一種利用重組鈍齒棒桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)l-瓜氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用重組鈍齒棒桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-瓜氨酸的方法，屬于生 物工程和生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] L-精氨酸脫亞胺酶（Argininedeiminase,E.C. 3. 5. 3. 6,ADI)，是微生物精氨酸代 謝過程途徑的關(guān)鍵酶。其能催化L-精氨酸形成L-瓜氨酸和氨。ADI廣泛存在于蠟樣芽孢 桿菌、糞鏈球菌、惡臭假單胞菌以及支原體等微生物中。研究發(fā)現(xiàn)該酶可以抑制動(dòng)物血管內(nèi) 皮細(xì)胞增生，同時(shí)可以抑制多種惡性腫瘤的體外增殖，并且能夠抑制體內(nèi)的惡性腫瘤的增 生。ADI曾被證明是一種細(xì)胞迀移抑制劑，從Mycoplasmaarginine中純化的ADI能抑制人 體內(nèi)幾種癌細(xì)胞的迀移。另外ADI借助抑制多胺生物合成以直接控制腫瘤細(xì)胞的生長來實(shí) 現(xiàn)抗癌。所以在醫(yī)學(xué)上，精氨酸脫亞胺酶作為一種新型的抗腫瘤物質(zhì)越來越受到重視。在 工業(yè)上，由于其能水解精氨酸產(chǎn)生瓜氨酸，所以ADI也可以應(yīng)用于瓜氨酸的生產(chǎn)。
[0003] L-瓜氨酸是一種重要的非蛋白質(zhì)氨基酸，是人體內(nèi)尿素循環(huán)的重要中間代謝產(chǎn) 物，能夠吸收和清除有害的自由基從而起到抗氧化的作用，同時(shí)增加N0合成所需的精氨 酸，可有效保護(hù)DNA及PMN免受氧化反應(yīng)的侵害，可以作為抗衰老、提高免疫力的保健品， 也可作為女性美容化妝品，具有護(hù)膚防皺祛斑抗衰老之功效。在醫(yī)藥領(lǐng)域，L-瓜氨酸對防 治前列腺疾病，包括前列腺炎、前列腺癌的作用明顯。L-瓜氨酸能夠使人體產(chǎn)生出氮氧化 物，而這種氮氧化物對男性的性能力是一種非常重要的物質(zhì)。最近的研究表明，瓜氨酸在 體內(nèi)轉(zhuǎn)化為人體必需氨基酸L-精氨酸，在維持心血管正常功能的一氧化氮代謝中也發(fā)揮 著重要作用，
[0004] 工業(yè)上L-瓜氨酸的合成包括化學(xué)合成法、提取法、微生物發(fā)酵法和L-精氨酸水解 法。
[0005] 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-瓜氨酸主要是通過誘變或者基因工程的方法獲得L-瓜氨酸 高產(chǎn)菌株，以較為便宜的葡萄糖甚至是淀粉等為初始原料合成L-瓜氨酸。在這方面日本起 步較早，上世紀(jì)30年代開始就有相關(guān)的研究，到60年代已經(jīng)達(dá)到了一定的水平。日本Kyowa Hakkokogyo公司培養(yǎng)能夠利用經(jīng)類作為碳源的石錯(cuò)節(jié)桿菌Arthrobacterparaffineus精 氨酸需求型的突變株發(fā)酵生產(chǎn)瓜氨酸，以1%的ΝΗ4Ν0#Ρ0. 5%的酵母膏為氮源，以lmg/L 的VBi等成分，發(fā)酵96h積累7.lg/L的瓜氨酸?？梢?，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-瓜氨酸存在產(chǎn) 量低、發(fā)酵周期長等劣勢，仍然不能滿足工業(yè)上對瓜氨酸的需求。
