本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化方法，特別是涉及一種通過(guò)大豆未成熟胚作為外植體，進(jìn)行真空輔助農(nóng)桿菌侵染，誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性的大豆愈傷組織，進(jìn)而通過(guò)分化培養(yǎng)，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因大豆植株的方法。

背景技術(shù)：

大豆屬一年生豆科草本植物，是世界上食用油和植物蛋白的重要來(lái)源，中國(guó)擁有悠久的大豆種植歷史。通過(guò)分子育種及轉(zhuǎn)基因手段來(lái)改良大豆種質(zhì)資源目前已成了大豆育種的趨勢(shì)。目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)已廣泛應(yīng)用到大豆生物技術(shù)育種和基因功能鑒定領(lǐng)域，基因轉(zhuǎn)化的主要手段有農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、基因槍轉(zhuǎn)化方法和花粉管通道法，其中常用的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，通常的做法是利用大豆子葉節(jié)外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化操作，這種方法嵌合體多，轉(zhuǎn)化效率低，工作量大。利用大豆未成熟胚進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化操作雖然也有報(bào)道(錢雪艷，郭東全，楊向東，等.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(2)：658-661)，但是這種方法轉(zhuǎn)化周期長(zhǎng)，工作量大，轉(zhuǎn)化效率低，轉(zhuǎn)化體少。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于開發(fā)一種新的大豆遺傳轉(zhuǎn)化方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供了一種真空輔助農(nóng)肝菌侵染的大豆遺傳轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明將大豆未成熟胚作為外植體，用農(nóng)桿菌真空輔助侵染，共培養(yǎng)基培養(yǎng),除菌培養(yǎng)基清洗后轉(zhuǎn)移至含有篩選劑的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，形成抗性的愈傷組織。再誘導(dǎo)分化成抗性苗，生根后進(jìn)行煉苗和移栽，較快地獲得大量的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，遺傳轉(zhuǎn)化率高，周期短，能夠快速地獲得大量的轉(zhuǎn)基因植株。

本發(fā)明提供一種真空輔助農(nóng)桿菌侵染的大豆遺傳轉(zhuǎn)化方法，在一個(gè)具體實(shí)施方式中，包括以下步驟：

1)獲得大豆未成熟胚；

2)利用農(nóng)桿菌侵染，真空輔助轉(zhuǎn)化步驟1)中所獲得的未成熟胚后將其轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)基培養(yǎng)；

3)利用除菌培養(yǎng)基清洗步驟2)中產(chǎn)生的未成熟胚，清洗后未成熟胚轉(zhuǎn)移至含篩選劑的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)，產(chǎn)生抗性愈傷組織；

4)利用含篩選劑的分化培養(yǎng)基對(duì)步驟3)中產(chǎn)生的抗性愈傷組織進(jìn)行分化形成誘導(dǎo)芽，通過(guò)繼代和生根培養(yǎng)獲得再生苗；

5)對(duì)步驟4)獲得的再生苗進(jìn)行煉苗和移栽，收獲轉(zhuǎn)基因植株的種子。

進(jìn)一步地，未成熟胚是大豆開花25-30天的未成熟種子，去掉種皮和胚芽后獲得的未成熟胚，長(zhǎng)度3-6mm。優(yōu)選地，挑選無(wú)病蟲害大豆嫰莢，用自來(lái)水沖洗10-30分鐘后，75％乙醇消毒1分鐘，然后用無(wú)菌水沖洗3-5次。在無(wú)菌臺(tái)內(nèi)剝開莢皮，用鑷子取出未成熟種子。優(yōu)選地，未成熟種子長(zhǎng)度為4mm。

進(jìn)一步地，在上述未成熟胚背面劃6-9刀，深度0.3-0.6mm，長(zhǎng)度1-3mm。優(yōu)選地，深度約為0.5mm，長(zhǎng)度約為2mm。

