本發(fā)明屬于腫瘤靶向示蹤及治療領域，具體涉及一種水溶性酸響應淋巴靶向藥物緩釋載體納米炭及其制備方法，還涉及由該納米炭和抗腫瘤藥物制備得到的藥劑及其制備方法，以及涉及該納米炭制備淋巴示蹤和腫瘤治療制劑方面的用途和所得藥劑在制備淋巴示蹤和腫瘤治療藥物方面的用途。

背景技術：

癌癥是危害人體健康和威脅人類生命的元兇之一，腫瘤的難治在于它的多發(fā)、復發(fā)和轉移。在腫瘤的整個發(fā)展歷程中，腫瘤的轉移和傳播占據(jù)了關鍵的地位，也是癌癥會成為人類最難攻克的疾病的主要原因之一。腫瘤的轉移與傳播是一個復雜的過程，對于不同的腫瘤來說，科學家至今未能對于它們的共性進行確切地闡述。有的腫瘤單單只依靠血液轉移途徑，有的只依靠淋巴轉移途徑，而有的在它們發(fā)展轉移的不同階段同時依賴著這兩種途徑。然而對于很多最常見和最致命的實體腫瘤的傳播來說，淋巴轉移往往發(fā)揮著最主要的作用，特別是胃癌和大部分的皮源性腫瘤，如乳腺癌、肺癌、結腸癌和前列腺癌等。

最近有研究發(fā)現(xiàn)在實體瘤中或實體瘤周存在有淋巴管，細胞因子和生長因子刺激著腫瘤淋巴并且腫瘤轉移程度與腫瘤內新生淋巴管的程度有直接的關系，腫瘤細胞通過新生毛細淋巴管進入淋巴結，淋巴轉移在癌癥分期與預后中扮演了重要的角色。

因此臨床上迫切需要一種能在術中清楚地顯示腫瘤周邊淋巴結的指示劑，定向地指示出已存在癌細胞轉移的淋巴結，從而有助于徹底切除轉移的淋巴結，防止癌癥的轉移和腫瘤的復發(fā)。

目前，較為常用的指示劑為活性炭混懸液。臨床通常使用的納米炭混懸注射液(商品名：卡納琳，CNS)是通過特殊加工，將普通活性炭球磨制成粒徑為21nm左右的光滑活性炭納米顆粒(activated carbon nanoparticles,ACNPs)，再輔以助懸劑聚乙烯毗咯烷酮(PVP)，用生理鹽水制成黑色混懸劑，形成平均粒徑約150nm的納米炭團?？{琳注射于腫瘤周圍組織間隙后，納米炭粒會迅速地以滲透和擴散的方式通過局部缺如或者不完整的毛細淋巴管的基底膜、內皮細胞間隙，以及巨噬細胞的吞噬和胞飲作用，主動運輸或被動運載到局部淋巴管和淋巴結內，并部分滯留于引流淋巴結(黑染)。其余部分繼續(xù)移行至下一站引流淋巴結，使區(qū)域內各站引流淋巴結形成黑染。

申請?zhí)枮?2113731.5的中國專利詳細的公布了納米炭混懸注射液的制備方法。然而，該專利所得的注射液需要大量的助懸輔料，其中作為輔料的聚乙烯吡咯烷酮，據(jù)美國FDA的資料顯示，其可能影響凝血功能。同時，用于給藥化療時，該注射劑在使用前的配制和儲藏受到許多限制性條件的約束，不利于臨床使用。另外，該注射劑由于需要考慮到整個注射液體系的分散性，人們難以根據(jù)實際需求，向其中加入對于治療而言重要甚至是必要的藥物，極大的限制了其實際應用。

申請?zhí)枮?00410092028.9的中國專利改善了上述注射液的水溶性問題，其通過利用濃硝酸對納米炭進行氧化，制備得到了無需分散助懸輔料的接枝納米炭混懸液。

然而，人們發(fā)現(xiàn)僅對納米炭進行氧化處理，靜置時間久后，容易沉淀產(chǎn)生結塊，重分散性不好，需進行超聲處理才能很好的將納米炭重新分散。這就意味著，在實際的醫(yī)用中，必須(至少是很有必要)進行現(xiàn)配現(xiàn)用，否則一旦出現(xiàn)團聚甚至是結塊則不能產(chǎn)生相應的淋巴示蹤效果，給臨床帶來了極大不便。

