一種秈稻川香29b成熟胚愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域。設(shè)及適用于=系釉型雜交水稻親 本川香29B成熟胚愈傷組織的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系由于操作簡單、T-DNA插入到基因組的拷貝數(shù)低、可W 轉(zhuǎn)化大片段DNA等優(yōu)點，已成為基因遺傳轉(zhuǎn)化的常規(guī)手段廣泛應(yīng)用于水稻基因功能研究和 分子育種中。水稻的胚性愈傷組織是農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的良好受體，其組培特性的好壞將直 接決定農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻遺傳轉(zhuǎn)化能否成功。釉稻和梗稻是栽培稻的兩個亞種，大多數(shù)梗稻 品種組培特性較好，愈傷組織誘導(dǎo)容易、增殖速度快、耐繼代培養(yǎng)能力強、分化再生率高。許 多梗稻品種已經(jīng)建立成熟的組培體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系。而栽培面積廣的大多數(shù)釉稻品種具 有不良的組培特性，其表現(xiàn)為愈傷組織誘導(dǎo)率和再生率低，后續(xù)繼代培養(yǎng)中容易褐化，使得 釉稻遺傳轉(zhuǎn)化效率低，有的品種甚至難W進行轉(zhuǎn)化，目前，雖然少數(shù)釉稻品種已經(jīng)建立穩(wěn)定 的組織培養(yǎng)體系和轉(zhuǎn)化體系，但由于不同品種釉稻之間組培特性差別較大，不能適用于大 多數(shù)釉稻品種。高效、廣泛適用的釉稻組織培養(yǎng)體系和轉(zhuǎn)化體系尚未建立，特別是在生產(chǎn)上 有廣泛應(yīng)用價值的釉稻品種存在組織培養(yǎng)困難、遺傳轉(zhuǎn)化效率低等問題，極大地阻礙了釉 稻基因功能研究和基因的利用，因此，探索具有重要應(yīng)用價值的某類或每種釉稻品種最適 的培養(yǎng)基和方法，W及遺傳轉(zhuǎn)化方法具有重要理論和實踐意義，
[0003] 川香29B是優(yōu)質(zhì)釉型香稻保持系，其母本為川香29A具有開花習性好，異交結(jié)實率 高，抗病性強，米質(zhì)優(yōu)良且有香味等特點，利用川香29A已成功配制十多個雜交稻品種或組 合。該品種具有許多優(yōu)良農(nóng)藝性狀，也是水稻重要農(nóng)藝性狀相關(guān)基因和香味基因定位研究 重要材料，我們系統(tǒng)地研究分析了培養(yǎng)基成分、激素、凝膠種類、碳源種類和濃度對生產(chǎn)上 廣泛應(yīng)用的優(yōu)質(zhì)釉稻品種川香29B成熟胚愈傷組織培養(yǎng)的影響，探索出的適合于川香29B的 植物組織培養(yǎng)基和方法，所獲得的愈傷組織質(zhì)量好、生長快、再生分化效率高(達90%)。在 此基礎(chǔ)上研究了農(nóng)桿菌的濃度、乙酷下酷酬的濃度等因素對遺傳轉(zhuǎn)化的影響，轉(zhuǎn)化效率可 提高到26% W上，獲得了非常理想的結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供了一種釉稻川香29B成熟胚愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其中 包括愈傷誘導(dǎo)、繼代和分化、遺傳轉(zhuǎn)化過程，所誘導(dǎo)愈傷誘導(dǎo)率高、質(zhì)量好，繼代不易褐化， 分化效率高，在其他四種生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的釉稻品種(9311、明恢63、中9B，n-32B)中適用 性也較好，再生率為60-80 %之間，遺傳轉(zhuǎn)化效率高，可達26 % W上。
[0005] 本發(fā)明通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)。
[0006] 本發(fā)明所述的一種釉稻川香29B成熟胚愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括W下步驟：
[0007] 1)篩選適合于釉稻川香29B成熟胚組織培養(yǎng)的基本成分，命名為醒L培養(yǎng)基。
[000引 大量元素：KN03(2.83g/L) ;KH2P04(0.4g/L) ;MgS04 ? 7出0(0.185g/L)CaCl2 (0.125g/L);(NH4)2S04(0.463g/L)。
[0009] 微量元素：1(1(0.83111邑/1);曲8〇3(6.2111邑/1);]\1115〇4.4此0(22.3111邑/1);2115〇4.7此0 (8.6mg/L);Na2Mo〇4 ? 2H2〇(0.25mg/L);CuS〇4 ? 5此0(0.025mg/L);CoCl2 ?細2〇(0.025mg/ Do
[0010] 鐵鹽：FeS〇4 ? 7出0(27.8mg/L);Na2-邸TA ? 2出0(37.3mg/L)。
[0011] 有機成分:煙酸（I.Omg/L);鹽酸化唉醇(VBs) (I.Omg/L);鹽酸硫胺素(VBi) (I .Omg/ L) ;Glycine(2.0mg/L);肌醇（lOOmg/L)。
[0012] 2)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)及誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