進(jìn)一步地，步驟2)中農(nóng)桿菌的侵染濃度為OD₆₀₀＝0.1-0.3。

進(jìn)一步地，真空輔助轉(zhuǎn)化的程序?yàn)椋撼檎婵?，?.1Mpa壓強(qiáng)維持5-10分鐘，然后緩慢釋放，在溫度25℃的搖床上侵染20-40分鐘。優(yōu)選地，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的新鮮菌液5000rpm室溫離心10分鐘后，加入侵染培養(yǎng)基重懸至OD₆₀₀＝0.1-0.3。優(yōu)選地，農(nóng)桿菌加入侵染培養(yǎng)基重懸至OD₆₀₀＝0.1。優(yōu)選地，搖床上侵染30分鐘。將轉(zhuǎn)化后的未成熟胚轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)1-2天。

進(jìn)一步地，在步驟3)中，未成熟胚在無(wú)菌的條件下用除菌培養(yǎng)基中洗3-5次，放到濾紙上瀝干。在含篩選劑的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)未成熟胚2周。

進(jìn)一步地，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的篩選劑濃度為8mg/L。

進(jìn)一步地，分化培養(yǎng)基中的篩選劑濃度為4mg/L。

進(jìn)一步地，步驟4)中，當(dāng)誘導(dǎo)芽長(zhǎng)到2-3cm時(shí)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每?jī)芍芾^代一次，直至根長(zhǎng)2-3cm，獲得再生苗。

進(jìn)一步地，再生苗煉苗3-5天，然后移栽到滅菌過(guò)的含珍珠巖的土壤中，保持濕潤(rùn)狀態(tài)，其中珍珠巖：土壤＝1:3，初期光照18h/天，溫度25-30℃培養(yǎng)，待植株高度為35-45cm時(shí)，光照變?yōu)?1h/天，以促進(jìn)其開花。

優(yōu)選地，本發(fā)明中的大豆選自：天隆1號(hào)，william 82或Jack。

進(jìn)一步地，所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基為：1/10×MS鹽、1/10×B5維生素、3％蔗糖、3.9g/L MES、0.04g/L乙酰丁香酮、400mg\L L-半胱氨酸、154mg/L二硫蘇糖醇、瓊脂7g/L，pH值為5.4；

所述除菌培養(yǎng)基為：1×MS鹽、1×B5維生素、3％蔗糖、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀和50mg/L萬(wàn)古霉素，pH值為7.0；

所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：1×MS鹽、1×B5維生素、3％蔗糖、5mg/L 2,4-D、8mg/L篩選劑、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀和50mg/L萬(wàn)古霉素、植物凝膠3g/L，pH值為5.7；

所述分化培養(yǎng)基為：1×MS鹽、1×B5維生素、6％的麥芽糖、4mg/L篩選劑、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀、50mg/L萬(wàn)古霉素和0.3％植物凝膠，pH值為5.7。

本發(fā)明中直接使用大豆未成熟胚進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，較常規(guī)遺傳轉(zhuǎn)化方法，減少了大豆種子培養(yǎng)的過(guò)程，縮短了以往大豆未成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化的周期；通過(guò)真空輔助可以在大豆未成熟胚上制造許多微小的創(chuàng)口，提高農(nóng)桿菌侵染效率；擴(kuò)繁未成熟胚轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的愈傷組織，不需要加代，當(dāng)代就能獲得大量的轉(zhuǎn)基因植株；同時(shí)該方法產(chǎn)生的嵌合體少，基因轉(zhuǎn)化快速，轉(zhuǎn)化后代遺傳穩(wěn)定，基因組中只有一個(gè)整合位點(diǎn)，單拷貝比例高。

以下將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的構(gòu)思、具體步驟及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說(shuō)明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

(1)挑選天隆1號(hào)開花后25-30天無(wú)病蟲害大豆嫰莢，用自來(lái)水沖洗15分鐘后，75％乙醇消毒1分鐘，然后用無(wú)菌水沖洗3次。在無(wú)菌臺(tái)內(nèi)剝開莢皮，用鑷子取出未成熟種子，剝?nèi)?片未成熟胚，在未成熟胚背面劃7刀，深度0.5mm左右，長(zhǎng)度2mm左右。