另外，在臨床中，雖然轉移的腫瘤可被所用納米炭染色，便于醫(yī)生發(fā)現(xiàn)并將其切除或做其它相應處理，然而，當腫瘤過小以至于難以被醫(yī)生識別，或者當轉移的腫瘤處于難以進行相應手術的位置時，納米炭則喪失了相應的臨床意義，極大的影響了治療效果。

對于難以利用手術或者常規(guī)劑型的藥物進行治療的腫瘤，通常的做法是將藥物裝載在具有腫瘤靶向性的藥物載體上。該方法的一般要求是所用載體對藥物的載藥量高、藥物的釋放行為好以及具有一定的環(huán)境響應性。雖然目前人們已經(jīng)獲得了不少符合上述要求的腫瘤靶向藥物載體，但是在臨床實際中，為了完全清除轉移的腫瘤，使用納米炭的同時還使用其他靶向治療藥物無疑成本巨大。更重要的是，醫(yī)療人員完全可以僅僅選用治療效果好的靶向治療藥物，這使得納米炭的臨床應用的必要性大為降低。

綜上所述，為了提高納米炭的臨床使用價值，必須至少解決現(xiàn)有技術的如下缺點：(1)納米炭容易結塊且不易重分散；(2)現(xiàn)有納米炭未能實現(xiàn)腫瘤治療意義上的載藥。

為了克服上述載藥問題，中國專利200510021728.3通過將抗癌前藥與納米炭偶聯(lián)，實現(xiàn)了將藥物靶向釋放至腫瘤區(qū)域的效果。然而，該專利沒有解決納米炭的重分散問題；同時適用的藥物較少，需為具有活性較好的氨基、亞氨基或羥基的抗癌藥物；另外其制備步驟和耗時較長且反應過程中容易造成抗癌藥物的浪費。

因此，本領域亟需能同時解決上述現(xiàn)有技術缺點且易于應用的技術。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術的缺點，本發(fā)明的目的之一在于提供一種水溶性酸響應淋巴靶向藥物緩釋載體納米炭，該納米炭由表面羧基含量為0.10-1.00mmol/g的活性炭與氨基聚乙二醇單甲醚接枝而得，接枝量為1.00-10.00％(W％)，所述納米炭的粒徑為50-500nm。

如本發(fā)明的實施例所示，本發(fā)明納米炭相對于僅僅經(jīng)過氧化處理的納米炭而言，具有更好的水分散性，這可能是由于PEG溶于水中，會在顆粒表面溶解伸展形成一定的空間體積排斥，從而增加了活性炭納米顆粒在水溶液中的穩(wěn)定性，并且減少了其發(fā)生聚沉的可能性。更重要的是，本發(fā)明的納米炭靜置之后不會形成結塊，靜置后的沉淀僅需稍加震蕩便可重新分散。相比于商用產(chǎn)品卡納琳而言，本發(fā)明納米炭無需助分散劑，避免了PVP對人體凝血功能的潛在威脅。相比于中國專利200410092028.9所得產(chǎn)品而言，本發(fā)明納米炭避免了靜置后結塊的產(chǎn)生并具有十分良好的重分散性，十分利于實際臨床應用。

值得指出的是，本發(fā)明在解決現(xiàn)有技術存在的重分散性差的缺點之外，還解決了載藥的問題。

中國專利200510021728.3提供的技術方案雖然實現(xiàn)了載藥功能，但其成本高昂且受限于特定的抗癌藥物，更重要是的其載藥率受限于藥物與納米炭的接枝偶聯(lián)程度，無法獲得較好的載藥率。另外，在攜載如5-氟尿嘧啶這樣常用的抗腫瘤藥時，本發(fā)明納米炭的藥效可幾乎達到純藥的藥效。

如本發(fā)明的實施例所示，本發(fā)明可以獲得很好的載藥率的同時還能實現(xiàn)優(yōu)秀的緩釋效果，更重要的是，本發(fā)明在釋藥行為上還具有酸度響應性，當處于微酸環(huán)境(腫瘤區(qū)域)時，藥物釋放速度會相應加快。

通過上述說明，本領域人員不難理解，本發(fā)明實質上解決了限制納米炭淋巴示蹤劑臨床應用的技術問題。具體而言，利用本發(fā)明納米炭可以避免PVP對人體凝血功能造成影響的風險，也無需擔憂由于靜置時間久后產(chǎn)生結塊導致納米炭失去淋巴靶向功能。本發(fā)明除了保留了納米炭的淋巴示蹤功能，同時，對于無法示蹤、不易于手術切除處理(或其它處理方式)的淋巴管和淋巴結，本發(fā)明可通過攜載的藥物進行治療，無需過于擔憂癌細胞轉移和腫瘤復發(fā)。

