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一種真空輔助農(nóng)桿菌侵染的大豆遺傳轉化方法與流程

文檔序號:12167357閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一種真空輔助農(nóng)桿菌侵染的大豆遺傳轉化方法,其特征在于,包括以下步驟:

1)獲得大豆未成熟胚;

2)利用農(nóng)桿菌侵染,真空輔助轉化步驟1)中所獲得的未成熟胚后將其轉移至共培養(yǎng)基培養(yǎng);

3)利用除菌培養(yǎng)基清洗步驟2)中產(chǎn)生的未成熟胚,清洗后未成熟胚轉移至含篩選劑的誘導培養(yǎng)基進行誘導,產(chǎn)生抗性愈傷組織;

4)利用含篩選劑的分化培養(yǎng)基對步驟3)中產(chǎn)生的抗性愈傷組織進行分化形成誘導芽,通過繼代和生根培養(yǎng)獲得再生苗;

5)對步驟4)獲得的所述再生苗進行煉苗和移栽,收獲轉基因植株的種子。

2.如權利要求1所述的真空輔助農(nóng)桿菌侵染的大豆遺傳轉化方法,其特征在于,所述未成熟胚是大豆開花25-30天的未成熟種子,去掉種皮和胚芽后獲得的未成熟胚,長度3-6mm。

3.如權利要求1所述的真空輔助農(nóng)桿菌侵染的大豆遺傳轉化方法,其特征在于,所述未成熟胚的背面劃6-9刀,深度0.3-0.6mm,長度1-3mm。

4.如權利要求1所述的大豆遺傳轉化方法,其特征在于,所述農(nóng)桿菌的侵染濃度為OD600=0.1-0.3。

5.如權利要求1所述的真空輔助農(nóng)桿菌侵染的大豆遺傳轉化方法,其特征在于,所述真空輔助轉化的程序為:抽真空,以0.1Mpa壓強維持5-10分鐘,然后緩慢釋放,在溫度25℃的搖床上侵染20-40分鐘。

6.如權利要求1所述的真空輔助農(nóng)桿菌侵染的大豆遺傳轉化方法,其特征在于,所述誘導培養(yǎng)基中的篩選劑濃度為8mg/L。

7.如權利要求1所述的真空輔助農(nóng)桿菌侵染的大豆遺傳轉化方法,其特征在于,所述分化培養(yǎng)基中的篩選劑濃度為4mg/L。

8.如權利要求1所述的真空輔助農(nóng)桿菌侵染的大豆遺傳轉化方法,所述步驟4)中,當所述誘導芽長到2-3cm時轉入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng),每兩周繼代一次,直至根長2-3cm,獲得所述再生苗。

9.如權利要求1所述的真空輔助農(nóng)桿菌侵染的大豆遺傳轉化方法,其特征在于:

所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基為:1/10×MS鹽、1/10×B5維生素、3%蔗糖、3.9g/L MES、0.04g/L乙酰丁香酮、400mg\L L-半胱氨酸、154mg/L二硫蘇糖醇、瓊脂7g/L,pH值為5.4;

所述除菌培養(yǎng)基為:1×MS鹽、1×B5維生素、3%蔗糖、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀和50mg/L萬古霉素,pH值為7.0;

所述誘導培養(yǎng)基為:1×MS鹽、1×B5維生素、3%蔗糖、5mg/L 2,4-D、8mg/L篩選劑、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀和50mg/L萬古霉素、植物凝膠3g/L,pH值為5.7;

所述分化培養(yǎng)基為:1×MS鹽、1×B5維生素、6%的麥芽糖、4mg/L篩選劑、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀、50mg/L萬古霉素和0.3%植物凝膠,pH值為5.7。

10.如權利要求1所述的真空輔助農(nóng)桿菌侵染的大豆遺傳轉化方法,其特征在于,所述再生苗煉苗3-5天,然后移栽到滅菌過的含珍珠巖的土壤中,保持濕潤狀態(tài),其中珍珠巖:土壤=1:3,初期光照18h/天,溫度25-30℃培養(yǎng),待植株高度為35-45cm時,光照變?yōu)?1h/天,以促進其開花。

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