖維素膜的構(gòu)建方法。

本發(fā)明另一目的是提供所述荷載腫瘤靶向磁性納米藥物的纖維素膜的應(yīng)用。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種荷載腫瘤靶向磁性納米藥物的纖維素膜的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

S1.腫瘤靶向納米藥物(MHNP/HMME/DOX/FA)的制備

通過化學(xué)修飾的方式使葉酸(FA)具有光活性，將光活性葉酸固定于磁性水凝膠(MHNP)上，再將血卟啉單甲醚(HMME)與腫瘤治療藥物吸附于所述磁性水凝膠中；

S2.荷載腫瘤靶向磁性納米藥物的纖維素膜(BC/MHNP/HMME/DOX/FA)的制備

通過培養(yǎng)木醋桿菌，靜態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生纖維素膜，并在避光條件下，將步驟S1制備的腫瘤靶向納米藥物溶液沒過纖維素膜，60～80rpm/min處理8～20h后取出進(jìn)行真空冷凍干燥。

其中，優(yōu)選地，步驟S1所述腫瘤治療藥物為阿霉素(DOX)。

優(yōu)選地，步驟S1所述光活性葉酸(AzPhFA)的制備方法為：在帶蓋的深色容器中，將葉酸加入含N-琥珀酰亞胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，在冰浴、避光的條件下攪拌反應(yīng)40～50h；將混合溶液透析得到光活性葉酸，冷凍干燥。

優(yōu)選地，得到的光活性葉酸在使用前，加入50ml的PBS溶液溶解，并調(diào)整至所需濃度1ng/μl。

在光活性葉酸(AzPhFA)的制備過程中，優(yōu)選地，所述葉酸和含N-琥珀酰亞胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液的質(zhì)量體積比為1～5μg：1ml。

更優(yōu)選地，所述葉酸和含N-琥珀酰亞胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液的質(zhì)量體積比為2μg：1ml。

優(yōu)選地，所述含N-琥珀酰亞胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，N-琥珀酰亞胺酯的濃度為25～35μg/ml。

更優(yōu)選地，所述含N-琥珀酰亞胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，N-琥珀酰亞胺酯的濃度為30.72μg/ml。

優(yōu)選地，所述含N-琥珀酰亞胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，二甲基甲酰胺DMF和PBS的體積比為2～5：1。

更優(yōu)選地，所述含N-琥珀酰亞胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，二甲基甲酰胺DMF和PBS的體積比為4：1。

優(yōu)選地，所述含N-琥珀酰亞胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液的pH＝7～8。

更優(yōu)選地，所述含N-琥珀酰亞胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液的pH＝7.4。

優(yōu)選地，所述冰浴是4℃冰浴。

優(yōu)選地，所述攪拌反應(yīng)的時間為48h。

優(yōu)選地，所述透析是使用透析袋(MWCO:Nominal:500)進(jìn)行透析三天。

另外，優(yōu)選地，步驟S1所述磁性水凝膠(MHNP)的制備方法為：

(1)制備光活性水凝膠(AzPhNIPA-AA)：將水凝膠溶于PBS緩沖液中得到水凝膠溶液，然后將水凝膠溶液加入到含有疊氮苯胺鹽酸鹽的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，在冰浴條件下攪拌反應(yīng)40～50h；將混合溶液透析純化得到疊氮苯基衍生物，真空冷凍干燥；使用前，向其中加入PBS溶液溶解，配制成一定濃度溶液待用。

(2)制備磁性水凝膠(MHNP)：通過光化學(xué)固定法—液態(tài)光接枝法將水凝膠接枝到納米粒表面；具體是：避光條件下，將光活性水凝膠溶于PBS緩沖溶液中，加入油酸改性后的四氧化三鐵納米粒(Fe₃O₄-OA)，混合均勻，并超聲分散清洗后，振蕩條件下于120～130W紫外燈下8～12cm處照射15～25min后，真空凍干。

在磁性水凝膠(MHNP)的制備過程中，優(yōu)選地，步驟(1)所述水凝膠和PBS緩沖液的質(zhì)量體積比為0.01g：5～15ml。

更優(yōu)選地，步驟(1)所述水凝膠和PBS緩沖液的質(zhì)量體積比為0.01g：10ml。

優(yōu)選地，步驟(1)所述PBS緩沖液的pH＝7～8。

更優(yōu)選地，步驟(1)所述PBS緩沖液的pH＝7.4。

優(yōu)選地，步驟(1)所述水凝膠溶液和含有疊氮苯胺鹽酸鹽的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液的體積比為1：3～5。