(2)侵染轉(zhuǎn)化試驗(yàn)前3天，從-80冰箱取農(nóng)桿菌(含待轉(zhuǎn)化的外源基因bar)劃平板。28℃培養(yǎng)兩天，挑平板上單克隆到2ml YEP液體培養(yǎng)基(含相應(yīng)抗生素)，28℃搖菌過(guò)夜。按照1:50比例取菌液加入到新的YEP液體培養(yǎng)基中(含相應(yīng)抗生素)，搖菌到OD₆₀₀＝0.6-0.8。5000rpm室溫離心10分鐘后，加入侵染培養(yǎng)基重懸至OD₆₀₀＝0.1-0.3，倒入無(wú)菌的三角瓶中。然后抽真空，0.1Mpa維持5分鐘，然后緩慢釋放，25℃搖床上繼續(xù)侵染30分鐘。將轉(zhuǎn)化后的未成熟胚轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)基上放置一張濾紙以防止農(nóng)桿菌過(guò)度生長(zhǎng)，暗培養(yǎng)2天，溫度為28℃。

其中侵染培養(yǎng)基配方為：1/10×MS鹽、1/10×B5維生素、3％蔗糖、3.9g/L MES、0.04g/L乙酰丁香酮、400mg\L L-半胱氨酸和154mg/L二硫蘇糖醇，pH值為5.4；共培養(yǎng)基的配方為：1/10×MS鹽、1/10×B5維生素、3％蔗糖、3.9g/L MES、0.04g/L乙酰丁香酮、400mg\L L-半胱氨酸、154mg/L二硫蘇糖醇，瓊脂7g/L，pH值為5.4。

(3)將共培養(yǎng)基中的未成熟胚轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的條件下的除菌培養(yǎng)基中清洗3次，放到濾紙上瀝干。經(jīng)過(guò)除菌培養(yǎng)基清洗的未成熟胚轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)2周形成愈傷組織。

其中除菌培養(yǎng)基的配方為：1×MS鹽、1×B5維生素、3％蔗糖、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀和50mg/L萬(wàn)古霉素，pH值為7.0；誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：1×MS鹽、1×B5維生素、3％蔗糖、5mg/L 2,4-D、8mg/L除草劑、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀和50mg/L萬(wàn)古霉素、植物凝膠3g/L，pH值為5.7。

(4)將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)成芽，待誘導(dǎo)芽伸長(zhǎng)到2-3cm高時(shí)，移入到生根培養(yǎng)基，每?jī)芍芾^代一次，直至根長(zhǎng)2-3cm，獲得再生苗。

其中分化培養(yǎng)基配方為：1×MS鹽、1×B5維生素、6％的麥芽糖、4mg/L除草劑、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀、50mg/L萬(wàn)古霉素和0.3％植物凝膠，pH值為5.7；所述的生根培養(yǎng)基配方為：1/2×MS鹽、1/2×B5維生素、2％蔗糖、1mg/L IBA、0.3％植物凝膠，pH值為5.6。

(5)將獲得的再生苗煉苗3天，然后轉(zhuǎn)移到滅菌過(guò)的含珍珠巖的土壤中，保持濕潤(rùn)狀態(tài)，其中珍珠巖：土壤＝1：3，初期光照18h/天，溫度25-30℃，待植株高度約為40cm左右時(shí)，光照變?yōu)?1h/天，以促進(jìn)其開花，收獲轉(zhuǎn)基因苗株的種子。

結(jié)果表明，與上述文獻(xiàn)所述的方法相比，通過(guò)真空輔助農(nóng)桿菌侵染未成熟胚，誘導(dǎo)、分化培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化周期縮短42天，轉(zhuǎn)基因植株量大，且轉(zhuǎn)化效率高，形成高比例單拷貝。

實(shí)施例2

(1)挑選Williams 82開花后25-30天無(wú)病蟲害大豆嫰莢，用自來(lái)水沖洗15分鐘后，75％乙醇消毒1分鐘，然后用無(wú)菌水沖洗3次。在無(wú)菌臺(tái)內(nèi)剝開莢皮，用鑷子取出未成熟種子，剝?nèi)?片未成熟胚，在未成熟胚背面劃8刀，深度0.5mm左右，長(zhǎng)度2mm左右。

