本發(fā)明涉及靶向血管內(nèi)皮生長因子A(vascularendothelialgrowthfactor,VEGFA)基因的RNA干擾重組慢病毒載體及其構(gòu)建，屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：腫瘤血管是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的必要條件，沒有血管生成，腫瘤最大也只能長至直徑約1-2mm大小。因此研究腫瘤血管生成對了解惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性和機(jī)理及抗腫瘤血管生成質(zhì)粒有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。Folkman等依據(jù)大量的實驗證據(jù)，提出腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移都依賴于新生血管的形成。以后相繼發(fā)現(xiàn)并分離了多種促進(jìn)血管形成的調(diào)控因子。其中血管內(nèi)皮生長因子A(vascularendothelialgrowthfactor,VEGFA)及其受體能特異性的促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖和遷移，在腫瘤新生血管生成過程中起著至關(guān)重要的作用。已有研究結(jié)果證實VEGFA與肺癌的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，阻止或抑制VEGFA在腫瘤組織中的表達(dá)可能是抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移有重要作用。RNA干擾技術(shù)能特異性降解mRNA，沉默靶基因，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因的表達(dá)，從而可用來進(jìn)行基因功能的研究和藥物靶標(biāo)的研究。目前通過siRNA誘導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞內(nèi)RNA干擾的操作方法有兩種，分別為化學(xué)合成的siRNA和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的siRNA?；瘜W(xué)合成法人工制備siRNA，一般是分別合成21個堿基的正義鏈和反義鏈，體外適當(dāng)?shù)臏囟认率够パa鏈配對，形成siRNA。然后，采用傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染的方法，如Lipofectamine轉(zhuǎn)染、磷酸鈣、電打孔等將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞，誘導(dǎo)RNA干擾。此方法操作簡單、快速，但引起的RNA干擾效應(yīng)往往是暫時的，難以持久。因此，目前更傾向于在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA，以維持長久的RNA干擾效應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)表達(dá)法是將表達(dá)siRNA的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA。慢病毒載體作為常用的病毒載體之一，其特點是免疫原性低，能感染分裂相和非分裂相細(xì)胞，能自身攜帶片段整合入宿主細(xì)胞基因組，并在哺乳動物各類細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)siRNA，長期抑制基因表達(dá)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種靶向VEGFA基因的RNA干擾重組病毒載體構(gòu)建、篩選及其用途。本發(fā)明以RNA干擾技術(shù)為主，針對VEGFA基因的不同靶序列，構(gòu)建了四個能在293T細(xì)胞中表達(dá)siRNA的慢病毒真核表達(dá)載體pLv-VEGFAshRNA，該載體是自身失活的慢病毒載體，其示意圖譜見圖1，能特異性的抑制VEGFA基因表達(dá)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種靶向VEGFA基因的siRNA重組慢病毒表達(dá)載體，是用于腫瘤VEGFA基因相關(guān)性治療性物質(zhì)，慢病毒是由pLv-VEGFAshRNA、pMD2.G和pSPAX2載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培養(yǎng)獲得；其中，所述的pLv-VEGFAshRNA重組載體是在plv-shRNA載體的多克隆位點中連接雙鏈DNA片段構(gòu)建而得，酶切位點是BamHI和EcoRI，所述的雙鏈DNA片段為以下序列中的一種：(1)VEGFA-homo-U1寡核苷酸序列1:正義鏈:5’GATCCAGGGCAGAATCATCACGAAGTCTCGAGACTTCGTGATGATTCTGCCCTTTTTTG3’反義鏈:5’AATTCAAAAAAGGGCAGAATCATCACGAAGTCTCGAGACTTCGTGATGATTCTGCCCTG3’(2)VEGFA-homo-U2寡核苷酸序列2:正義鏈:5’GATCCGCGCAAGAAATCCCGGTATAACTCGAGTTATACCGGGATTTCTTGCGCTTTTTG3’反義鏈:5’AATTCAAAAAGCGCAAGAAATCCCGGTATAACTCGAGTTATACCGGGATTTCTTGCGCG3’(3)VEGFA-homo-U3寡核苷酸序列3:正義鏈:5’GATCCCGAACGTACTTGCAGATGTGACTCGAGTCACATCTGCAAGTACGTTCGTTTTTG3’反義鏈:5’AATTCAAAAACGAACGTACTTGCAGATGTGACTCGAGTCACATCTGCAAGTACGTTCGG3’(4)VEGFA-homo-U4寡核苷酸序列4:正義鏈:5’GATCCGATAGAGCAAGACAAGAAACTCGAGTTTCTTGTCTTGCTCTATCTTTTTG3’反義鏈:5’AATTCAAAAAGATAGAGCAAGACAAGAAACTCGAGTTTCTTGTCTTGCTCTATCG3’根據(jù)本發(fā)明，所述的靶向VEGFA基因的siRNA重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括步驟如下：a.根據(jù)VEGFAmRNA序列，設(shè)計合成雙鏈DNA片段，所述的雙鏈DNA片段為所述的VEGFA-homo-U1、VEGFA-homo-U2、VEGFA-homo-U3及VEGFA-homo-U4核酸序列中的一種；b.然后將所述的雙鏈DNA片段連接到plv-shRNA載體的多克隆位點中構(gòu)建成pLv-VEGFAshRNA重組載體；c.再將所述的pLv-VEGFAshRNA重組載體與pMD2.G和pSPAX2載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培養(yǎng)，得靶向VEGFA基因RNA干擾的重組慢病毒載體系統(tǒng)。為了對靶向VEGFA基因RNA干擾的重組慢病毒載體對VEGFA基因的抑制效果進(jìn)行鑒定，將pLv-VEGFAshRNA與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后進(jìn)行熒光定量PCR檢測目的基因表達(dá)水平，篩選出有效干擾質(zhì)粒。附圖說明圖1為實施例中慢病毒表達(dá)載體plv-shRNA結(jié)果示意圖。圖2VEGFA干擾RNA慢病毒載體瞬轉(zhuǎn)293T細(xì)胞48h圖片(熒光、可見光)。其中(a)為普通光鏡(100×)；(b)為熒光光鏡(100×)。圖3不同干擾序列下的VEGFA表達(dá)水平。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。主要材料：293T細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；大腸桿菌感受態(tài)DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；慢病毒載體plv-shRNA購自Clontech公司，含有人U6啟動子，編碼綠色熒光蛋白報告基因；各種限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶及TaqDNA聚合酶均為美國NEB公司產(chǎn)品；SYBRGreenIqRT-PCRMixs購與上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司；胎牛血清及DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibico公司。實施例1靶向VEGFA基因的慢病毒載體構(gòu)建1.寡聚核酸的設(shè)計與合成設(shè)計靶向VEGFA基因（NM_001025366.2）的4個干擾序列（表1），并合成相應(yīng)的單鏈DNA表1靶向VEGFA基因RNA干擾序列序列名稱序列信息起始位置U1AGGGCAGAATCATCACGAAGT639U2GCGCAAGAAATCCCGGTATAA1002U3CGAACGTACTTGCAGATGTGA1203U4GATAGAGCAAGACAAGAAA943shRNA寡核苷酸的3’末端是TTTTT，作為RNA聚合酶Ⅲ型啟動子U6的終止信號，其5’和3’末端分別是BamHI和EcoRI的限制性酶切位點，plv-shRNA模板中的loop結(jié)構(gòu)選用了CTCGAG。各自單鏈DNA合成片段如下：(1)VEGFA-homo-U1寡核苷酸序列1:正義鏈:5’GATCCAGGGCAGAATCATCACGAAGTCTCGAGACTTCGTGATGATTCTGCCCTTTTTTG3’反義鏈:5’AATTCAAAAAAGGGCAGAATCATCACGAAGTCTCGAGACTTCGTGATGATTCTGCCCTG3’(2)VEGFA-homo-U2寡核苷酸序列2:正義鏈:5’GATCCGCGCAAGAAATCCCGGTATAACTCGAGTTATACCGGGATTTCTTGCGCTTTTTG3’反義鏈:5’AATTCAAAAAGCGCAAGAAATCCCGGTATAACTCGAGTTATACCGGGATTTCTTGCGCG3’(3)VEGFA-homo-U3寡核苷酸序列3:正義鏈:5’GATCCCGAACGTACTTGCAGATGTGACTCGAGTCACATCTGCAAGTACGTTCGTTTTTG3’反義鏈:5’AATTCAAAAACGAACGTACTTGCAGATGTGACTCGAGTCACATCTGCAAGTACGTTCGG3’(4)VEGFA-homo-U4寡核苷酸序列4:正義鏈:5’GATCCGATAGAGCAAGACAAGAAACTCGAGTTTCTTGTCTTGCTCTATCTTTTTG3’反義鏈:5’AATTCAAAAAGATAGAGCAAGACAAGAAACTCGAGTTTCTTGTCTTGCTCTATCG3’2.