更優(yōu)選地，步驟(1)所述水凝膠溶液和含有疊氮苯胺鹽酸鹽的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液的體積比為1：4。

優(yōu)選地，步驟(1)所述含有疊氮苯胺鹽酸鹽的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，疊氮苯胺鹽酸鹽的濃度為1～2mg/ml。

更優(yōu)選地，步驟(1)所述含有疊氮苯胺鹽酸鹽的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，疊氮苯胺鹽酸鹽的濃度為1.5mg/ml。

優(yōu)選地，步驟(1)所述含有疊氮苯胺鹽酸鹽的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，二甲基甲酰胺DMF和PBS的體積比為3～5：1。

優(yōu)選地，步驟(1)所述含有疊氮苯胺鹽酸鹽的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，二甲基甲酰胺DMF和PBS的體積比為4：1。

優(yōu)選地，步驟(1)所述含有疊氮苯胺鹽酸鹽的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液的pH＝7～8。

優(yōu)選地，步驟(1)所述含有疊氮苯胺鹽酸鹽的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液的pH＝7.4。

優(yōu)選地，步驟(1)所述冰浴條件下攪拌反應(yīng)的時間為48h。

優(yōu)選地，步驟(1)所述透析使用透析袋(MWCO:Nominal:500)透析三天。

優(yōu)選地，步驟(2)所述光活性水凝膠和PBS緩沖溶液的質(zhì)量體積比為8～12μg/ml。

更優(yōu)選地，步驟(2)所述光活性水凝膠和PBS緩沖溶液的質(zhì)量體積比為10μg/ml。

優(yōu)選地，步驟(2)所述油酸改性后的四氧化三鐵納米粒(Fe₃O₄-OA)和光活性水凝膠的PBS溶液的質(zhì)量體積比為1：8～12。

更優(yōu)選地，步驟(2)所述油酸改性后的四氧化三鐵納米粒(Fe₃O₄-OA)和光活性水凝膠的PBS溶液的質(zhì)量體積比為1：10。

優(yōu)選地，步驟(2)所述油酸改性后的四氧化三鐵納米粒(Fe₃O₄-OA)的制備方法為：化學(xué)共沉淀法制備四氧化三鐵納米粒，通過自組裝的形式將油酸包裹在納米粒表面，合成Fe₃O₄-OA。

優(yōu)選地，步驟(2)所述超聲分散清洗的時間為30～60分鐘。

優(yōu)選地，步驟(2)所述振蕩條件下于125W紫外燈下10cm處照射20min。

另外，優(yōu)選地，步驟S1所述將光活性葉酸固定于磁性水凝膠(MHNP)上方法是通過光接枝的方法，具體為：將磁性水凝膠(MHNP)溶于PBS緩沖溶液中，然后向其中加入光活性葉酸，在避光條件下混合均勻，并超聲分散清洗后，于120～130W紫外燈下8～12cm處照射15～25s，真空凍干。

所述光接枝的過程中，優(yōu)選地，所述磁性水凝膠和PBS緩沖溶液的質(zhì)量體積比為1mg：8～12ml。

更優(yōu)選地，所述磁性水凝膠和PBS緩沖溶液的質(zhì)量體積比為1mg：10ml。

優(yōu)選地，所述磁性水凝膠和光活性葉酸的質(zhì)量比為80～120：1。

更優(yōu)選地，所述磁性水凝膠和光活性葉酸的質(zhì)量比為100：1。

優(yōu)選地，所述超聲分散清洗的時間為30～60分鐘。

優(yōu)選地，所述125W紫外燈下10cm處照射20s。

另外，優(yōu)選地，步驟S1所述將血卟啉單甲醚(HMME)與腫瘤治療藥物吸附于所述磁性水凝膠中的方法為：將磁性水凝膠溶于PBS緩沖液中，向其中加入溶于PBS緩沖溶液的血卟啉單甲醚和腫瘤治療藥物，冰浴攪拌三天，使磁性水凝膠充分吸附血卟啉單甲醚和腫瘤治療藥物；將反應(yīng)液除去未吸附到水凝膠里的血卟啉單甲醚和腫瘤治療藥物，凍干。使用前加入PBS，將藥物溶液取出并通過過濾除菌，調(diào)至100ng/μl備用。

