本發(fā)明涉及一種用于惡臭假單胞菌NBRC 14164的基因敲除方法，其屬分子生物學(xué)研究領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)是一類革蘭氏陰性菌，屬γ-變形菌，廣泛分布于自然界的生態(tài)位，由于其強(qiáng)大的代謝能力而對(duì)環(huán)境有較強(qiáng)適應(yīng)性，如可生存于高濃度重金屬污染或有機(jī)污染物等環(huán)境中[1,2,3]。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，許多典型P.putida菌株的基因組序列得以查詢，為菌株的廣泛應(yīng)用、遺傳背景解析、分子改造等提供了強(qiáng)有力的支撐。如極具代表性的P.putida KT2440在PHA生產(chǎn)[4]方面有良好表現(xiàn)，而其基因組尺度的代謝網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建更讓其大大提高了PHA產(chǎn)量[5]。

目前，基因敲除方法有很多，其中利用同源重組原理發(fā)展出來的技術(shù)有著廣泛的應(yīng)用。同源重組是指基因工程中利用活細(xì)胞DNA可與外源DNA序列發(fā)生重組的性質(zhì)，來進(jìn)行定點(diǎn)修飾改造基因組上某一目的基因的技術(shù)[6]，可分為誘導(dǎo)性基因敲除法、基因插入突變技術(shù)、自殺載體構(gòu)建技術(shù)等。其中，自殺載體的原理為：將需缺失的目的基因克隆到自殺載體上，通過接合等使其進(jìn)入宿主，由于在宿主菌中不存在復(fù)制基因啟始所需的復(fù)制蛋白而無法復(fù)制，在外界選擇性壓力的作用下，自殺載體所攜帶的突變基因就與宿主染色體上的野生型基因發(fā)生二次同源重組，產(chǎn)生了帶有突變位點(diǎn)的突變株，而載體自身由于自殺性特性連同染色體上原有的野生型基因一起隨著細(xì)菌的傳代從菌體內(nèi)消失[7]。

P.putida NBRC 14164的全基因組序列于2014年測(cè)出[3]，在DDBJ/EMBL/GenBank等多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中的編號(hào)為AP013070。在此之前，該菌株僅作為研究中的對(duì)比分析，如用于分類方法研究[8]、有毒污染物降解[9]等；時(shí)至今日，仍鮮有針對(duì)該菌株的專門研究的報(bào)道。從分子層面探索P.putida NBRC 14164的可操作性，提供一種行之可效的操作方法，將為其深入研究打開新的通道，開辟?gòu)V闊的空間。

[1]Wu X,Monchy S,Taghavi S,et al.,Comparative genomics and functional analysis of niche-specific adaptation in Pseudomonas putida.FEMS Microbiol.,35:299-323(2011).

[2]Poblete-Castro I,Becker J,Dohnt K,et al.,Industrial biotechnology of Pseudomonas putida and related species.Appl.Microbiol.Biotechnol.,93:2279-2290(2012).

[3]Shoko O,Atsushi Y,Akira H,et al.,The complete genome sequence of Pseudomonas putida NBRC 14164^T confirms high intraspecies variation.Genome Announcements,2(1):e00029-14(2014).

[4]Wang Q,Nomura CT,Monitoring differences in gene expression levels and polyhydroxyalkanoate(PHA)production in Pseudomonas putida KT2440grown on different carbon sources.Journal of Bioscience&Bioengineering,110(6):653-659(2010).

[5]Nogales J,PalssonThiele I,A genome-scale metabolic reconstruction of Pseudomonas putida KT2440:iJN746as a cell factory.BMC Systems Biology,2(37):1-20(2008).

[6]賀淹才,簡(jiǎn)明基因工程原理[M].北哀科學(xué)出版社,2005:389.

[7]盧福芝,孫靚,黃靖華,等,質(zhì)粒pUC19-CM-D的構(gòu)建及應(yīng)用.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),38(19):9953-9954(2010).

[8]Tamura H,Hotta Y,Sato H,Novel accurate bacterial discrimination by MALDI-time-of-flight MS based on ribosomal proteins coding in S10-spc-alpha operon at strain level S10-GERMS.Journal of the American Society for Mass Spectrometry,24(8):1185-93(2013).

[9]Nonaka K,Ohta H,Sato Y,et al.,Utilization of phenylpropanoids by Pseudomonas putida soil isolates and its probable taxonomic significance.Microbes&Environments,23(4):360-364(2008).

