一種高效合成乙酰氨基葡萄糖的重組枯草芽孢桿菌的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種高效合成乙酷氨基葡萄糖的重組枯草芽抱桿菌，屬于遺傳工程領 域。
【背景技術】
[0002] 乙酷氨基葡萄糖是生物體內的一種單糖，廣泛存在于細菌、酵母、霉菌、植物W及 動物體內。在人體中，乙酷氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖單元的合成前體，其對修復和維持軟 骨及關節(jié)組織功能具有重要作用。因此，乙酷氨基葡萄糖被廣泛作為藥物和營養(yǎng)膳食添加 來治療和修復關節(jié)損傷。此外，乙酷氨基葡萄糖在化妝品和制藥領域也具有諸多應用。目 前，乙酷氨基葡萄糖主要采用酸解郵殼或蟹殼中甲殼素生產，此方法產生的廢液對環(huán)境污 染較為嚴重，而且得到的產品易引起過敏反應，不適宜海鮮過敏的人群服用。
[0003] 枯草芽抱桿菌度acillussubtilis)是一種廣泛使用的食品酶制劑及重要營養(yǎng)化 學品的生產宿主，其產品被FDA認證為"generallyregardedassafe" (GRA巧安全級別。 201510394205. 7構建的重組枯草芽抱桿菌度SGNK-PxyiA-glmS-P43-GNAl)可在合成培養(yǎng)基中 較快生長、發(fā)酵生產乙酷氨基葡萄糖，但是存在產量不高、底物/產物摩爾轉化率較低的缺 點。因此，如何提高乙酷氨基葡萄糖合成途徑代謝通量W進一步提高GlcNAc產量，是提高 乙酷氨基葡萄糖產量的亟待解決問題。

【發(fā)明內容】

[0004] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種高效合成乙酷氨基葡萄糖的重組枯草芽抱 桿菌。由于培養(yǎng)基中含有葡萄糖時，枯草芽抱桿菌主要采用憐酸轉運途徑轉運葡萄糖，將憐 酸締醇式丙酬酸的憐酸根轉運給葡萄糖并將其憐酸化，在該過程中會產生大量的丙酬酸。 同時憐酸締醇式丙酬酸還可W通過丙酬酸激酶轉化為丙酬酸，導致流向Ξ簇酸循環(huán)的碳通 量較大。所W本發(fā)明通過阻斷宿主菌胞內憐酸締醇式丙酬酸轉化為草酷乙酸的反應、憐酸 締醇式丙酬酸轉化為丙酬酸的反應，從而獲得一種高效利用葡萄糖合成乙酷氨基葡萄糖的 高產重組枯草芽抱桿菌。 陽〇化]本發(fā)明的第一個目的是提供一種高效合成乙酷氨基葡萄糖的重組枯草芽抱桿菌， 所述重組芽抱桿菌是在枯草芽抱桿菌BSGNK的基礎上，敲除了憐酸締醇式丙酬酸簇化酶編 碼基因pckA和丙酬酸激酶編碼基因pyk(NCBI上Gene10:938206)。
[0006]所述枯草芽抱桿菌BSGNK，WB.subtilis168Δna評ΔgamPΔgamAΔnagAΔna濁 Δ1化Δpta: :lox72為宿主，分別W啟動子P巧1A、P43控制glmS、GNAl的重組表達，并在此 基礎上敲除了葡萄糖激酶編碼基因glcK。
[0007] 在本發(fā)明的一種實施方式中，通過PP43-GNAI質粒游離表達GNA1基因，通過 pM7Z6M-Pqu-glmS質粒整合表達glmS基因。
[0008]在本發(fā)明的一種實施方式中，WB.subtilis168Δna評ΔgamPΔgamAΔnagAΔη a濁Δ1化Apta::lox72為宿主，分別W啟動子P巧ΙΑ、P43控制glmS、GNAl的重組表達的 重組菌命名為BSGN6-PxyiA-glmS-P43-GNAl，具體構建方法可參見文獻Liu,Υ.etal.Modular pathwayengineeringofBacillussubtilisforimprovedN-acetylglucosamine production.Met油.Eng. 23:42-52, 2014。 W09] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述枯草芽抱桿菌BSGNK，是專利申請 201510394205. 7中構建的重組枯草芽抱桿菌BSGNK。