優(yōu)選地，所述磁性水凝膠與PBS緩沖液的質(zhì)量體積比為1mg：2～5ml。

更優(yōu)選地，所述磁性水凝膠與PBS緩沖液的質(zhì)量體積比為1mg：4～5ml。

優(yōu)選地，腫瘤治療藥物為阿霉素。

優(yōu)選地，所述磁性水凝膠與血卟啉單甲醚或腫瘤治療藥物的質(zhì)量比為1：1。

優(yōu)選地，所述除去未吸附到水凝膠里的血卟啉單甲醚和腫瘤治療藥物的方法為：將反應(yīng)液迅速轉(zhuǎn)移至新的容器中，并在其下方置一塊磁鐵，靜置0.8～1.5(優(yōu)選為1h)后，振蕩5～7(優(yōu)選為6h)，再次靜置，連續(xù)3～5次；再重復(fù)加入PBS重復(fù)上述步驟，以除去未吸附到水凝膠里的血卟啉單甲醚和腫瘤治療藥物。

另外，優(yōu)選地，步驟S2所述木醋桿菌的靜態(tài)發(fā)酵方法為：木醋桿菌用活化培養(yǎng)基培養(yǎng)20～30小時(優(yōu)選為24小時)后，接種于有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，于35～38℃(優(yōu)選為37℃)的生化培養(yǎng)箱中靜態(tài)培養(yǎng)7～10天后，即可得到細(xì)菌纖維素膜。

優(yōu)選地，所述活化培養(yǎng)基：葡萄糖15～25g/L、蛋白胨3～7g/L、酵母粉3～7g/L、磷酸二氫鈉2～3g/L、檸檬酸1～1.5g/L、pH＝5。

更優(yōu)選地，所述活化培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、磷酸二氫鈉2.7g/L、檸檬酸1.15g/L、pH＝5。

優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖25～35g/L、蛋白胨7～8g/L、酵母粉8～12g/L、磷酸二氫鈉7～8g/L、檸檬酸0.3～0.7g/L、pH＝6～7。

更優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30g/L、蛋白胨7.5g/L、酵母粉10g/L、磷酸二氫鈉7.5g/L、檸檬酸0.5g/L、pH＝6.5。

優(yōu)選地，步驟S2所述木醋桿菌靜態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素膜需要先放入NaOH溶液中，70～90℃(優(yōu)選為80℃)水浴浸泡堿處理后，進(jìn)行真空冷凍干燥處理。

優(yōu)選地，所述NaOH溶液的濃度為8～12％。

更優(yōu)選地，所述NaOH溶液的濃度為10％。

優(yōu)選地，所述NaOH溶液浸泡的時間為10～15h。

更優(yōu)選地，所述NaOH溶液浸泡的時間為12h。

優(yōu)選地，步驟S2中制備荷載腫瘤靶向磁性納米藥物的纖維素膜的具體方法是：避光條件下，將PBS磷酸緩沖液配制的靶向磁性納米藥物溶液滴加于干燥的纖維素膜上直至能沒過纖維膜，避光條件下，置于搖床上12h后取出進(jìn)行真空冷凍干燥；4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

另外，本發(fā)明制備的荷載腫瘤靶向磁性納米藥物的纖維素膜在制備腫瘤治療藥物方面的應(yīng)用，也咋本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

優(yōu)選地，所述腫瘤治療藥物為阿霉素。

優(yōu)選地，所述腫瘤為乳腺癌。

更優(yōu)選地，所述乳腺癌的細(xì)胞系為人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系。

本發(fā)明中，纖維素膜是由木醋桿菌經(jīng)靜態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生纖維素，通過氫氧化鈉溶液中80攝氏度水浴2小時處理后而成，乳腺癌靶向磁性納米遞藥系統(tǒng)是在前期光化學(xué)固定法將具有溫度和pH敏感性的水凝膠接枝到四氧化三鐵納米粒表面形成磁性水凝膠載體基礎(chǔ)上，在水凝膠表面接枝靶向分子配體葉酸，同時吸附阿霉素和血卟啉單甲醚。