值得指出的是，本發(fā)明無需進行一些認為是必要的環(huán)境響應性載體的有意設計，便獲得了較好的酸度響應性。另外，本發(fā)明的釋藥行為是十分良好的緩釋。本領域人員應當很容易理解，本發(fā)明上述特點可以使得本發(fā)明納米炭作為優(yōu)秀的腫瘤淋巴靶向藥物載體。然而相比于一般的淋巴示蹤制劑而言，本發(fā)明納米炭可以對容易進行手術切除的淋巴進行示蹤，也可以對不易觀察到的或手術切除的淋巴管進行藥物治療，使得腫瘤的臨床治療更為高效。

本發(fā)明所述表面羧基含量為0.10-1.00mmol/g的活性炭是由活性炭經(jīng)氧化劑氧化而得。

本發(fā)明所述氧化劑包括硝酸、雙氧水、硫酸、臭氧中的至少一種，優(yōu)選為雙氧水。

雙氧水作為氧化劑較為溫和，且后處理較為方便，更宜于本發(fā)明的實施。

優(yōu)選的，所述活性炭的表面羧基含量為0.60-1.00mmol/g。

所述氨基聚乙二醇單甲醚的分子量為500-5000Da，優(yōu)選為2000Da。

優(yōu)選的，所述接枝度為6.00-10.00％(W％)。

優(yōu)選的，所述納米炭的粒徑為250-350nm。

本發(fā)明的另一個目的在于提供利用上述本發(fā)明納米炭為藥物載體的用于淋巴示蹤和腫瘤治療的藥劑，該藥劑包括所述納米炭和抗腫瘤藥物。

所述抗腫瘤藥物包括5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5FU)、奧沙利鉑(Oxaliplatin,Oxi)、絲裂霉素C、卡波霉素、阿克拉霉素、氨甲喋呤、阿霉素、阿柔比星、紫杉醇、卡鉑中的至少一種。

所述抗腫瘤藥物為5-氟尿嘧啶和/或奧沙利鉑。

優(yōu)選的，所述抗腫瘤藥物與所述納米炭的重量比為5-20:100。

所述藥劑為藥學意義上可接受的任一劑型。

優(yōu)選的，所述藥劑的劑型為粉劑。

優(yōu)選的，所述藥劑還包括藥學意義上可用的佐劑。

本發(fā)明的另一個目的在于提供制備上述納米炭的方法，該方法包括如下步驟：

(1)將活性炭顆粒研磨至粒徑為50-500nm；

(2)利用氧化劑對步驟(1)所得物進行氧化處理，所述氧化劑為硝酸、雙氧水、硫酸、臭氧中的至少一種；

(3)將氨基聚乙二醇單甲醚通過活化脂縮合反應接枝到步驟(2)所得物上，控制接枝量為6.00-10.00％，即得。

優(yōu)選的，所述氧化劑為雙氧水，氧化處理方法為：稱取活性炭納米顆粒，先按1mL/g·活性炭納米顆粒的比例加入超純水，再在慢攪拌下，滴加1mL/g·活性炭納米顆粒的雙氧水，反應0.5h；然后升高溫度至70℃，逐滴加入4mL/g·活性炭納米顆粒的雙氧水，控制3h滴完，滴加完后再充分反應2h；最后進行抽濾，用超純水洗滌多次至pH呈中性，普通烘箱中先于60℃烘3h，再于120℃烘干至恒重。

優(yōu)選的，步驟(3)中的接枝反應為：稱取1g步驟(2)所得活性炭納米顆粒于，加入100mL超純水，在磁力攪拌下分散1h，再分別加入1.00mmol的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺和1.00mmol的N-羥基丁二酰亞胺，室溫反應1h，最后滴加入氨基聚乙二醇單甲醚水溶液，繼續(xù)常溫反應8h。

本發(fā)明的另一個目的在于提供利用上述本發(fā)明納米炭制備用于淋巴示蹤和腫瘤治療的藥劑的方法，該方法包括如下步驟：

(1)制備抗腫瘤藥物水溶液，所述抗腫瘤藥物包括5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、絲裂霉素C、卡波霉素、阿克拉霉素、氨甲喋呤、阿霉素、阿柔比星、紫杉醇、卡鉑中的至少一種；

