本發(fā)明屬于疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種利用基因工程方法構(gòu)建和制備Ad5-M2m重組腺病毒作為通用流感疫苗毒種的方法。

背景技術(shù)：

目前，流感的防疫主要使用流感疫苗，禽用流感疫苗主要是全病毒滅活疫苗，該疫苗安全且耐受性好，能夠誘導較高的體液免疫反應，但是不能誘導有效的細胞免疫應答和粘膜免疫應答，并且在接種過程中不良反應發(fā)生率也較高，影響禽類產(chǎn)蛋率及肉質(zhì)；同時，由于禽流感病毒的不斷變異重組，滅活疫苗不能交叉保護同一亞型不同分支也是常有的現(xiàn)象，使得疫苗的更新速度跟不上病毒的變異速度。

流感病毒囊膜表面的三個抗原蛋白中，M2蛋白相對保守，膜外19AA高度保守，可作為通用流感疫苗的候選抗原，A型流感病毒基因組第7節(jié)段編碼的離子通道蛋白M2是由97個氨基酸組成的跨膜蛋白，形成同源四聚體離子通道，包括：細胞外氨基端(24個氨基酸殘基)、跨膜區(qū)(25-43氨基酸殘基)以及位于細胞內(nèi)的羧基端(54個氨基酸殘基)，屬于典型的III型整合膜蛋白；在流感病毒的生活周期中，當流感病毒被細胞內(nèi)吞后，內(nèi)涵體中pH下降使M2離子通道打開，氫離子流入病毒顆粒中，病毒顆粒中pH值下降，促使病毒脫殼，同時低pH是流感病毒發(fā)生構(gòu)象變化并實現(xiàn)膜融合的關(guān)鍵，M2蛋白具有T/B細胞抗原表位，且具有較好的保守性，尤其是M2蛋白23個氨基酸的胞外段序列在A型流感病毒不同亞型間高度保守，是很好的通用疫苗和被動免疫治療的靶點。

重組腺病毒疫苗的制備過程不需要雞胚，收獲后疫苗制備工藝也相對簡單，且重組腺病毒疫苗在哺乳動物及雞、豬、犬、小鼠等體內(nèi)能有效地誘導體液免疫應答和細胞免疫應答，并且對多種病原體都起到免疫保護作用，所有的腺病毒載體疫苗中又以復制缺陷型5型腺病毒載體最為成熟。

基于上述原因，若能利用基因工程方法構(gòu)建和制備Ad5-M2m重組腺病毒作為通用流感疫苗毒種，則會極大的提高疫苗接種效果。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種Ad5-M2m作為通用流感疫苗毒種的構(gòu)建與制備方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種Ad5-M2m作為通用流感疫苗毒種的構(gòu)建與制備方法，通過對流感病毒保守抗原M2的修飾、串聯(lián)與優(yōu)化，以及構(gòu)建Ad5-M2m實現(xiàn)，包括以下步驟：

1)流感病毒主要保守性免疫原M2的修飾、串聯(lián)與優(yōu)化：

對來自于H1N1、H3N2、H5N1亞型流感病毒的M2全長序列進行比較分析和抗原位點預測分析，位點的改造與修飾，經(jīng)過串聯(lián)和密碼子優(yōu)化后，形成串聯(lián)的M2m基因，交由試劑公司合成基因序列，通過基因重組技術(shù)構(gòu)建攜帶串聯(lián)M2m基因的重組腺病毒Ad5-M2m；然后通過PCR、測序方法，確定Ad5-M2m構(gòu)建成功與否；

2)Ad5-M2m的構(gòu)建：

設(shè)計酶切位點，在5’端引入Kpn I酶切位點，在3’端引入Xho I酶切位點，PCR擴增出M2m片段、1％瓊脂糖凝膠電泳回收后，用Kpn I和Xho I進行酶切，與pGA1載體連接后轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)，質(zhì)粒小量擴增，PCR鑒定，測序正確后用BstZ17I和SgrA I酶切，并與pAd5進行連接轉(zhuǎn)化，最后用Pac I酶切線性化重組腺病毒質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至293細胞中，拯救成功后進行擴增，標記為：Ad5-M2m；