本發(fā)明中，通過利用超順磁性的納米磁性粒子通過具有溫度和pH敏感性的水凝膠攜帶抗癌藥物阿霉素(DOX)與光敏劑血卟啉單甲醚(HMME)，以及葉酸表面修飾后介導(dǎo)靶向，并將修飾后的納米粒子荷載于天然的纖維素膜上，結(jié)合外部施加磁場與激光宏觀靶向，構(gòu)成納米靶向遞藥系統(tǒng)。通過外敷的給藥方式作用到癌變部位，同時還可以輔助外加磁場的方式宏觀靶向?qū)⒖谷橄侔┧幬镞\(yùn)送至腫瘤細(xì)胞周圍，同時借助葉酸的微觀靶向?qū)崿F(xiàn)與乳腺癌細(xì)胞表面受體結(jié)合，同時外加激光使光敏劑血卟啉單甲醚協(xié)同抗腫瘤藥物阿霉素隨載體進(jìn)入細(xì)胞后釋放誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞程序性死亡，從而達(dá)到高效靶向抑制癌細(xì)胞生長的效果。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明所述遞藥系統(tǒng)具有毒副作用低，并且結(jié)合了光動力療法與化療協(xié)同抑制的目的，是一種新型的多重靶向給藥系統(tǒng)。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明制備的荷載乳腺癌靶向磁性納米藥物的纖維素膜(文中簡稱復(fù)合纖維素膜)，具有較好的穩(wěn)定性、分散性以及均一性，實(shí)現(xiàn)了載藥磁性納米藥物與細(xì)胞靶向(葉酸)結(jié)合磁場與激光的有機(jī)結(jié)合，構(gòu)成了一種新型的抑制乳腺癌細(xì)胞生長的治療系統(tǒng)，纖維素膜負(fù)荷載藥靶向磁性納米粒子(BC/MHNP/HMME/DOX/FA)的乳腺癌靶向磁性納米遞藥系統(tǒng)，同時外加磁場和激光處理后對乳腺癌細(xì)胞生長抑制率最高，有明顯的高效靶向抑制乳腺癌細(xì)胞生長的效果。

本發(fā)明中的乳腺癌靶向磁性納米遞藥系統(tǒng)成功合成，并構(gòu)建新型的聯(lián)合治療系統(tǒng)，所設(shè)計(jì)制備的荷載磁性納米粒子的復(fù)合纖維素膜，協(xié)同磁場與激光的乳腺癌靶向聯(lián)合治療系統(tǒng)融合物理與生物的靶向機(jī)制，化療與光動力治療的雙重抑制乳腺癌機(jī)制，能夠高效抑制乳腺癌細(xì)胞的生長，這為乳腺癌的精準(zhǔn)化個體化綜合治療和靶向藥物治療臨床治療提供了新的思路，具有很好的應(yīng)用于臨床治療乳腺癌前景。

而且，本發(fā)明中將光敏劑利用磁性納米粒子載體攜帶直接靶向作用于乳腺癌細(xì)胞，不僅能高效抑制乳腺癌細(xì)胞的生長，而且大大降低了常規(guī)光敏劑藥物使用劑量，以及過高劑量的光敏劑對正常組織的損害

體外透皮組比靜脈注射組具有更好的抑瘤效果，本發(fā)明中充分利用細(xì)菌纖維素膜的特有優(yōu)勢，同時結(jié)合磁性納米粒子載體靶向給藥，創(chuàng)新性的以敷料的方式通過經(jīng)皮給藥，實(shí)現(xiàn)乳腺癌治療過程中的可控緩釋給藥，大幅度降低了乳腺癌抑制藥物對正常組織的毒副作用。

附圖說明

圖1為納米藥物表征實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其中，A：光活性葉酸接枝效率；B：磁性水凝膠血卟啉單甲醚吸附效率實(shí)驗(yàn)。

圖2為納米藥物表征實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其中，C：磁性納米粒粒徑分布；D：血卟啉單甲醚釋放動力學(xué)實(shí)驗(yàn)。

圖3為細(xì)菌纖維素膜及復(fù)合纖維素膜表征實(shí)驗(yàn)；其中，A：XRD結(jié)晶度檢測；B：TGA熱重分析。

圖4為細(xì)菌纖維素膜及復(fù)合纖維素膜表征實(shí)驗(yàn)；其中，C：FT-IR紅外光譜檢測；D：Roman拉曼光譜檢測。

圖5為細(xì)菌纖維素膜及復(fù)合纖維素膜AFM原子力顯微鏡(A)與SEM掃描電鏡(B)檢測。

圖6為磁場與激光條件下，不同納米粒子與復(fù)合纖維素膜作用于乳腺癌MCF7細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果。