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于上述，本發(fā)提出一種用于惡臭假單胞菌NBRC 14164的基因敲除方法，并驗(yàn)證其可行性，具體技術(shù)如下：

首先構(gòu)建基因敲除質(zhì)粒，然后制備接合轉(zhuǎn)化的輔助菌株E.coli S17-1感受態(tài)細(xì)胞，再將基因敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli S17-1感受態(tài)細(xì)胞，最后利用接合轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入質(zhì)粒至P.putida NBRC 14164中，電泳驗(yàn)證即可。

具體說明如下：

惡臭假單胞菌Pseudomonas putida NBRC 14164，購(gòu)買自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。埃希氏大腸桿菌Escherichia coli S17-1在接合轉(zhuǎn)化中起輔助作用，與載體質(zhì)粒pK18mobSacB均為實(shí)驗(yàn)室保藏(原始菌株購(gòu)自武漢淼靈生物科技有限公司)。

一種用于惡臭假單胞菌NBRC 14164的基因敲除方法，其步驟如下：

1)基因敲除質(zhì)粒構(gòu)建；

2)E.coli S17-1感受態(tài)細(xì)胞的制備；

3)基因敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli S17-1感受態(tài)細(xì)胞；

4)接合轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入質(zhì)粒至P.putida NBRC 14164中。

所述的步驟1)是：查找擬敲除基因序列，利用軟件Primer Premier 5設(shè)計(jì)基因敲除引物與敲除后驗(yàn)證引物，兩對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物相差300-400bp，敲除引物擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切連接質(zhì)粒即構(gòu)建成功。

所述的步驟2)是：用于接合轉(zhuǎn)化的輔助菌株E.coli按照熱激轉(zhuǎn)化法制備感受態(tài)細(xì)胞，用Mg²⁺溶液、Ca²⁺溶液的洗滌，全程無菌操作。

所述的步驟3)是：用熱激轉(zhuǎn)化法將基因敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coli感受態(tài)細(xì)胞。

所述的步驟4)是：接合轉(zhuǎn)化利用兩次同源重組將基因敲除，第一次同源重組質(zhì)粒從E.coli進(jìn)入P.putida中并整合到染色體上，第二次同源重組質(zhì)粒與敲除引物擴(kuò)增的基因從染色體上脫離，即基因敲除成功。

第一次同源重組條件為惡臭假單胞菌與含有重組自殺載體質(zhì)粒的大腸桿菌于30℃，200rpm培養(yǎng)12h，再靜置12h。

第二次同源重組條件為篩選后的第一次同源重組成功的單菌落接種到無抗性LB液體培養(yǎng)基中，30℃，200rpm培養(yǎng)24h。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：采用接合轉(zhuǎn)化方法，利用同源重組原理，借助輔助菌株E.coli S17-1、自殺載體質(zhì)粒pK18mobSacB共同完成基因敲除。首次從分子層面探索P.putida NBRC 14164的可操作性，提供一種行之可效的操作方法；此方法不僅適用于基因敲除，亦可將外源基因整合至P.putida染色體，相比于外源質(zhì)粒導(dǎo)入具有更好的穩(wěn)定性。此方法將為P.putida NBRC 14164的深入研究打開新的通道，開辟?gòu)V闊的空間。

附圖說明

圖1酶切連接示意圖

待敲除基因先從P.putida基因組上擴(kuò)增下來，其中用于擴(kuò)增的上下游引物含有酶切位點(diǎn)。將擴(kuò)增后的基因與自殺載體質(zhì)粒用相同的限制性內(nèi)切酶切割后，經(jīng)連接即可成功構(gòu)建基因敲除質(zhì)粒。

圖2感受態(tài)細(xì)胞制備示意圖

用于接合轉(zhuǎn)化的輔助菌株E.coli經(jīng)Mg²⁺溶液、Ca²⁺溶液的洗滌，最后用甘油溶液重懸即可成為適用于熱激轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。

圖3熱激轉(zhuǎn)化示意圖

空心圓點(diǎn)代表自殺載體質(zhì)粒，經(jīng)熱激與冰浴，自殺載體質(zhì)粒穿過E.coli的細(xì)胞壁與細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞中。