(2)侵染轉(zhuǎn)化試驗(yàn)前3天，從-80冰箱取農(nóng)桿菌(含待轉(zhuǎn)化的外源基因bar)劃平板。28℃培養(yǎng)兩天，挑平板上單克隆到2ml YEP液體培養(yǎng)基(含相應(yīng)抗生素)，28℃搖菌過(guò)夜。按照1:50比例取菌液加入到新的YEP液體培養(yǎng)基中(含相應(yīng)抗生素)，搖菌到OD₆₀₀＝0.6-0.8。5000rpm室溫離心10分鐘后，加入侵染培養(yǎng)基重懸至OD₆₀₀＝0.1-0.3，倒入無(wú)菌的三角瓶中。然后抽真空，0.1Mpa維持8分鐘，然后緩慢釋放，25℃搖床上繼續(xù)侵染30分鐘。將轉(zhuǎn)化后的未成熟胚轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)基上放置一張濾紙以防止農(nóng)桿菌過(guò)度生長(zhǎng)，暗培養(yǎng)2天，溫度為28℃。

其中侵染培養(yǎng)基配方為：1/10×MS鹽、1/10×B5維生素、3％蔗糖、3.9g/L MES、0.04g/L乙酰丁香酮、400mg\L L-半胱氨酸和154mg/L二硫蘇糖醇，pH值為5.4；共培養(yǎng)基的配方為：1/10×MS鹽、1/10×B5維生素、3％蔗糖、3.9g/L MES、0.04g/L乙酰丁香酮、400mg\L L-半胱氨酸、154mg/L二硫蘇糖醇，瓊脂7g/L，pH值為5.4。

(3)將共培養(yǎng)基中的未成熟胚轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的條件下的除菌培養(yǎng)基中清洗5次，放到濾紙上瀝干。經(jīng)過(guò)除菌培養(yǎng)基清洗的未成熟胚轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)2周形成愈傷組織。

其中除菌培養(yǎng)基的配方為：1×MS鹽、1×B5維生素、3％蔗糖、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀和50mg/L萬(wàn)古霉素，pH值為7.0；誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：1×MS鹽、1×B5維生素、3％蔗糖、5mg/L 2,4-D、8mg/L除草劑、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀和50mg/L萬(wàn)古霉素、植物凝膠3g/L，pH值為5.7。

(4)將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)成芽，待誘導(dǎo)芽伸長(zhǎng)到2-3cm高時(shí)，移入到生根培養(yǎng)基，每?jī)芍芾^代一次，直至根長(zhǎng)2-3cm，獲得再生苗。

其中分化培養(yǎng)基配方為：1×MS鹽、1×B5維生素、6％的麥芽糖、4mg/L除草劑、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀、50mg/L萬(wàn)古霉素和0.3％植物凝膠，pH值為5.7；所述的生根培養(yǎng)基配方為：1/2×MS鹽、1/2×B5維生素、2％蔗糖、1mg/L IBA、0.3％植物凝膠，pH值為5.6。

(5)將獲得的再生苗煉苗5天，然后轉(zhuǎn)移到滅菌過(guò)的含珍珠巖的土壤中，保持濕潤(rùn)狀態(tài)，其中珍珠巖：土壤＝1：3，初期光照18h/天，溫度25-30℃，待植株高度約為40cm左右時(shí)，光照變?yōu)?1h/天，以促進(jìn)其開花，收獲轉(zhuǎn)基因苗株的種子。

結(jié)果表明，與上述文獻(xiàn)所述的方法相比，通過(guò)真空輔助農(nóng)肝菌侵染未成熟胚，誘導(dǎo)、分化培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化周期縮短50天，轉(zhuǎn)基因植株量大，且轉(zhuǎn)化效率高，形成高比例單拷貝。