寡聚核酸退火將合成的寡聚核酸分別用無酶水溶解，濃度為20μM。取相應(yīng)正義鏈和反義鏈溶液，按照如下配比配制退火反應(yīng)體系組分體積（μL）退火緩沖液5正義鏈（20μM）5反義鏈（20μM）5水至終體積50在PCR儀上按照如下程序進(jìn)行退火處理：95℃5min;85℃5min;75℃5min;70℃5min;4℃保存。3.pl-shRNA載體線性化取2μgplv-shRNA載體，按照如下體系進(jìn)行酶切處理：組分體積（μL）10×緩沖液5BamHI1EcoRI1水至終體積5037℃酶切1小時，1.5%瓊脂糖電泳，使用DNA純化試劑盒回收，核酸蛋白濃度測定儀測定回收質(zhì)量。4.plv-VEGFA-shRNA載體的構(gòu)建利用T4DNA連接酶，按照如下體系進(jìn)行載體連接反應(yīng)：組分體積（μL）10×T4連接緩沖液2載體回收2shDNA2T4DNA連接酶1水至終體積2020℃連接過夜，轉(zhuǎn)化質(zhì)大抽桿菌感受態(tài)DH5α，挑選陽性克隆送去測序。本步驟得到的產(chǎn)物是plv-VEGFA-shRNA。實施例2RNA干擾慢病毒質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)293T細(xì)胞將4種干擾慢病毒質(zhì)粒，采用瞬時轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。293T細(xì)胞采用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1天消化293T細(xì)胞，計數(shù)，將細(xì)胞接種至35mm培養(yǎng)皿內(nèi)，每個培養(yǎng)皿接種6×105個細(xì)胞；次日用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基分別配制鈣轉(zhuǎn)試劑和RNA干擾質(zhì)粒，每84μl培養(yǎng)基內(nèi)加入16μl鈣轉(zhuǎn)試劑，每100μl培養(yǎng)基內(nèi)加入4μg質(zhì)粒，分別混勻后將鈣轉(zhuǎn)溶液和質(zhì)粒溶液輕輕混勻，室溫靜置10分鐘，逐滴加入培養(yǎng)皿內(nèi)，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，更換新鮮的含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA。實施例31.總RNA的提取、cDNA的合成及RNA干擾效應(yīng)的RT-PCR檢測分別取1μgRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，采用熒光定量PCR法檢測VEGFA的表達(dá)水平，以beta-actin作為內(nèi)參，熒光定量PCR所采用的引物序列見表2，采用2-△△CT相對定量方法計算不同RNA干擾序列樣品的VEGFA表達(dá)水平。篩選出表達(dá)水平最低的RNA干擾序列。檢測結(jié)果（見圖3）表明U4序列的VEGFA基因表達(dá)水平最低，說明U4序列的RNA干擾效果最好。2.VEGFA和beta-actin引物探針設(shè)計引物名稱序列F-VEGFACTGGAGCGTGTACGTTGGTGCR-VEGFAGTTCGTTTAACTCAAGCTGCCTCF-actinbTATCGCCGCGCTCGTCGTCR-actinbTCTTGCTCTGGGCCTCGTCSEQUENCELISTING<110>同濟(jì)大學(xué)蘇州研究院<120>靶向VEGFA基因RNA干擾重組慢病毒載體及其構(gòu)建方法<130>2016<160>8<170>PatentInversion3.5<210>1<211>59<212>DNA<213>人工合成<400>1gatccagggcagaatcatcacgaagtctcgagacttcgtgatgattctgcccttttttg59<210>2<211>59<212>DNA<213>人工合成<400>2aattcaaaaaagggcagaatcatcacgaagtctcgagacttcgtgatgattctgccctg59<210>3<211>59<212>DNA<213>人工合成<400>3gatccgcgcaagaaatcccggtataactcgagttataccgggatttcttgcgctttttg59<210>4<211>59<212>DNA<213>人工合成<400>4aattcaaaaagcgcaagaaatcccggtataactcgagttataccgggatttcttgcgcg59<210>5<211>59<212>DNA<213>人工合成<400>5gatcccgaacgtacttgcagatgtgactcgagtcacatctgcaagtacgttcgtttttg59<210>6<211>59<212>DNA<213>人工合成<400>6aattcaaaaacgaacgtacttgcagatgtgactcgagtcacatctgcaagtacgttcgg59<210>7<211>55<212>DNA<213>人工合成<400>7gatccgatagagcaagacaagaaactcgagtttcttgtcttgctctatctttttg55<210>8<211>55<212>DNA<213>人工合成<400>8aattcaaaaagatagagcaagacaagaaactcgagtttcttgtcttgctctatcg55當(dāng)前第1頁1 2 3