圖7為磁場與激光條件下，磁性納米藥物與復(fù)合纖維素膜抑制乳腺癌MCF7細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖8為磁場激光條件下流式檢測細(xì)胞凋亡效果。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說明，本發(fā)明所用試劑和材料均為市購。

實(shí)施例1制備復(fù)合纖維素膜

1材料、試劑與儀器

1.1細(xì)胞株

人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7細(xì)胞系)由中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院提供，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。

1.2主要試劑、儀器

四氧化三鐵納米粒和水凝膠：為本實(shí)驗(yàn)室前期合成；血卟啉單甲醚：購買自廣州威佳生物科技有限公司；胰酶、低糖DMEM培養(yǎng)基均為GIBCOBRL公司產(chǎn)品；新生小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；96孔聚苯乙烯組織培養(yǎng)基板為美國Corning康寧公司產(chǎn)品。

Nikon顯微鏡，日本Olympus公司光學(xué)倒置顯微鏡，Sigma32184高速冷凍離心機(jī)，Thermo CO₂培養(yǎng)箱，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠78-1磁力攪拌器，HV-85高壓滅菌器，無菌操作臺，廣州科橋?qū)嶒?yàn)技術(shù)設(shè)備有限公司恒溫水浴鍋等。

2制備方法

2.1磁性納米藥物(MHNP/HMME/DOX/FA)的制備與表征

2.1.1磁性水凝膠(MHNP)的制備

(1)光活性水凝膠(AzPhNIPA-AA)的制備

稱取0.01g水凝膠，溶于10ml pH＝7.4的PBS緩沖液中，吸取1ml水凝膠溶液加入到4ml含有6.00mg疊氮苯胺鹽酸鹽的二甲基甲酰胺DMF/PBS(pH＝7.4，體積比為4：1)溶液中，在冰浴條件下攪拌反應(yīng)48h。將混合溶液轉(zhuǎn)移至透析袋(MWCO:Nominal:500)純化疊氮苯基衍生物，透析三天。取出溶液用真空冷凍干燥機(jī)(LGJ-12，BYLABO)凍干。凍干后，向其中加入PBS溶液溶解，配制成一定濃度溶液待用。

(2)磁性水凝膠(MHNP)的制備

通過光化學(xué)固定法—液態(tài)光接枝法將水凝膠接枝到納米粒表面。避光條件下，將之前制備的光活性水凝膠溶于PBS緩沖溶液中，配制成一定濃度，加入一定量油酸改性后的四氧化三鐵納米粒(Fe₃O₄-OA)，混合均勻，并用超聲波清洗器分散一段時間后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中；振蕩條件下，于125W紫外燈下10cm處照射20min后，收集于離心管中，真空凍干后備用。

2.1.2光活性FA的制備

取一帶瓶蓋的棕色小瓶，分別將50μg的FA加入25ml含768μg N-琥珀酰亞胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS(pH＝7.4，體積比為4：1)溶液中，在4℃(冰浴、避光)的條件下攪拌反應(yīng)48h。將混合溶液轉(zhuǎn)移至透析袋(MWCO:Nominal:500)純化葉酸，透析三天，冷凍干燥備用。使用前，加入50ml的PBS溶液溶解，并調(diào)整至所需濃度1ng/μl。

2.1.3光活性葉酸接枝

稱取1mg磁性水凝膠(MHNP)溶于10ml PBS緩沖溶液中，吸取1ml磁性水凝膠溶液，向其中加入1μg光活性FA，MHNP與AzPhFA的比例為100:1)，在避光條件下混合均勻，并用超聲波清洗器分散一段時間后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，于125W紫外燈下10cm處照射20s，真空凍干備用。

2.1.4血卟啉單甲醚(HMME)和阿霉素(DOX)吸附

(1)稱取1mg上述制備的納米藥物溶于PBS＜5ml緩沖液中，向其中加入溶于PBS緩沖溶液的1mg血卟啉單甲醚或阿霉素，冰浴攪拌三天，使MHNP充分吸附藥物。將反應(yīng)液迅速轉(zhuǎn)移至10ml管中，并在其下方置一塊磁鐵，靜置1h后，振蕩6h，再次靜置，連續(xù)3-5次；再重復(fù)加入適量PBS重復(fù)上述步驟，以除去未吸附到水凝膠里的HMME與DOX。凍干，加入PBS，將藥物溶液取出并通過過濾除菌，調(diào)至100ng/μl備用。