(2)向步驟(1)所得物加入所述納米炭，進行充分的超聲震蕩處理；

(3)將步驟(2)所得物制備成藥學意義上可接受的劑型。

優(yōu)選的，超聲震蕩處理時，溫度為室溫，處理時間為180min。

優(yōu)選的，所述劑型為粉劑。

本發(fā)明的另一個目的在于提供本發(fā)明所述納米炭在制備淋巴示蹤和腫瘤治療制劑方面的用途。

本發(fā)明的另一個目的在于提供本發(fā)明所述藥劑在制備淋巴示蹤和腫瘤治療方面藥物的用途，其特征在，所述腫瘤包括胃癌、結直腸癌、乳腺癌、大腸癌或頭頸部癌。

本發(fā)明的主要有益效果：

1、本發(fā)明所得納米炭具有十分優(yōu)秀的水分散性和重分散性，克服了現(xiàn)有技術重分散性差的缺點；

2、本發(fā)明所得納米炭可作為優(yōu)秀的抗癌藥物載體，具有載藥量高、緩釋效果好和酸度相應性的優(yōu)點；

3、本發(fā)明易于實施，成本低廉；

4、本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術中納米炭在臨床應用的缺點，具有十分良好的應用前景。

附圖說明

圖1為未經(jīng)處理(左)和經(jīng)過氧化處理(右)的TEM結果圖；

圖2為不同納米炭的FTIR結果圖，其中，ACO-30％代表僅僅經(jīng)過氧化處理所得的納米炭，ACO-1PEG、ACO-2PEG和ACO-6PEG代表不同接枝度的本發(fā)明的納米炭；

圖3為不同納米炭的TGA結果圖，其中，ACO-30％代表僅僅經(jīng)過氧化處理所得的納米炭，ACO-1PEG、ACO-2PEG和ACO-6PEG代表不同接枝度的本發(fā)明的納米炭；

圖4中左圖為不同納米炭的粒徑分布結果圖，其中，ACO-30％代表僅僅經(jīng)過氧化處理所得的納米炭，ACO-1PEG、ACO-2PEG和ACO-6PEG代表不同接枝度的本發(fā)明的納米炭；右圖為本發(fā)明納米炭的TEM結果圖；

圖5為不同納米炭靜置4天后的穩(wěn)定性結果圖，其中，AC-5為未經(jīng)處理的納米炭，ACO-30％代表僅僅經(jīng)過氧化處理所得的納米炭，ACO-6PEG代表本發(fā)明的納米炭；

圖6為不同納米炭對5FU的載藥量結果圖；其中，ACO-30％代表僅僅經(jīng)過氧化處理所得的納米炭，ACO-1PEG和ACO-6PEG代表不同接枝度的本發(fā)明的納米炭；

圖7為不同納米炭對5FU的釋放結果圖，其中，ACO-30％-5FU代表僅僅經(jīng)過氧化處理所得的納米炭對5FU的釋放結果，ACO-6PEG-5FU代表本發(fā)明納米炭對5FU的釋放結果；

圖8為不同納米炭的CLSM結果圖，其中，ACO-30％代表僅僅經(jīng)過氧化處理所得的納米炭，ACO-6PEG代表本發(fā)明的納米炭；

圖9為不同納米炭包載FITC后的細胞內吞實驗結果圖，其中，ACO-30％代表僅僅經(jīng)過氧化處理所得的納米炭，ACO-6PEG代表本發(fā)明的納米炭；

圖10為不同納米炭的MTT實驗結果圖，AC-5-5FU為未經(jīng)處理的攜載5FU的納米炭，ACO-30％-5FU代表僅僅經(jīng)過氧化處理所得的攜載5FU的納米炭，ACO-6PEG-5FU代表本發(fā)明的攜載5FU的納米炭；

圖11為不同納米炭的MTT實驗結果圖，AC-5-Oxi為未經(jīng)處理的攜載Oxi的納米炭，ACO-30％-Oxi代表僅僅經(jīng)過氧化處理所得的攜載Oxi的納米炭，ACO-6PEG-Oxi代表本發(fā)明的攜載Oxi的納米炭；

圖12為本發(fā)明納米炭在不同pH下對5FU的釋放結果圖；

圖13為本發(fā)明納米炭在不同pH下對Oxi的釋放結果圖。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明進行具體描述，有必要在此指出的是以下實施例只是用于對本發(fā)明進行進一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領域的技術熟練人員根據(jù)上述發(fā)明內容所做出的一些非本質的改進和調整，仍屬于本發(fā)明的保護范圍。