實(shí)施例3

(1)挑選Jack開花后25-30天無(wú)病蟲害大豆嫰莢，用自來(lái)水沖洗15分鐘后，75％乙醇消毒1分鐘，然后用無(wú)菌水沖洗3次。在無(wú)菌臺(tái)內(nèi)剝開莢皮，用鑷子取出未成熟種子，剝?nèi)?片未成熟胚，在未成熟胚背面劃7刀，深度0.5mm左右，長(zhǎng)度2mm左右。

(2)侵染轉(zhuǎn)化試驗(yàn)前3天，從-80冰箱取農(nóng)桿菌(含待轉(zhuǎn)化的外源基因bar)劃平板。28℃培養(yǎng)兩天，挑平板上單克隆到2ml YEP液體培養(yǎng)基(含相應(yīng)抗生素)，28℃搖菌過(guò)夜。按照1:50比例取菌液加入到新的YEP液體培養(yǎng)基中(含相應(yīng)抗生素)，搖菌到OD₆₀₀＝0.6-0.8。5000rpm室溫離心10分鐘后，加入侵染培養(yǎng)基重懸至OD₆₀₀＝0.1-0.3，倒入無(wú)菌的三角瓶中。然后抽真空，0.1Mpa維持5分鐘，然后緩慢釋放，25℃搖床上繼續(xù)侵染30分鐘。將轉(zhuǎn)化后的未成熟胚轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)基上放置一張濾紙以防止農(nóng)桿菌過(guò)度生長(zhǎng)，暗培養(yǎng)2天，溫度為28℃。

其中侵染培養(yǎng)基配方為：1/10×MS鹽、1/10×B5維生素、3％蔗糖、3.9g/L MES、0.04g/L乙酰丁香酮、400mg\L L-半胱氨酸和154mg/L二硫蘇糖醇，pH值為5.4；共培養(yǎng)基的配方為：1/10×MS鹽、1/10×B5維生素、3％蔗糖、3.9g/L MES、0.04g/L乙酰丁香酮、400mg\L L-半胱氨酸、154mg/L二硫蘇糖醇，瓊脂7g/L，pH值為5.4。

(3)將共培養(yǎng)基中的未成熟胚轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的條件下的除菌培養(yǎng)基中清洗4次，放到濾紙上瀝干。經(jīng)過(guò)除菌培養(yǎng)基清洗的未成熟胚轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)2周形成愈傷組織。

其中除菌培養(yǎng)基的配方為：1×MS鹽、1×B5維生素、3％蔗糖、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀和50mg/L萬(wàn)古霉素，pH值為7.0；誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：1×MS鹽、1×B5維生素、3％蔗糖、5mg/L 2,4-D、8mg/L除草劑、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀和50mg/L萬(wàn)古霉素、植物凝膠3g/L，pH值為5.7。

(4)將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)成芽，待誘導(dǎo)芽伸長(zhǎng)到2-3cm高時(shí)，移入到生根培養(yǎng)基，每?jī)芍芾^代一次，直至根長(zhǎng)3cm，獲得再生苗。

其中分化培養(yǎng)基配方為：1×MS鹽、1×B5維生素、6％的麥芽糖、4mg/L除草劑、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀、50mg/L萬(wàn)古霉素和0.3％植物凝膠，pH值為5.7；所述的生根培養(yǎng)基配方為：1/2×MS鹽、1/2×B5維生素、2％蔗糖、1mg/L IBA、0.3％植物凝膠，pH值為5.6。

(5)將獲得的再生苗煉苗4天，然后轉(zhuǎn)移到滅菌過(guò)的含珍珠巖的土壤中，保持濕潤(rùn)狀態(tài)，其中珍珠巖：土壤＝1：3，初期光照18h/天，溫度25-30℃，待植株高度約為45cm左右時(shí)，光照變?yōu)?1h/天，以促進(jìn)其開花，收獲轉(zhuǎn)基因苗株的種子。

結(jié)果表明，與上述文獻(xiàn)所述的方法相比，通過(guò)真空輔助農(nóng)肝菌侵染未成熟胚，誘導(dǎo)、分化培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化周期縮短39天，轉(zhuǎn)基因植株量大，且轉(zhuǎn)化效率高，形成高比例單拷貝。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)無(wú)需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過(guò)邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。