2.1.5磁性納米藥物(MHNP/HMME/DOX/FA)的表征

(1)血卟啉單甲醚水凝膠相互作用實(shí)驗(yàn)

1)HMME裝載效率與吸附效率測定

a.取3.0mg MHNP、4.8mg(b)HMME溶于5ml PBS緩沖液中(總V＝5.6ml)，4℃冰浴攪拌3天；

b.將反應(yīng)液迅速轉(zhuǎn)移至10ml管中，并在其下方置一塊磁鐵，靜置1h后，連同磁鐵手動輕輕搖晃數(shù)分鐘，再次靜置，連續(xù)3-5次；再重復(fù)加入適量PBS；

c.收集盡可能多的吸取上清液，混勻后，取500ul，用分光光度計(jì)在390nm處測定HMME吸光度a，計(jì)算HMME含量(c值)；

d.計(jì)算HMME的吸附效率

Encapsulation efficiency(％)＝(Mb-Mc)/Mb×100％

計(jì)算水凝膠的裝載效率

Loading efficiency(％)＝(Mb-Mc)/Ma×100％。

(2)釋放動力學(xué)測定

取適量充分吸附裝載了HMME的納米藥物載體(Fe₃O₄-OA/NIPA-AA/DOX)轉(zhuǎn)移至透析袋中，分別置于4℃、37℃、41℃下的PBS緩沖溶液中進(jìn)行透析，分別在0min、15min、30min、45min、1h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、72h時間點(diǎn)從透析液中取出1ml置于EP管中，并向透析液中加入等體積的PBS緩沖液。最后，用高效液相色譜定量檢測各時間點(diǎn)收集的透析液中HMME的含量，并繪制其釋放動力學(xué)曲線。

(3)葉酸接枝率的檢測

FA光固定于納米粒子上之后，總質(zhì)量發(fā)生變化，剩余(未固定的)FOL質(zhì)量將小于固定前FA總質(zhì)量。同時，分散于酒精后的密度、分光光度也將發(fā)生變化。故可采用分光光度法進(jìn)行定量檢測，F(xiàn)A與AzPhFA在280nm處都出現(xiàn)了最大紫外吸收峰，故可用該波長進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)測定。通過對標(biāo)準(zhǔn)品FA進(jìn)行紫外分光光度法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制后，進(jìn)行對接枝一定量的磁性水凝膠納米粒子前后AzPhFA樣品的質(zhì)量變化進(jìn)行檢測并進(jìn)行計(jì)算(m₁，m₂)。接枝量＝m₁-m₂。

(4)磁性納米藥物(MHNP/HMME/DOX/FA)粒徑大小檢測

將少量的一定濃度納米藥物(Fe3O4-OA/NIPA-AA/HMME/FOL/DOX)溶液，用粒度儀(Vector-33，德國Bruker公司)表征，作圖并分析其粒徑大小與分布。

2.2復(fù)合纖維素膜(BC/MHNP/HMME/DOX/FA)的制備與表征

(1)細(xì)菌纖維素膜的制備

木醋桿菌靜態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生纖維素膜，具體方法為：木醋桿菌用活化培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后，接種于有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，于37℃的生化培養(yǎng)箱中靜態(tài)培養(yǎng)7～10天后，即可得到細(xì)菌纖維素膜。

其中，所述活化培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、磷酸二氫鈉2.7g/L、檸檬酸1.15g/L、pH＝5。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖30g/L、蛋白胨7.5g/L、酵母粉10g/L、磷酸二氫鈉7.5g/L、檸檬酸0.5g/L、pH＝6.5。

(2)復(fù)合細(xì)菌纖維素膜(BC/MHNP/HMME/DOX/FA)的制備與表征

木醋桿菌靜態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素膜放入10％NaOH溶液中，80攝氏度水浴浸泡12h堿處理后，進(jìn)行真空冷凍干燥，置于培養(yǎng)皿中，避光條件下，將PBS磷酸緩沖液配制的一定濃度靶向磁性納米藥物滴加于干燥的纖維素膜上直至能沒過纖維膜，避光條件下，置于搖床上12h后取出進(jìn)行真空冷凍干燥。4℃儲存?zhèn)溆?。并分別進(jìn)行XRD、TGA、XPS、FT-IR、Roman、SEM、AFM檢測。比較兩種膜的性質(zhì)是否發(fā)生變化。