實施例1

(1)原料與試劑

商業(yè)活性炭(上海海諾炭業(yè)有限公司)，常規(guī)試劑均購于海鴻實驗儀器有限公司；mPEG-NH₂(M_W 2000)購于蘇州諾德派森醫(yī)藥科技有限公司，1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺(EDC，≥99.0％)購于J&K Chemical Ltd.；N-羥基丁二酰亞胺(HOSu，≥98％)購于Alfa Aesar；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT，商品名：噻唑藍)購于Sigma；DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)高糖培養(yǎng)基購于HyClone；胎牛血清(FBS)購于HyClone；胰酶購于Gibieo；青霉素-鏈霉素雙抗試劑(100x)購于Gibico；異硫氰酸熒光素異構體(FITC，90％)購于Acros Organics；結腸癌細胞(SW480)購于四川大學華西醫(yī)學院；上皮細胞(L929)和巨噬細胞(RAW264.7)為本實驗室凍存細胞。

(2)活性炭納米顆粒的制備

制備工藝：

1)將市售活性炭混溶于無水乙醇中(約1g/5mL)；

2)將混溶液加入分散砂磨機配套的不銹鋼桶中，加入一定量的研磨珠子，在2500rpm轉速下打磨；

3)研磨一定時間(分別處理1h，3h和5h)后，停止研磨，先用200目紗布粗過濾，除去珠子，后用500目紗布過濾除去較大粒徑的活性炭顆粒；

4)將過濾后的產(chǎn)物用超純水洗滌數(shù)次，120℃烘干，即得到活性炭納米顆粒(ACNP)，分別記為AC-1h、AC-3h和AC-5h，未處理樣記為AC-0h。

動態(tài)光散射DLS的結果(表1)也近似說明了相同的結果，其數(shù)值結果為所有顆粒粒徑的統(tǒng)計結算結果，反應了整體粒徑尺寸減小，分布變窄的趨勢。這一粒徑尺寸在淋巴靶向應用的要求范圍之內(50 nm＜尺寸＜500nm)，故可以考慮用作淋巴靶向示蹤和淋巴靶向制劑的制備，后期如有需要，可進一步對其進行研磨的后續(xù)處理，使其符合使用要求，即活性炭顆粒粒徑可以通過物理研磨進行初步的調控。本文選用研磨5小時的樣品(AC-5h)做后續(xù)研究。

表1

(3)氧化活性炭納米顆粒的制備

制備方法流程：選擇粒徑參數(shù)較為合適的樣(AC-5h)進行氧化處理

1)丙酮超聲清洗殘余有機雜質：按4mL/g的比例配制活性炭納米顆粒的丙酮混溶液，室溫超聲處理3h，超聲功率為40kHZ(60％)；超聲處理后抽濾，室溫晾干，120℃烘干待進一步處理。

2)水煮沸處理：將烘干的丙酮處理過的超純水與ACNP以10mL/g的比例加入單頸瓶，磁力攪拌，煮沸(冷凝回流)2h；抽濾，120℃烘干至恒重，樣品命名為AC-5。

雙氧水氧化處理：稱取上一步處理產(chǎn)物活性炭納米顆粒一定質量于三口瓶中(分別接冷凝回流，恒壓滴液漏斗和溫度計)，先按1mL/g 的比例加入超純水，再在慢攪拌下，滴加等體積的H₂O₂氧化劑，反應0.5h；然后升高溫度至70℃，逐滴加入4體積(4mL/g)剩余的雙氧水，控制3h滴完，滴加完后再充分反應2h；最后進行抽濾，用超純水洗滌多次至pH呈中性，普通烘箱中先60℃烘3h，再120℃烘干至恒重。配制使用的不同濃度的H₂O₂氧化劑有6％、15％和30％三個體積濃度，對應氧化產(chǎn)物分別命名為ACO-6％、ACO-15％和ACO-30％。

由表2的Boehmn滴定結果可知，氧化改性后，活性炭表面羧基含量顯著的變化，隨著氧化劑濃度的提高，羧基含量明顯增大，其含量從0.10mmol/g增加到了約0.75mmol/g。本實驗中用NaOH中和的樣品抽濾較難，活性炭很容易抽濾到下層濾液中，而且濾液顏色也發(fā)生了變化，變?yōu)榘迭S色，最后鹽酸滴定終點判斷受到干擾，誤差可能較大，而NaHCO₃中和的濾液為澄清透明液。關于粒徑參數(shù)更為直觀的結果見圖1。

表2(單位：mmol/g)