[0006] L-精氨酸水解法生產(chǎn)L-瓜氨酸包括堿水解法和酶水解法，其中酶法合成瓜氨 酸的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)物濃度高，純化步驟少，產(chǎn)品中無D型旋光對映體，生產(chǎn)工藝簡單、成本低。 IchironChibata等報(bào)道PsudomonasputidaATCC4359/PseudomonasfluorescenIF0 30081/PseudomonasovalisIAM1002/LeuconostoccitrovorumATCC8081 等生產(chǎn)的精氨 酸脫亞胺酶，能以L-精氨酸或DL-精氨酸為底物，轉(zhuǎn)化得到80g/L以上的瓜氨酸。北京化 工大學(xué)姚海峰等人以糞鏈球菌催化L-精氨酸，25h內(nèi)得到92. 72g/LL-瓜氨酸；但其仍很 難滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求，原因在于精氨酸脫亞氨酶的活性較低，轉(zhuǎn)化率較低，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生雜 酶，影響瓜氨酸的生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明首先提供了一株重組表達(dá)精氨酸脫亞胺酶的基因工程菌，是將精氨酸脫 亞胺酶基因arcA連接在表達(dá)載體pXMJ19上，并轉(zhuǎn)化至鈍齒棒桿菌（Corynebacterium crenatum)SDNN403 得到基因工程菌C.crenatumSDNN403/pXMJ19-arcA。
[0008] 所述鈍齒棒桿菌SDNN403的保藏編號(hào)為CGMCCNo. 0890。
[0009] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述精氨酸脫亞胺酶基因來源于菌株 Lactobacillusbrevis，序列如SEQIDNO. 1 所不。
[0010] 本發(fā)明還提供了應(yīng)用所述基因工程菌為全細(xì)胞催化劑生產(chǎn)L-瓜氨酸的方法，是 以L-精氨酸為底物，以基因工程菌為全細(xì)胞催化劑，構(gòu)建轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-瓜氨酸的轉(zhuǎn)化體系； 所述轉(zhuǎn)化體系采用的緩沖液是PH6. 0-7. 0的磷酸鹽緩沖液，向其中添加游離全細(xì)胞催化劑 至濃度為〇D_= 7-8,L-精氨酸用量為80-100g/L緩沖液，轉(zhuǎn)化溫度40-45°C，并通過補(bǔ)加 L-精氨酸使轉(zhuǎn)化體系中L-精氨酸濃度維持在60-100g/L之間。
[0011] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)化體系還含有0. 1MMn2+和/或0. 1MMg2+。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)化體系采用pH6. 4的磷酸鹽緩沖液，含有 100g/L的L-精氨酸、0. 1MΜη2+、0. 1MMg2+，轉(zhuǎn)化溫度45°C，并通過補(bǔ)加L-精氨酸使轉(zhuǎn)化體 系中L-精氨酸濃度維持在60-100g/L之間。
[0013] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：
[0014] (1)本發(fā)明以一種高效全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-瓜氨酸為目的，利用分子技術(shù)克隆了來 自Lactobacillusbrevis的精氨酸脫亞胺酶基因arcA，構(gòu)建重組表達(dá)載體pXMJ19_arcA， 并通過電轉(zhuǎn)化方法將其轉(zhuǎn)化至C.crenatumSDNN403中，成功構(gòu)建了基因工程菌株 C.crenatumSDNN403/pXMJ19_arcA。酶活力測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)出發(fā)菌C.crenatumSDNN403 并 無精氨酸脫亞胺酶的酶活，而重組菌精氨酸脫亞胺酶的酶活達(dá)到2. 56U/mg。