圖4基因敲除示意圖

載體上灰色片段為擬敲除基因片段，基因組上灰黑相間片段為完整基因；第一次同源重組后，自殺載體質(zhì)粒整合至基因組；第二次同源重組后，自殺載體質(zhì)粒脫離基因組，剩下黑色片段為敲除后基因片段。

圖5 prs和rpiA基因敲除前后電泳圖

泳道3為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1和4分別為敲除前的prs和rpiA基因，泳道2和5分別為敲除后的prs和rpiA基因。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明：

1.培養(yǎng)基配方與溶液配方

SOB培養(yǎng)基：胰蛋白胨20g/L、酵母粉5g/L、氯化鈉0.5g/L、250mM氯化鉀10mL/L、2M氯化鎂5mL/L；

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化鈉10g/L；

LBS培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化鈉10g/L、蔗糖60g/L；

配制固體培養(yǎng)基時(shí)加入瓊脂粉15g/L；

氨芐青霉素(Amp)工作濃度：100μg/mL；

卡那霉素(Kan)工作濃度：50μg/mL；

Mg²⁺溶液：100mM氯化鎂、10mM TriS，pH7.5；

Ca²⁺溶液：100mM氯化鈣、10mM TriS，pH7.5；

甘油溶液：8.5mL Ca²⁺溶液、1.5mL甘油。

2.基因敲除質(zhì)粒構(gòu)建

(1)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找P.putida基因的全序列，以prs和rpiA為例設(shè)計(jì)基因敲除引物與敲除后驗(yàn)證引物如表1所示。其中驗(yàn)證引物擴(kuò)增產(chǎn)物約為基因全長(zhǎng)，敲除引物擴(kuò)增產(chǎn)物約為基因全長(zhǎng)去掉首尾100-200bp，即兩對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物相差200-400bp。

表1prs和rpiA基因敲除引物與敲除后驗(yàn)證引物

(2)以P.putida甘油菌為模板用敲除引物擴(kuò)增基因，將電泳驗(yàn)證正確的擴(kuò)增產(chǎn)物與pK18mobSacB的序列兩端用相同的限制性內(nèi)切酶切割1h、連接2h，即得基因敲除質(zhì)粒。

酶切連接過程如圖1所示。

3.E.coli S17-1感受態(tài)細(xì)胞的制備

(1)活化E.coli，按1％(v/v)的接種量將種子液接種到200mL SOB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6左右。

(2)將培養(yǎng)物在冰水中放置30min后，用15mL的預(yù)冷的Mg²⁺溶液、Ca²⁺溶液各洗滌菌體一次。

(3)用5mL甘油溶液重懸菌體，懸浮菌液分裝每管40μL，保存于-80℃。

感受態(tài)細(xì)胞制備過程如圖2所示。

4.基因敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli S17-1感受態(tài)細(xì)胞

(1)取出E.coli置于冰上融化后加入10μL質(zhì)粒，輕輕混勻，冰浴30min。

(2)42℃熱擊90s后迅速置于冰上3min，再加入890μL的LB培養(yǎng)基，30℃，200rpm培養(yǎng)1h。

(3)取100μL轉(zhuǎn)化液涂在含有Kan的LB平板上，30℃培養(yǎng)18h。

熱激轉(zhuǎn)化過程如圖3所示。

5.接合轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入質(zhì)粒至P.putida NBRC 14164中

(1)各取活化后的E.coli和P.putida菌液500μL，混合在同一無菌離心管中，8000rpm離心3min，用1mL LB培養(yǎng)基洗滌一次，加入1mL LB培養(yǎng)基重懸菌體，30℃，200rpm培養(yǎng)12h，再靜置12h，第一次同源重組完成。

(2)100μL混合液涂在LB-Amp-Kan的平板上，30℃培養(yǎng)24h。

(3)挑取單菌落，接種到無抗性LB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24h，第二次同源重組完成。

(4)將培養(yǎng)液用無菌水稀釋100倍，取100μL涂布在LBS-Amp的平板上，30℃培養(yǎng)24h。

(5)LBS-Amp平板上的菌挑取單菌落，按編號(hào)依次點(diǎn)在LBS-Amp和LB-Kan平板上，30℃培養(yǎng)24h，標(biāo)出LBS Amp平板上有生長(zhǎng)而LB-Kan平板上無生長(zhǎng)的菌落即為陽性菌落。

(6)菌落PCR、電泳驗(yàn)證。

兩次同源重組過程如圖4所示，prs和rpiA基因敲除前后電泳如圖5所示。