一種敲除pckA促進(jìn)枯草芽孢桿菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種敲除pckA促進(jìn)枯草芽孢桿菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法，屬于 遺傳工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙酰氨基葡萄糖是生物體內(nèi)的一種單糖，廣泛存在于細(xì)菌、酵母、霉菌、植物以及 動(dòng)物體內(nèi)。在人體中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖單元的合成前體，其對修復(fù)和維持軟 骨及關(guān)節(jié)組織功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被廣泛作為藥物和營養(yǎng)膳食添加 來治療和修復(fù)關(guān)節(jié)損傷。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妝品和制藥領(lǐng)域也具有諸多應(yīng)用。目 前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解蝦殼或蟹殼中甲殼素生產(chǎn)，此方法產(chǎn)生的廢液對環(huán)境污 染較為嚴(yán)重，而且得到的產(chǎn)品易引起過敏反應(yīng)，不適宜海鮮過敏的人群服用。
[0003] 枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis)是一種被廣泛用作食品酶制劑及重要營養(yǎng)化 學(xué)品的生產(chǎn)宿主，其產(chǎn)品被FDA認(rèn)證為"generallyregardedassafe"（GRAS)安全級別。 201510394205. 7構(gòu)建的重組枯草芽孢桿菌（BSGNK-PxylA-glmS-P43-GNAl)可在合成培養(yǎng)基中 較快生長、發(fā)酵生產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖，但是存在乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量（3g/L)較低的缺點(diǎn)。 因此，如何提高乙酰氨基葡萄糖合成途徑代謝通量以進(jìn)一步提高GlcNAc產(chǎn)量，是提高乙酰 氨基葡萄糖產(chǎn)量的亟待解決問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種敲除pckA促進(jìn)枯草芽孢桿菌合成乙酰氨 基葡萄糖的方法。由于培養(yǎng)基中含有葡萄糖時(shí)，枯草芽孢桿菌主要采用磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑轉(zhuǎn)運(yùn) 葡萄糖，利用磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸根將培養(yǎng)基中葡萄糖磷酸化并轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)，在該過 程中會(huì)產(chǎn)生大量的丙酮酸，而且磷酸烯醇式丙酮酸還可以通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 轉(zhuǎn)化為丙酮酸。所以本發(fā)明通過阻斷宿主菌胞內(nèi)磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸的反 應(yīng)，減少流向三羧酸循環(huán)的碳通量，最終提高了乙酰氨基葡萄糖合成途徑代謝通量、提高 GlcNAc產(chǎn)量。
[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量提高的重組枯草芽孢桿菌， 所述重組芽孢桿菌是在枯草芽孢桿菌BSGNK的基礎(chǔ)上，敲除了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編 碼基因（pckA)，命名為重組枯草芽孢桿菌BSGNKA。
[0006]所述枯草芽抱桿菌BSGNK，以B.subtilis168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagB ΔldhΔpta: :lox72為宿主，分別以啟動(dòng)子PxylA、P43控制glmS、GNAl的重組表達(dá)，并在此 基礎(chǔ)上敲除了葡萄糖激酶編碼基因glcK(NCBI上GeneID:938206)。
[0007] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，通過pP43_GNAl質(zhì)粒游離表達(dá)GNA1基因，通過 pM7Z6M-PxylA-glmS質(zhì)粒整合表達(dá)glmS基因。
[0008]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，以B.subtilis168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔη agBMdhApta: :1οχ72為宿主，分別以啟動(dòng)子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重組表達(dá)的 重組菌命名為BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNAl，具體構(gòu)建方法可參見文獻(xiàn)Liu，Y.etal.Modular pathwayengineeringofBacillussubtilisforimprovedN-acetylglucosamine production.Metab.Eng. 23:42-52, 2014〇
[0009]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述枯草芽孢桿菌BSGNK，是專利申請 201510394205. 7中構(gòu)建的重組枯草芽孢桿菌BSGNK。
[0010] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因pckA是 NCBI中g(shù)eneID:937235所示的基因。
[0011] 本發(fā)明第二個(gè)目的是提供一種所述重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，是先構(gòu)建磷酸 烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因敲除框，經(jīng)同源重組將敲除框中的博來霉素抗性基因zeo替 代枯草芽孢桿菌BSGNK基因組中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因pckA，阻斷了宿主菌胞內(nèi)磷 酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸的反應(yīng)，減少流向三羧酸循環(huán)的碳通量，促進(jìn)了乙酰氨基 葡萄糖積累。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述敲除框的序列如SEQIDNO. 1所示。
[0013] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種促進(jìn)枯草芽孢桿菌合成乙酰氨基葡萄糖的方法， 是以所述重組枯草芽孢桿菌BSGNKA為生產(chǎn)菌株發(fā)酵生產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖。
[0014] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵，使用的發(fā)酵培養(yǎng)基按g/L計(jì)，含有：初始 葡萄糖 20,蛋白胨 6,酵母粉 12,（NH4)S046,Κ2ΗΡ04 · 3H20 12. 5,ΚΗ2Ρ042· 5,CaC035,微量元 素溶液l〇_15ml;其中微量元素溶液按g/L計(jì)含有：MnS04 · 5H20 1. 0,CoCl2 · 6H20 0. 4， NaMo04 · 2H20 0· 2,ZnS04 · 7H20 0· 2,Alcl3 · 6H20 0· 1，Cucl2 ·H20 0· 1，Η3Β040 · 05,含 5M HC1 (即1L微量元素溶液中含有5molHC1)。
[0015] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵，是將生產(chǎn)菌株活化后，以3%的接種量轉(zhuǎn) 入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種2h后加入誘導(dǎo)劑木糖，于3L發(fā)酵罐、35-37°C、600-800rpm條件下培養(yǎng) 52-72h〇
[0016] 本發(fā)明的有益效果：
[0017] 本發(fā)明的重組枯草芽孢桿菌BSGNKA，是在枯草芽孢桿菌BSGNK的基礎(chǔ)上敲除磷酸 烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因（pckA)得到的，與出發(fā)菌株BSGNK相比，其乙酰氨基葡萄糖 胞外積累量提高了28.1%，濃度可達(dá)到29.27g/L。同時(shí)，本發(fā)明的BSGNKA菌株的乙酰氨基 葡萄糖比合成速率比對照菌株BSGNK提高了 46. 5%，副產(chǎn)物乙偶姻的產(chǎn)量僅為對照菌株的 68. 5%。本發(fā)明通過敲除pckA基因，可以有效的減少副廣物生成，提尚GlcNAc的積累。本 發(fā)明的重組枯草芽孢桿菌構(gòu)建方法簡單，便于使用，具有很好地應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 乙酰氨基葡萄糖的測定方法：
[0019] 高效液相色譜（HPLC)檢測法：Agilent1200,RID檢測器，順2柱（250X4.6mm， 5μm)，流動(dòng)相：70%乙腈，流速0. 75mL/min，柱溫30°C，進(jìn)樣體積為10μL。
[0020] 發(fā)酵液中葡萄糖濃度的檢測：SBA生物傳感分析儀（山東省科學(xué)院生物研究所）。
[0021] 種子培養(yǎng)基（g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5,NaCl10。
[0022] 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L)，為合成培養(yǎng)基：初始葡萄糖20,蛋白胨6,酵母粉12,（NH4) S046, Κ2ΗΡ04 ·