(4)氧化活性炭納米顆粒接枝mPEG-NH₂

采用經(jīng)典的活化酯縮合反應，將不同投料的mPEG-NH₂接枝到表面羧基含量較高的氧化活性炭納米顆粒(ACO-30％)。接枝工藝如下：稱取1g活性炭納米顆粒于250mL單頸瓶中，加入100mL超純水，在磁力攪拌下分散1h，再分別加入EDC(1.00mmol)和HOSu(1.00mmol)，室溫反應1h，最后滴加入mPEG-NH₂水溶液，繼續(xù)常溫反應8h。反應結束后，抽濾洗滌濾渣數(shù)次，并且將濾渣再用超純水重新分散，超聲振蕩，洗去可能吸附的mPEG-NH₂，最后將濾渣溶解轉移進透析帶(截留分子量為3500)中在3L超純水中透析一周，每隔一定時間換透析用水，充分除去反應試劑和未接枝的mPEG-NH₂。透析結束后旋蒸除去大部分水分，后45℃真空干燥24h，密閉保存。樣品根據(jù)每克活性炭納米顆粒加入的mPEG-NH₂不同(0.1g，0.3g和0.6g)分別命名為ACO-1PEG，ACO-3PEG和ACO-6PEG。(5)氧化活性炭納米顆粒接枝PEG的表征

傅里葉變換紅外光譜(FTIR)

分別取微量接枝PEG的氧化活性炭納米顆粒，按1％質量比與KBr粉末混合，壓片制樣，在Nicolet-560型紅外吸收光譜分析儀上測定其透射紅外譜圖，掃描區(qū)間為4000～500cm^-1，分辨率為4cm^-1，檢測次數(shù)為32次。

熱重分析(TGA)

采用Q500型熱重分析儀(美國TA儀器公司)在氮氣環(huán)境下對測試樣品進行熱重分析，加熱范圍為50～600℃，升溫速率為20℃/min，樣品用量范圍為5～10mg。

透射電鏡(TEM)

取適量改性后活性炭納米顆粒混溶于1mL無水乙醇中，放置于超聲波振蕩器中超聲振蕩20min后用移液器吸取少量混溶液滴于鍍碳銅網(wǎng)膜上，待自然晾干，用用Hitachi model H-600-4透射電子顯微鏡直接觀察樣品顆粒大小和形態(tài)，加速電壓為75KV。

激光粒度儀(DLS)

取適量接枝PEG的氧化活性炭納米顆粒樣品，混溶于1mL超純水中，放置于超聲波振蕩器中超聲振蕩20min后，配制稀釋成合適濃度后，使用Zetasizer Nano ZS動態(tài)光散射(DLS)納米粒度儀(Malvern，UK)對于其粒徑和粒徑分布進行測定，測試溫度為25℃，散射角為90°。

(6)水分散及穩(wěn)定性研究

鑒于活性炭混溶液呈黑色，不容易觀察其分散及穩(wěn)定性情況，本文主要關注混溶液的界面(界面：上層較澄清，下層黑渾濁)，以此來考察樣品的沉降速度，近似表征其溶液穩(wěn)定性。需在較強光下觀察或透過手電筒光觀察樣品界面。

稱取樣品1mg于10mL比色管中，然后加入10mL的超純水，超聲2h使各個樣品達到完全均勻的分散。然后靜置垂直擺放，定時觀察記錄樣品混溶液界面的位置(距離上液面的距離h)。通過計算，可得到靜置不同時間后，界面下降高度百分比，即可定性作為樣品水溶液穩(wěn)定性的一個指標。計算公式為：

ν(％)＝h/H×100，式中ν表示沉降高度百分比(％)，h表示靜置一段時間后，混溶液界面離上頁面的距離，即下沉距離(單位cm)，H表示整個混溶液在比色管中的高度(單位cm)，本實驗中H＝7.40 cm。

待樣品完全沉降后，可再考察其在水溶液重新分散的能力，定性的考察主要通過振蕩或超聲等使其重新達到較好均一分散的難易程度。

(7)接枝PEG的氧化活性炭納米顆粒對藥物的包載

以超純水為溶劑分別配制一系列濃度含量的5-氟尿嘧啶溶液，待完全溶解后，分別加入改性樣品活性炭那納米顆粒，室溫下超聲振蕩180min。吸附結束后，抽濾取下層濾液，測定其中游離藥物的濃度，得到載藥量。過濾后的上層載藥活性炭納米顆粒先用超純水洗滌數(shù)次，洗去表面殘留的藥物。再在普通烘箱60℃初步干燥10min，然后轉移進真空干燥24h，溫度控制低于45℃。即得到相應的給藥制劑，干燥后密閉保存，減少活性炭吸收空氣中的水分。