3、結(jié)果

(1)磁性納米藥物合成與表征

1)光活性葉酸接枝效率實(shí)驗(yàn)

通過配制不同濃度的葉酸標(biāo)準(zhǔn)品的溶液，通過紫外可分光光度計(jì)進(jìn)行對其吸光度的檢測，并根據(jù)吸光度與相應(yīng)的葉酸濃度進(jìn)行繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過對樣品進(jìn)行吸光度測定，并根據(jù)上述結(jié)果進(jìn)行計(jì)算可知光活性葉酸原溶液濃度31.32ug/ml，紫外接枝后剩余濃度為9.84ug/ml，光活性葉酸AzPhFA接枝量＝31.32-9.84＝21.48μg。如圖1A所示。由上可知磁性水凝膠光接枝光活性的葉酸AzPhFA的就接枝率達(dá)68.58％。

2)血卟啉單甲醚標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與檢測

通過配制不同濃度的血卟啉單甲醚HMME標(biāo)準(zhǔn)品的溶液，通過紫外可分光光度計(jì)進(jìn)行對其吸光度的檢測，并根據(jù)吸光度與相應(yīng)的葉酸濃度進(jìn)行繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)過對磁性水凝膠吸附光敏劑血卟啉單甲醚前后溶液取樣，并檢測相應(yīng)的吸光度經(jīng)檢測的a＝4.136，由上圖經(jīng)計(jì)算濃度c＝148.7677*5＝743.8385ug/ml。

則剩余HMME的含量為Mc＝743.8385*5.6＝4165.4969ug/ml＝4.165mg/ml

吸附效率(％)＝(1-4.165/4.8)*100＝13.23％

裝載效率(％)＝(4.8-4.165)/1*100＝63.45％，如圖1B。

3)納米藥物粒徑大小檢驗(yàn)

如圖2C所示，將合成后的磁性納米粒子配制成一定濃度的溶液并使用粒徑檢測儀進(jìn)行檢測，并將數(shù)據(jù)通過Origin8.5繪制，表明納米藥物經(jīng)過接枝葉酸和吸附血卟啉單甲醚、阿霉素后粒徑約在100nm左右。

4)釋放動力學(xué)實(shí)驗(yàn)

通過紫外分光光度法進(jìn)行檢測不同時間段的吸光度并計(jì)算相應(yīng)的HMME濃度，并進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，通過Origin 8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。如圖2D所示，可看到37℃條件下HMME釋放效率約70％左右。41℃條件下水凝膠臨界點(diǎn)處釋放效率達(dá)到85％左右。

(2)纖維素膜與復(fù)合纖維素膜的表征

由圖3和4可看出，通過對細(xì)菌纖維素膜與吸附納米藥物后的復(fù)合纖維素膜進(jìn)行表征實(shí)驗(yàn)，可以看出吸附納米藥物的復(fù)合纖維素膜的結(jié)晶度并未發(fā)生明顯變化(圖3A)，紅外光譜以及拉曼光譜(圖3B和圖4D)沒有新的波峰出現(xiàn)，只是熱穩(wěn)定性有所提升(圖4C)。初步判斷，納米粒子與纖維素膜的吸附，主要是靜態(tài)吸附形成復(fù)合纖維素膜，并隨納米粒子的加入，增加了細(xì)菌纖維素膜的穩(wěn)定性。

由圖5可以從直觀上看出，納米粒子吸附在纖維素膜表面以及內(nèi)部，部分粒子與纖維結(jié)合，初步推斷可能是由于納米粒子與纖維素膜之間形成H-O間氫鍵，是的納米粒子結(jié)合于纖維素膜上。

另外，由表1的結(jié)果也可以看出，細(xì)菌纖維素膜本身主要是以碳、氧和氫為主，復(fù)合后的粒子氮元素的含量增加，主要是來自于納米粒子中葉酸與血卟啉單甲醚等物質(zhì)含有的氮元素。

表1 BC membrane和BC/MHNP/HMME/DOX/FA表面元素濃度XPS分析

綜上所述，本發(fā)明的磁性納米粒子成功合成，并通過靜態(tài)吸附的方式與細(xì)菌纖維素膜以氫鍵的方式結(jié)合，穩(wěn)定存在于細(xì)菌纖維素膜的內(nèi)部與表面，形成新型的復(fù)合纖維素膜。