[0013] 將釉稻成熟種子，去殼后，先用70-75%酒精浸泡Imin,然后用0.1%化Ch消毒6-8min;無菌水沖洗6次，然后將滅菌的釉稻成熟胚接入到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在26-28 °C，暗環(huán)境下培養(yǎng)一個月的時間，誘導(dǎo)愈傷組織。
[0014] 誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：在匪L培養(yǎng)基基本成分基礎(chǔ)上，添加2,4-〇3.〇111肖幾；1^-proline O.Sg/X;Glutamine O.Sg/X;水解酪蛋白0.6g/L;薦糖3〇g/X;F*h}ftagel 3.0-3.?/ L，pH 5.9。
[0015] 3)愈傷組織繼代培養(yǎng)及繼代培養(yǎng)基。
[0016] 將誘導(dǎo)出來的愈傷組織，挑取淡黃色，顆?；驂K狀的愈傷組織，接種到繼代培養(yǎng)基 中，在26°C下暗環(huán)境培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)周期為15-20天。
[0017] 繼代培養(yǎng)基配方：在NML培養(yǎng)基基本成分基礎(chǔ)上，添加2,4-〇3.〇111肖幾山-prolineO . 5g/X;Glutamine 0.5g/X;水解酪蛋白0.8g/L;麥芽糖30.0 g/X;F*h}ftagel 3.0-3.2g/L,pH 5.9O
[0018] 4)愈傷組織預(yù)培養(yǎng)及預(yù)培養(yǎng)基。
[0019] 將上述繼代2次的淡黃色顆粒狀愈傷組織，接種到預(yù)培養(yǎng)基中，在26-28°C暗培養(yǎng) 3-5天，4天為宜。
[0020] 預(yù)培養(yǎng)基配方：1/2匪L大量元素和微量元素，NML鐵鹽和有機成分，添加2，4-D3. Omg/!;水解酪蛋白0.6g/l;麥芽糖20.0 g/l;葡萄糖10.0 g/l;乙酷下酷酬(AS)200皿Ol/ レ瓊脂7.0g/L，p冊.4-5.6。
[0021 ] 5)農(nóng)桿菌浸染釉稻愈傷組織。
[0022] 將攜帶雙元載體的農(nóng)桿菌先在YEB固體培養(yǎng)基(添加相應(yīng)抗生素，如壯觀霉素、卡 那霉素等)上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落在Y邸液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-3天，收集農(nóng)桿菌，用農(nóng)桿菌 懸浮培養(yǎng)基懸浮農(nóng)桿菌至00600 = 0.1-0.2之間，用此濃度農(nóng)桿菌菌液浸染預(yù)培養(yǎng)后的愈傷 組織，常溫下浸染10-30min。
[0023] 農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基配方：1/2NML大量元素和微量元素，NML鐵鹽和有機成分，添加 2，4-D 3.Omg/!;水解酪蛋白0.6g/l;麥芽糖20.Og/l;葡萄糖10.Og/l;乙酷下酷酬(AS)20化 mol/L，pH5.2。
[0024] 6)農(nóng)桿菌和愈傷組織共培養(yǎng)。
[0025] 將浸染后的愈傷組織置于滅菌濾紙上，在超凈工作臺上開最大風力驚干60-90min，然后將愈傷組織接入到共培養(yǎng)基中，19-20°C暗環(huán)境下培養(yǎng)3天。
[0026] 共培養(yǎng)基配方：1/2匪L大量元素和微量元素，NML鐵鹽和有機成分，添加2，4-D3. Omg/!;水解酪蛋白0.6g/l;麥芽糖20.0 g/l;葡萄糖10.0 g/l;乙酷下酷酬(AS)200皿Ol/ レ瓊脂7.0g/L，p冊.4-5.6。
[0027] 7)抗性愈傷篩選。
[00%]將共培養(yǎng)后的愈傷組織先用無菌水沖洗5-6次，最后一次用含400mg/L頭抱霉素和 250mg/L的簇節(jié)青霉素浸泡10-20min，然后將愈傷置于無菌濾紙上，在超凈工作臺上開最大 風力驚干90-120min，接入到篩選培養(yǎng)基中，篩選兩次，第一次篩選培養(yǎng)基添加8g/L瓊脂作 為固化劑，培養(yǎng)條件為26-28°C暗培養(yǎng)15-20天;第二次篩選培養(yǎng)基添加3.2g/L的地ytagel 作為固化劑，培養(yǎng)條件為26-28°C暗培養(yǎng)，直至長出新的愈傷組織。
[0029] 篩選培養(yǎng)基配方：在NML培養(yǎng)基基本成分基礎(chǔ)上，添加2,4-〇3.〇111肖幾；1^-prolineO.5g/l;Glutamine 0.5g/l;水解酪蛋白0.8g/l;麥芽糖30g/l;適量的載體上抗性 標記的篩選試劑(如潮霉素50mg/L);頭抱霉素400mg/l;簇節(jié)青霉素250mg/l;瓊脂8.Og/L或 Phy1:agel 3.0-3.2g/L，抑 5.9。
[0030] 8)抗性愈傷分化。
[0031] 將篩選出的抗性愈傷接種到分化培養(yǎng)基中進行植株再生，在26-28°C下，全天24h 光照培養(yǎng)，光照強度為2000-3000LUX，一個月后分化出幼苗。
[0032] 分化培養(yǎng)基配方：NML培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，添加6-BA3.5mg/L NAAO . 4mg/L ;山梨醇 15.0肖/1;薦糖20.0肖凡;水解酪蛋白0.6肖/1;適量的載體上抗性標記的篩選試劑（如潮霉素 50mg/L);頭抱霉素400mg/l;簇節(jié)青霉素250mg/l;I%5rtagel 3.0-3.2g/L，pH 6.0
[0033] 9)幼苗生根培養(yǎng)。