3)Ad5-M2m毒種的拯救：

酶切線性化重組腺病毒質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染至293細胞，定期觀察有無細胞病變出現(xiàn)，在10±2天收集原代病毒液，反復凍融后傳代；第2代以后的重組腺病毒感染293細胞后出現(xiàn)明顯的病變，具體為細胞皺縮、變圓、脫落和死亡；傳第3代病毒液感染293細胞，48h后收集細胞，經(jīng)Western Blot鑒定M2m是否正確表達，建立Ad5-M2m重組腺病毒作為通用流感疫苗的毒種；

4)Ad5-M2m毒種的鑒定與培養(yǎng)：

向細胞培養(yǎng)瓶中加入293細胞進行培養(yǎng)，將細胞裂解液上清加入DMEM混勻，從培養(yǎng)瓶中移去培養(yǎng)液，加入混合液感染細胞，十字形緩慢晃動3次，混勻，37℃培養(yǎng)60-120min，加入DMEM，再培養(yǎng)48-72h；進行MOI測定以測算病毒滴度；收集病毒顆粒的方法為，先收集被感染細胞，然后重懸在DMEM中，-20℃/37℃反復凍融3次，離心沉淀細胞碎片；病毒顆粒收集完成后進行病毒滴度測定或者病毒純化；

5)Ad5-M2m病毒的純化：

用標準的氯化銫密度梯度離心法純化病毒顆粒；

6)Ad5-M2m半成品的配制：

根據(jù)所配制的半成品總量計算原液用量，用專用稀釋液進行稀釋，使Ad5-M2m達到10¹⁰vp/mL，即配制成Ad5-M2m通用流感疫苗的半成品。

作為本發(fā)明進一步的方案：所述步驟1)中，密碼子優(yōu)化為選用真核細胞偏好的密碼子。

作為本發(fā)明再進一步的方案：所述步驟4)中，Ad5-M2m毒種擴大培養(yǎng)后，獲得攜帶流感病毒串聯(lián)M2m基因的復制缺陷型重組腺病毒，該重組腺病毒接種機體后只轉(zhuǎn)錄翻譯表達M2m蛋白及腺病毒蛋白，不具有核酸成分，不會復制產(chǎn)生下一代子病毒。

作為本發(fā)明再進一步的方案：所述步驟5)中，原液中Ad5-M2m重組腺病毒病毒顆粒達到10¹²vp/mL，原液稀釋100倍后配制成Ad5-M2m通用流感疫苗的半成品，用于豬、禽等流感的防疫防控工作。作為本發(fā)明進一步的方案：

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明采用技術(shù)成熟的復制缺陷型5型腺病毒載體，攜帶流感病毒保守性蛋白M2作為主要免疫原，并將多個流感亞型的M2全長基因進行串聯(lián)、密碼子優(yōu)化和抗原位點優(yōu)化，使得其所攜帶的M2m具備表達量高、免疫原性良好等優(yōu)點，可作為通用流感疫苗毒種或輔助疫苗毒種之一；Ad5-M2m毒種攜帶有多個流感病毒具有免疫原性(T/B細胞表位)的高度保守性蛋白M2，形成Ad5-M2m作為原始毒種，該毒種能在293細胞上高效增殖，收獲的病毒以T101稀釋后，以10¹⁰vp/只的Ad5-M2m初步肌肉注射免疫小鼠28天后，檢測抗體和T細胞反應，能100％保護10MLD50的攻擊；依據(jù)本發(fā)明方法制備的Ad5-M2m重組腺病毒作為通用流感疫苗毒種，具有抗原譜廣、質(zhì)量穩(wěn)定、純度高、安全性好、成本低等方面優(yōu)點，適合于大規(guī)模生產(chǎn)，具有較大的應用價值。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中M2m 573AA串聯(lián)設(shè)計示意圖。