實(shí)施例2體外抑制乳腺癌MCF7細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)

1、細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7細(xì)胞系)由中國科學(xué)院大學(xué)深圳先進(jìn)技術(shù)研究院提供。細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至80％后，以1×10⁴/孔的密度接種至24孔板上，培養(yǎng)12、24、36，以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。其它細(xì)胞培養(yǎng)條件為：含10％新生牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，37℃，5.0％CO₂。

2、纖維素膜荷載納米粒子抑制MCF7生長研究

(1)細(xì)胞培養(yǎng)

將生長狀況良好的MCF7細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基DMEM高糖有血清，待細(xì)胞長至70-80％時，進(jìn)行消化處理并接板(6孔板)，接板密度約1.0×10⁵個/孔。

(2)實(shí)驗(yàn)磁場與激光器

實(shí)驗(yàn)磁場(M)：100mT/cm2左右；細(xì)胞處理時間12h。

實(shí)驗(yàn)激光(L)：632.8nm，100mW，細(xì)胞處理時間：2min。

實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)，磁場作用時間與激光照射時間均相同，分別為12h，2min；激光照射實(shí)驗(yàn)完成后需進(jìn)行將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中孵育4h。

(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理

1)CCK-8細(xì)胞增殖檢測

主要實(shí)驗(yàn)步驟

a.制備細(xì)胞懸液10⁶/ml.

b.接種100μl到96孔板中，接種數(shù)量為10000/孔。

c.37℃培養(yǎng)孵育4h，待細(xì)胞貼壁；

d.加入10μl的CCK-8，培養(yǎng)箱中孵育4h(加CCK-8前，更換培養(yǎng)基)

e，酶聯(lián)免疫反應(yīng)，利用酶標(biāo)儀測定450nm吸光度。

空白對照：不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加CCK-8藥物.

2)標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度設(shè)定(100/500/1000/5000/10000/10000)

3)樣品檢測

檢測波長：450nm參比波長：620nm(去除樣品渾濁所帶來的吸收)

終止反應(yīng)：每孔加10μl 0.1M HCL溶液，放4℃。

樣品檢測：避光條件下，進(jìn)行酶標(biāo)儀檢測并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

(4)流式檢測

將纖維素膜荷載不同濃度納米粒子處理的乳腺癌細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化后，用PBS緩沖液洗2-3次后，并進(jìn)行加入1mlPBS重懸，加入PI染色液，30min，進(jìn)行檢測，獲得結(jié)果并進(jìn)行處理。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(1)形態(tài)學(xué)觀察與CCK-8細(xì)胞存活率檢測

由圖6可以看出，通過磁場(100mT,4h)與激光(632.8nm,100mW,2min)處理后，外加乳腺癌靶向磁性納米粒子(MHNP/HMME/DOX/FA)乳腺癌細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)上的改變，多數(shù)都變成了圓形的細(xì)胞，并出現(xiàn)類似凋亡小體狀物，以及較多的細(xì)胞碎片，經(jīng)復(fù)合纖維素膜作用后的同樣能達(dá)到乳腺癌靶向磁性納米粒子同樣的效果，且具有較好的靶向效果。

由圖7可以看出，通過磁場(100mT,4h)與激光(632.8nm,100mW,2min)處理后，乳腺癌靶向磁性納米粒子(MHNP/HMME/DOX/FA)對乳腺癌細(xì)胞的生長抑制率達(dá)80％以上，乳腺癌靶向磁性納米粒子荷載的復(fù)合纖維素膜具有較好的抑制乳腺癌細(xì)胞生長的效果，同時，具有很好的抑制乳腺癌細(xì)胞生長的效果。

(2)在磁場激光條件下，流式檢測細(xì)胞凋亡效果

如圖8所示，從流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果可以看出，磁性納米粒子(MHNP/HMME/DOX/FA)有機(jī)的結(jié)合了乳腺癌化療與光動力治療，在結(jié)合葉酸生物靶向與磁場靶向的雙重效果，該納米粒子具有較好的殺傷乳腺癌細(xì)胞的效果；同時將磁性納米粒子吸附于細(xì)菌纖維素膜后，作用于乳腺癌細(xì)胞同樣具有高效抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7生長的效果。