[0010] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述丙酬酸激酶編碼基因pyk是NCBI中Gene 10:936596的基因；所述憐酸締醇式丙酬酸簇化酶編碼基因pckA是NCBI上Gene 10:937235 的基因。 W11] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述枯草芽抱桿菌BSGNK是專利申請 201510394205. 7中構建的重組枯草芽抱桿菌BSGNK。
[0012] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種所述重組枯草芽抱桿菌的構建方法，所述構建方 法是先構建憐酸締醇式丙酬酸簇化酶編碼基因敲除框、丙酬酸激酶編碼基因敲除框，經同 源重組，敲除憐酸締醇式丙酬酸簇化酶基因pckA和丙酬酸激酶編碼基因pyk，阻斷宿主菌 胞內憐酸締醇式丙酬酸轉化為草酷乙酸的反應和憐酸締醇式丙酬酸至丙酬酸的反應，減少 流向Ξ簇酸循環(huán)的碳通量、提高流向乙酷氨基葡萄糖的碳通量，促進乙酷氨基葡萄糖積累。
[0013] 本發(fā)明的第Ξ個目的是提供一種高效合成乙酷氨基葡萄糖的方法，是W重組枯草 芽抱桿菌BSGNKAP為生產菌株發(fā)酵生產乙酷氨基葡萄糖巧SGNKAP是在枯草芽抱桿菌BSGNK 的基礎上，敲除了憐酸締醇式丙酬酸簇化酶編碼基因pckA和丙酬酸激酶編碼基因pyk。
[0014] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述pckA是NCBI上GeneID:937235的基因，pyk是 NCBI中Gene10:936596 的基因。
[0015] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵使用的發(fā)酵培養(yǎng)基，按g/L計含有：葡萄糖 60,蛋白腺6,酵母粉 12,（畑4化〇46，1(2冊〇4.3&012.5，皿2口〇42.5，CaC〇35,微量元素lOml/L; 其中微量元素溶液按g/L計含有：MnS〇4· 5&0 1. 0,CoCl2· 6&0 0. 4,NaMo〇4· 2&0 0. 2， ZnS〇4· 7&0 0. 2,Aids· 6&0 0. 1，Cuclz· &0 0. 1，H3BO4O. 05,含 5M肥1 (即 1L微量元素 中含有5mol肥1)。
[0016] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵是將生產菌株活化后，W5%的接種量轉 入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種化后加入誘導劑木糖，于搖瓶中、35-37°C、200-220巧m條件下培養(yǎng) 36-5 化。
[0017] 在本發(fā)明的一種實施方式中，木糖用量為5g/L。
[0018] 本發(fā)明的有益效果：
[0019] 本發(fā)明提供的重組枯草芽抱桿菌可高效利用葡萄糖合成乙酷氨基葡萄糖，其搖瓶 發(fā)酵產量可達到11. 13g/l，比敲除pckA和pyk前的BSGNK菌株提高了 67.8%，比單獨敲除 pckA的BSGNKA菌株提高了 55.8%。同時本發(fā)明提供的重組枯草芽抱桿菌搖瓶發(fā)酵乙酷氨 基葡萄糖得率已提高到0. 192g/g葡萄糖，為進一步代謝工程改造枯草芽抱桿菌生產氨基 葡萄糖奠定了基礎。
【具體實施方式】
[0020] 乙酷氨基葡萄糖的測定方法：
[0021] 高效液相色譜（冊LC)檢測法：Agilent1200,RID檢測器，畑2柱（250X4.6mm， 5μm)，流動相：70%乙臘，流速0. 75血/min,柱溫30°C，進樣體積為10μL。
[0022] 種子培養(yǎng)基（g/L):膜蛋白腺10,酵母粉5,化Cl10。
[0023] 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L)，為合成培養(yǎng)基：葡萄糖60,蛋白腺6,酵母粉12，，