(8)氧化活性炭納米顆粒接枝PEG給藥制劑的釋藥

分別精密稱取一定量的活性炭納米給藥制劑，溶于10mL配好的PB緩沖液中，迅速將溶液轉移入預先處理的透析袋中，將透析袋兩端扎緊放入預先盛有90mL PB緩沖溶液的廣口瓶中。在37℃恒溫搖床中進行藥物釋放，轉速為110rpm。定時移取釋放液，并補加相同體積的緩沖液。使用HPLC測定釋放液中藥物的濃度，從而計算得到其釋放曲線。

(9)氧化活性炭納米顆粒接枝PEG的體外細胞實驗

細胞培養(yǎng)

常規(guī)復蘇凍存的巨噬細胞、L929上皮細胞和SW480結腸癌細胞，在加入含10％(v/v)胎牛血清、1％(v/v)雙抗(青霉素和鏈霉素)的高糖DMEM培養(yǎng)基中放于37℃、5％CO₂、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。兩種細胞均為貼壁細胞，待其布滿培養(yǎng)瓶底部時以胰蛋白酶消化進行傳代培養(yǎng)。

細胞內化

將對數(shù)生長期細胞進行消化，以每孔1×10⁵個細胞的密度接種到置于6孔板的蓋玻片上，于37℃、5％CO₂及飽和濕度條件下培養(yǎng)24h至細胞形態(tài)良好。吸去孔板中的培養(yǎng)基，分別各自加入1mL FITC標記的活性炭納米顆粒(FTIC濃度約為50μg/mL)的培養(yǎng)基溶液，繼續(xù)共培養(yǎng)一定時間。除去培養(yǎng)基，用4％的多聚甲醛溶液于4℃固定30min，再用DAPI于37℃染色10min。最后使用50％甘油溶液封片，并通過CLSM觀察。

MTT實驗

將對數(shù)生長期的細胞消化，以每孔500μL、0.8×10⁴個細胞的密度接種到置于48孔板內中，置于37℃、5％CO₂、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞貼壁且形態(tài)良好。去除培養(yǎng)基，每孔加入500μL不同藥物濃度的活性炭納米給藥制劑(選用投料比為10％的相應納米給藥制劑作為實驗對象)，每個濃度設3個復孔，設置空白對照組，于37℃，5％CO₂及飽和濕度條件下共培養(yǎng)1d和3d。每孔加入40μL MTT溶液(5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)孵育4h。4h后小心吸取孔內培養(yǎng)上清液，按每孔500μL加入DMSO，于搖床低速振蕩20min。用0.22μm的有機濾頭過濾DMSO溶液，再等量吸取濾液加入96孔板中，在酶標儀(DNM-9602酶標分析儀)492nm波長下測定各孔的吸光度OD值，計算相應的細胞活性(存活率)。

結果與討論

氧化活性炭納米顆粒接枝PEG的表征

紅外光譜

在紅外譜圖中(圖2)，接枝PEG后，在2923cm^-1、2854cm^-1和1111cm^-1等處附近出現(xiàn)了較為明顯甲基、亞甲基的對稱伸縮振動和醚鍵的伸縮振動峰，1433cm^-1處附件出現(xiàn)碳氫的彎曲振動峰，而且部分峰的吸光度隨著PEG投料的增加，有一定程度的增加，定性表示了接枝PEG的成功和接枝量的不同。

熱重分析(TGA)

由TGA的結果可知(圖3)，接枝處理的樣品在PEG的分解峰附近處，TG曲線都存在明顯的突降過程。對于這一溫度范圍(300-440℃)各樣品的質量變化做近似的估算，得到對應的Δ_Weight(表3)，由表中結果可知，ACO-3PEG與ACO-6PEG的PEG接枝基本相同，約為8.00％，可能原因是接枝主要發(fā)生在活性炭納米顆粒的表面，表面羧基含量有限，接枝過程達到了飽和狀態(tài)。兩種相比于ACO-1PEG的接枝量有一定程度的提高。