圖2為Western Blot鑒定圖。

圖3為小鼠血清抗體滴度圖。

圖4為小鼠感染后死亡情況曲線表。

圖5為小鼠感染后體重變化情況曲線表。

其中，圖3中，A：Ad5-H5M2(1×10⁹vp)一免；B：Ad5-M2m(1×10⁹vp)一免；C：Ad5-H1M2(1×10⁹vp)一免；D：Ad5(1×10⁹vp)一免；E：Ad5-M2m(1×10⁹vp)二免；圖4和圖5中，○：Ad5-H5M2(1×10⁹vp)一免；□Ad5-M2m(1×10⁹vp)一免；△：Ad5-H1M2(1×10⁹vp)一免；Ad5(1×10⁹vp)一免；◇Ad5-M2m(1×10⁹vp)二免。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本專利的技術(shù)方案作進一步詳細地說明。

請參閱圖1-5，一種Ad5-M2m作為通用流感疫苗毒種的構(gòu)建與制備方法，通過對流感病毒保守抗原M2的修飾、串聯(lián)與優(yōu)化，以及構(gòu)建Ad5-M2m實現(xiàn)，包括以下步驟：

1)流感病毒主要保守性免疫原M2的修飾、串聯(lián)與優(yōu)化：

對來自于H1N1、H3N2、H5N1亞型流感病毒的M2全長序列進行比較分析和抗原位點預測分析，位點的改造與修飾，經(jīng)過串聯(lián)和密碼子優(yōu)化后，形成串聯(lián)的M2m基因，交由試劑公司合成基因序列，通過基因重組技術(shù)構(gòu)建攜帶串聯(lián)M2m基因的重組腺病毒Ad5-M2m；然后通過PCR、測序方法，確定Ad5-M2m構(gòu)建成功與否；

其中，M2基因序列如下：

1.1)H5M2gene from influenza A virus(A/Ck/Thailand/1/2004(H5N1))Sequence ID：gb|AAT70512.1|

MSLLTEVETPTRNEWECRCSDSSDPIVVAANIIGILHLILWILDRLFFKCIYRRLKYGLKRGPATAGVPESMREEYRQEQQSAVDVDDGHFVNIELE

1.2)H3M2gene from Influenza A virus(A/Udorn/307/1972(H3N2))Sequence ID：sp|P63231.1|

MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDPLVVAASIIGILHLILWILDRLFFKCIYRFFEHGLKRGPSTEGVPESMREEYRKEQQSAVDADDSHFVSIELE

1.3)H1M2gene from Influenza A virus(A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1))Sequence ID：gb|AAM75162.1|

MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDPLAIAANIIGILHLTLWILDRLFFKCIYRRFKYGLKGGPSTEGVPKSMREEYRKEQQSAVDADDGHFVSIELE

2)Ad5-M2m的構(gòu)建：

設(shè)計酶切位點，在5’端引入Kpn I酶切位點，在3’端引入Xho I酶切位點，PCR擴增出M2m片段、1％瓊脂糖凝膠電泳回收后，用Kpn I和Xho I進行酶切，與pGA1載體連接后轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)，質(zhì)粒小量擴增，PCR鑒定，測序正確后用BstZ17I和SgrA I酶切，并與pAd5進行連接轉(zhuǎn)化，最后用Pac I酶切線性化重組腺病毒質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至293細胞中，拯救成功后進行擴增，標記為：Ad5-M2m；

其中5’端的Kpn I酶切位點為：GGGTACCCATGAGTCTTCTAACC；

3’端的Xho I酶切位點為：CCTCGAGGTTACTCCAGCTCTAT；

3)Ad5-M2m毒種的拯救：

酶切線性化重組腺病毒質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染至293細胞，定期觀察有無細胞病變出現(xiàn)，在10±2天收集原代病毒液，反復凍融后傳代；第2代以后的重組腺病毒感染293細胞后出現(xiàn)明顯的病變，具體為細胞皺縮、變圓、脫落和死亡；傳第3代病毒液感染293細胞，48h后收集細胞，經(jīng)Western Blot鑒定M2m是否正確表達，建立Ad5-M2m重組腺病毒作為通用流感疫苗的毒種；