[0015] (2)本發(fā)明進(jìn)一步利用基因工程菌C.crenatumSDNN403/pXMJ19-arcA全細(xì)胞轉(zhuǎn) 化L-精氨酸生產(chǎn)L-瓜氨酸氨酸，并在48h內(nèi)積累了 301. 4g/L的L-瓜氨酸，精氨酸的摩爾 轉(zhuǎn)化率達(dá)到99. 9%。與現(xiàn)有的酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-瓜氨酸相比，生產(chǎn)效率和產(chǎn)量都得到了大大 的提高。本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-瓜氨酸的方法，具有產(chǎn)物專一性強(qiáng)、轉(zhuǎn)化效率高、底物 殘留量少的優(yōu)點(diǎn)，為后期產(chǎn)物的分離純化帶來很大的方便。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 重組菌株精氨酸脫亞胺酶的酶活力測定
[0017] 酶活測定原理：L_瓜氨酸中含有的脲基與二乙酰肟在酸性條件下所轉(zhuǎn)化生成的 丁二酮在強(qiáng)酸條件下縮合成紅色二唑化合物（瓜氨酸濃度在0-20mg/L具有較好線性關(guān) 系）。
[0018] 酶活測定方法：配制0. 2M底物L(fēng)-精氨酸（pH6. 5,0. 2M磷酸緩沖液），取1. 8ml底 物溶液，加入0. 2ml酶液，37°C反應(yīng)10min。將酶反應(yīng)液稀釋相應(yīng)的倍數(shù)（200-2000倍），取 2ml稀釋后的反應(yīng)液，加入3ml混合酸鐵溶液，0. 5ml二乙酰-肟、氨基硫脲混合液，搖勻，立 即沸水浴lOmin，測定其530nm處的吸光度值。
[0019] 二乙酰-肟、氨基硫脲混合液：lg二乙酰Η虧，60mg氨基硫脲用水配成100ml。
[0020] 混合酸鐵溶液：濃磷酸70ml，濃硫酸160ml，用水配成1000ml，再加入10mg/ml FeCl35ml〇
[0021 ] 高效液相色譜法（HPLC)測定轉(zhuǎn)化液中L-瓜氨酸和L-精氨酸的含量
[0022] 氨基酸分析色譜條件：
[0023] (a)色譜柱：安捷倫色譜柱TC-C18250*4. 6*5
[0024] (b)柱溫：40°C
[0025] (c)流動(dòng)相：A相：稱取8. 0克結(jié)晶乙酸鈉于1000毫升燒杯中，加入1000毫升 水?dāng)嚢柚了薪Y(jié)晶水溶解，再加入225微升三乙胺，攪拌并滴加5 %的醋酸，將ΡΗ調(diào)到 7. 20±0. 05 ;加入5毫升四氫咲喃，混合后備用。Β相：稱取12. 0克結(jié)晶乙酸鈉于800毫升 燒杯中；加入400毫升水?dāng)嚢柚了薪Y(jié)晶溶解；滴加5%醋酸將ΡΗ調(diào)到7. 20±0. 05 ;將此 溶液加入800毫升乙腈和800毫升甲醇，混合后備用。
[0026] (d)檢測器：紫外檢測器338nm。
[0027] 實(shí)施例1精氨酸脫亞胺酶引物設(shè)計(jì)
[0028]選擇食品安全型菌株Lactobacillusbrevis，并根據(jù)NCBI中Lactobacillus brevis全基因組核酸序列中arcA基因序列，設(shè)計(jì)精氨酸酶基因的PCR引物F和R。
[0029]F:5'-ACCCGAAGCTTATGACAAGTCCGATTCACGTAATG-3' (Hindlll)
[0030] R：5, -ACCGGMTTCTTAAAGGTCTTCTCGAACTAATGGC-3,(EcoRI)
[0031] 實(shí)施例2精氨酸脫亞胺酶基因的克隆
[0032] 以Lactobacillusbrevis總DNA為模板，利用實(shí)施例1提供的引物做PCR擴(kuò)增，擴(kuò) 增條件為：94°C預(yù)變性，5min，一個(gè)循環(huán)；94°C變性，lmin，56°C退火，lmin，72°C延伸，lmin， 35個(gè)循環(huán)；72°C終延伸10min。PCR擴(kuò)增體系：模板lyL，上下游引物各0. 4yL，dNTPMix 4yL，10XExTaqBuffer5yL，滅菌的雙蒸水37yL，ExTaqDNA聚合酶lyL。采用凝膠回 收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，電泳