表3

粒徑表征

由圖4(A)和表4可知，接枝PEG后活性炭粒徑未有明顯的變化，約在360.0nm左右，較之ACO-30％的粒徑結果略有減小，可能由于接枝后親水性增加，減小了團聚現(xiàn)象，粒徑曲線向小粒徑尺寸偏移，粒徑分布基本不變。圖4(B)為ACO-6PEG樣品的透射電鏡圖，可以看出活性炭納米顆粒的輪廓較為圓滑，接枝PEG后不能在納米顆粒邊緣看出明顯的變化，這與活性炭納米顆粒本身不規(guī)則，粒徑較大，導致透射電鏡檢測時顆粒的襯度變化不明顯，不易判斷有關。

表4

水分散及穩(wěn)定性研究

樣品的沉降速度(高度下降百分比)：直觀形象的4天沉降結果如圖5?；钚蕴考{米顆粒被較高濃度雙氧水氧化后，其沉降速度降低，水穩(wěn)定性提高?？赡苁怯捎谳^多的極性表面羧基可與水分子發(fā)生相互作用，提高了納米顆粒在水中的分散穩(wěn)定性。而當氧化活性炭納米顆粒接枝PEG后，其水穩(wěn)定性又進一步提高，這可能由于PEG溶于水中，會在顆粒表面溶解伸展形成一定的空間體積排斥，從而增加了活性炭納米顆粒在水溶液中的穩(wěn)定性，并且減少了其發(fā)生聚沉的可能性。

對完全沉降的樣品進行重新分散探究，發(fā)現(xiàn)僅氧化改性的樣品沉降后會在底部沉積結塊，簡單搖晃處理并不能有效地使底部的活性炭塊團重新分散良好，需要對其進行較長時間的超聲處理，如30min。而接枝改性后的樣品沉降后在底部不會結成團塊，稍微的振蕩搖晃即可使底部塊團分散開，僅需幾分鐘的超聲就可以重新分散良好。超聲處理后，所有樣品均表現(xiàn)出良好的復溶分散。透過燈光，ACO-6PEG、ACO-3PEG相比較其它樣品而言，分散液顏色略淺，透光性好，其次是氧化系列的樣品。

由載藥量的結果(圖6)可知，相同操作下，接枝PEG后，活性炭納米顆粒對藥物包載能力降低，且隨著接枝量的增加，載藥量進一步降低。導致載藥量降低的原因可能來源于以下幾點因素的影響：一是接枝改性后，納米顆粒中PEG分子對于吸附包載沒有什么貢獻，且導致藥物載體的比表面積的降低；二是PEG分子可能填充了一定的孔體積，而且極有可能堵塞了表面孔洞，導致藥物不能有效地進入孔隙，即不能發(fā)生吸附相互作用；三是PEG分子的阻礙作用可能導致需要更長的超聲吸附時間，讓藥物跨過阻礙，進入孔隙，達到充分的吸附作用。

由累積釋放曲線(圖7)可以很明顯地看出，ACO-30％接枝PEG后，制備的相應活性炭納米給藥制劑對于藥物的釋放有明顯的減緩效果，緩解了活性炭納米給藥制劑初期的快速釋放現(xiàn)象，釋放2d后，ACO-6PEG的累積釋放量只達到約20％左右，而ACO-30％給藥制劑的藥物累積釋放達到了50％。這種明顯的藥物緩釋來源于PEG在活性炭納米顆粒表面形成的空間保護或者堵塞載體孔洞，增加了藥物釋放的難度，釋放到環(huán)境中需要突破PEG的阻礙作用。這種接枝改性對活性炭納米顆粒作為藥物載體本身的功能緩釋性可能造成的影響有待進一步的研究。

氧化活性炭納米顆粒接枝PEG的體外細胞研究

接枝PEG對納米顆粒細胞內化的影響

由圖8可知，ACO-6PEG樣品與巨噬細胞共培養(yǎng)1h后，巨噬細胞對于納米顆粒仍具有優(yōu)異的內吞作用。另外，殘余的活性炭納米顆粒更易清洗掉。

SW480結腸癌細胞的CLSM結果(圖9)表明，接枝改性后的樣品ACO-6PEG，仍然具有腫瘤細胞附著性和很高的細胞內化性能，共培養(yǎng)1h后，細胞就有很顯著的細胞染色。

接枝PEG對給藥制劑藥效的影響

不同給藥制劑的MTT結果見圖10(5-氟尿嘧啶)和圖11(奧沙利鉑)，A圖和B圖分別表示1天和3天的藥效，接枝改性后樣品ACO-6PEG給藥制劑的體外抗腫瘤細胞療效與氧化改性樣ACO-30％給藥制劑的療效相比，未有顯著變化，共培養(yǎng)3天都有較好的抗腫瘤細胞活性。