用10⁶的293細胞培養(yǎng)200vp各Ad5重組腺病毒，包括：Ad5-H5M2、Ad5-H3M2、Ad5-H1M2、Ad5-M2m，用1％細胞沉淀進行15％的SDS-PAGE，轉(zhuǎn)PVDF膜(6v，60min)，5％脫脂奶封閉后，分別用14C2單抗(1∶5000)孵育90min，洗脫，二抗(羊抗鼠1∶10000)孵育后顯色曝光；另外分別用β-actin單抗(1∶5000)孵育90min，二抗(羊抗鼠1∶10000)孵育后顯色曝光；如圖2顯示為：Ad5-H5M2、Ad5-H3M2、Ad5-H1M2、Ad5-M2m、及Ad5-M2m重復樣的M2對應表達及表達量區(qū)別，陽性對照為表達M2的穩(wěn)定細胞表達株；從圖2中可以看出，兩個Ad5-M2m樣要比其它的樣特異性高、表達量也高；

4)Ad5-M2m毒種的鑒定與培養(yǎng)：

在175cm²培養(yǎng)瓶中，每瓶各加入10⁷的293細胞進行培養(yǎng)；將45mL細胞裂解液上清加入105mL的DMEM混勻，從培養(yǎng)瓶中移去培養(yǎng)液，加入5mL混合液感染細胞，十字形緩慢晃動3次混勻，37℃培養(yǎng)90min；此時MOI值約為25；加入DMEM至30mL/瓶，再培養(yǎng)60h，經(jīng)測定，此時約有3×10¹¹-3×10¹²個病毒顆粒，收集被感染細胞，然后重懸在5mL的DMEM中，-20℃/37℃反復凍融3次，離心沉淀細胞碎片；經(jīng)測定，此時5mL的DMEM中約有3×10¹¹-3×10¹²個病毒顆粒，濃度為6×10¹⁰-6×10¹¹vp/mL，然后再進行病毒滴度測定或者病毒純化；試驗顯示：在10⁹的293細胞中擴增病毒可獲得大量病毒保存液；

5)Ad5-M2m病毒的純化：

用標準的氯化銫密度梯度離心法純化病毒顆粒，以10000g/min的速度離心4h；

6)Ad5-M2m半成品的配制：

根據(jù)所配制的半成品總量計算原液用量，用腺病毒專用稀釋液T101進行稀釋，使Ad5-M2m重組腺病毒病毒顆粒達到10¹⁰vp/mL，即配制成Ad5-M2m通用流感疫苗的半成品；

7)將上述制得的Ad5-M2m重組腺病毒，通過肌肉注射的方式接種于4W的SPF級BALB/c雌鼠，于免疫后28天采血，檢測血清中流感病毒M2的抗體滴度。結(jié)果如圖3所示，經(jīng)ELISA檢測結(jié)果比較分析，一免以Ad5-M2m最高，而且Ad5-M2m二免的抗體效價明細高于Ad5-M2m一免；

8)于免疫28天采血后，滴鼻感染10MLD50流感毒株(鼠肺適應株P(guān)R8株，標準毒株，1MLD50＝80-10PFU)，感染后到感染后15天每天記錄死亡情況和稱體重，死亡情況如圖4及表1所示，體重變化情況如圖5及表2所示：

表1 小鼠感染后死亡情況

從附圖4和表1中可以看出，Ad5-M2m(1×10⁹vp)一免組和Ad5-M2m(1×10⁹vp)二免組存活率達到100％，明顯優(yōu)于其他對照組，特別是優(yōu)于空白對照組的Ad5(1×10⁹vp)一免組，Ad5(1×10⁹vp)一免組感染6天后，存活率僅有25％。

表2 小鼠感染后體重變化情況

由圖5和表2中可以看出，Ad5-M2m(1×10⁹vp)二免組明顯優(yōu)于其他組，Ad5-M2m(1×10⁹vp)一免組也比較優(yōu)良，說明病毒的入侵對機體的影響比較??；其他對照組體重率波動比較大，特別是空白對照組的Ad5(1×10⁹vp)一免組，說明病毒的入侵對機體的影響比較大。

上面對本專利的較佳實施方式作了詳細說明，但是本專利并不限于上述實施方式，在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識范圍內(nèi)，還可以在不脫離本專利宗旨的前提下做出各種變化。