專利名稱：用于鑒別水稻秈亞種生態(tài)型的引物組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于鑒別水稻秈亞種生態(tài)型的引物組合物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的糧食作物之一。中國作為亞洲栽培稻的起源地之一(Oka 1988)，擁有豐富的稻種資源。目前，國家種質(zhì)資源庫收集保存栽培稻7 萬余份，其中秈稻種質(zhì)資源占67% (ICGR CAAS 1996)。我國秈稻種植面積占水稻總面積的 70%，而且，秈稻是實現(xiàn)雜交化程度最高的水稻，雜交秈稻種植面積已占中國秈稻面積的近 80%。因此，秈稻在我國水稻研究和生產(chǎn)實踐中具有重要的地位。栽培稻的分類一直受到各國科學(xué)家的高度重視，國內(nèi)外學(xué)者相繼提出了多種分類體系。秈、粳是亞洲栽培稻遺傳分化的主流，已有了比較一致的認(rèn)識。每個亞種內(nèi)的遺傳分化及分類卻一直沒有一致的意見。進(jìn)入20世紀(jì)80年代以來，我國雜交稻產(chǎn)量徘徊不前，其中最主要的原因是親本的遺傳基礎(chǔ)狹窄，而拓寬雜交稻親本間的遺傳差異，可以在一定程度上提高組合的優(yōu)勢強度。 然而，根據(jù)不同地區(qū)的生態(tài)條件所劃分的生態(tài)類型無法有效反映親本間的遺傳差異，對雜種優(yōu)勢的預(yù)測效果不理想。另外，水稻中秈、粳亞種間雜種優(yōu)勢的利用已得到廣泛的關(guān)注， 但是，由于存在Fl代半不育等諸多問題，亞種間雜種優(yōu)勢一直難以直接利用，亞種內(nèi)不同生態(tài)類型間的雜種優(yōu)勢利用已成為育種家的共識。但是，有關(guān)合理、可行的亞種內(nèi)生態(tài)型的劃分研究較少。亞種內(nèi)不同生態(tài)型間雜種優(yōu)勢的利用已成為雜交稻進(jìn)入更高發(fā)展階段，開展超高產(chǎn)育種的一個主要方向。要進(jìn)行秈稻亞種內(nèi)不同生態(tài)型間雜種優(yōu)勢的超高產(chǎn)育種，首先要正確判別能夠反映品種間遺傳差異的生態(tài)型。然而，大量育成品種由于廣泛雜交而具有復(fù)雜的血緣，對這些品種的分類是栽培稻分類的新任務(wù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于鑒別水稻秈亞種生態(tài)型的引物組合物及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的輔助鑒別水稻秈亞種生態(tài)型的引物組合物，由rm216引物對、rm225 引物對、rm235引物對、rm25引物對、rm23引物對、rm244引物對、rm253引物對、rm267引物對、η 96引物對、rm223引物對和rm258引物對組成；所述rm216引物對為序列表的序列1所示DNA(上游引物)和序列表的序列2所示DNA(下游引物)組成的引物對；所述rm225引物對為序列表的序列3所示DNA(上游引物)和序列表的序列4所示DNA(下游引物)組成的引物對；所述rm235引物對為序列表的序列5所示DNA(上游引物)和序列表的序列6所示DNA(下游引物)組成的引物對；所述rm25引物對為序列表的序列7所示DNA (上游引物)和序列表的序列8所示DNA (下游引物)組成的引物對；所述rm23引物對為序列表的序列9所示DNA (上游引物)和序列表的序列10所示DNA (下游引物)組成的引物對；所述rm244引物對為序列表的序列11所示DNA(上游引物)和序列表的序列12所示DNA(下游引物)組成的引物對；所述rm253弓丨物對為序列表的序列13所示DNA (上游引物)和序列表的序列14所示DNA (下游引物)組成的引物對；所述rm267引物對為序列表的序列15所示DNA (上游引物)和序列表的序列16 所示DNA(下游引物)組成的引物對；所述η 96引物對為序列表的序列17所示DNA(上游引物)和序列表的序列18所示DNA (下游引物)組成的引物對；所述rm223引物對為序列表的序列19所示DNA (上游引物)和序列表的序列20所示DNA (下游引物)組成的引物對；所述rm258引物對為序列表的序列21所示DNA(上游引物)和序列表的序列22所示 DNA(下游引物)組成的引物對。所述水稻秈亞種生態(tài)型可為早秈生態(tài)型、中間型生態(tài)型或晚秈生態(tài)型。所述引物組合物中的每條引物在合成時，可以引入各種標(biāo)記，如熒光標(biāo)記。所述引物組合物可用于輔助鑒別水稻秈亞種生態(tài)型。所述水稻秈亞種生態(tài)型可為早秈生態(tài)型、中間型生態(tài)型或晚秈生態(tài)型。所述的引物組合物可用于制備輔助鑒別水稻秈亞種生態(tài)型的試劑盒。所述水稻秈亞種生態(tài)型可為早秈生態(tài)型、中間型生態(tài)型或晚秈生態(tài)型。本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒別水稻秈亞種生態(tài)型的試劑盒，含有所述引物組合物。 所述水稻秈亞種生態(tài)型可為早秈生態(tài)型、中間型生態(tài)型或晚秈生態(tài)型。所述試劑盒中，還可包括用于提取基因組DNA的試劑和/或用于PCR擴(kuò)增的試劑。所述試劑盒中的各個組分可為液體，也可為凍干粉。本發(fā)明還保護(hù)一種應(yīng)用所述引物組合物輔助鑒別水稻秈亞種生態(tài)型的方法，所述水稻秈亞種生態(tài)型可為早秈生態(tài)型、中間型生態(tài)型或晚秈生態(tài)型，所述方法包括如下步驟(1)以待測水稻的基因組DNA為模板，分別用所述rm216引物對、所述rm225弓丨物對、所述rm235引物對、所述rm25引物對、所述rm23引物對、所述rm244弓丨物對、所述rm253 引物對、所述rm267引物對、所述η 96引物對、所述rm223引物對和所述rm258引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；(2)檢測采用各個所述引物對得到的所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，按照如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行賦值采用所述RM216引物對，如果得到130bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm216_130 = 1，如果沒有得到130bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm216_130 = 0 ；采用所述rm225引物對，如果得到146bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm225_146 = 1，如果沒有得至Ij 146bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm225_146 = 0 ；采用所述rm235引物對，如果得到IMbp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm235_lM = 1，如果沒有得至Ij 124bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm235_124 = 0 ；采用所述rm25引物對，如果得到148bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm25_148 = 1，如果沒有得到148bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm25_148 = 0 ；采用所述rm223引物對，如果得到147bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm223_147 = 1，如果沒有得至Ij 147bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm223_147 = 0 ；采用所述rm23引物對，如果得到134bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm23_134 = 1，如果沒有得到134bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm23_134 = 0 ；采用所述rm244引物對，如果得到152bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、η 44_152 = 1，如果沒有得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、ηι 44_152 = 0 ；采用所述rm258引物對，如果得到122bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm258_122 = 1，如果沒有得到122bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm258_122 = 0 ；采用所述rm244引物對，如果得到151bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、η 44_151 = 1，如果沒有得到151bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、ηι 44_151 = 0 ；采用所述rm253引物對，如果得到140bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm253_140 = 1，如果沒有得至Ij 140p的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm253_140 = 0 ；采用所述rm267引物對，如果得到156bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、η 67_156 = 1，如果沒有得至Ij 156ρ的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm267_156 = 0 ；采用所述rm296引物對，如果得到118bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、η 96_118 = 1，如果沒有得到118ρ的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、ηι 96_118 = 0 ；采用所述rm23引物對，如果得到144bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm23_144 = 1，如果沒有得到144p的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm23_144 = 0 ；(3)將步驟⑵得到的各個賦值代入如下判別式a = (0. 6*rm216_130+0. 59*rm225_146+0. 91*rm235_124+0.74*rm25_148)/ (0. 6+0. 59+0. 91+0. 74)；b = (l*rm223_147 + 0. 67*rm23_134+0. 51*rm244_152 + l*rm258_122) / (1+0. 67+0. 51+1)；c = (0. 6*rm244_151+0. 64*rm253_140+0. 7*rm267_156+0. 61*rm296_118+0. 67*r m23_144)/(0. 6+0. 64+0. 7+0. 61+0. 67)。對于該水稻品種，如果a > b且a > c，待測水稻為候選的早秈稻生態(tài)型；對于該水稻品種，如果b > a且b > C，待測水稻為候選的中間型生態(tài)型；對于該水稻品種，如果c > a且c > b，待測水稻為候選的晚秈稻生態(tài)型。采用所述rm216引物對進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的退火溫度具體可為48°C。采用所述 rm225引物對進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的退火溫度具體可為48°C。采用所述rm235引物對進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的退火溫度具體可為50°C。采用所述rm25引物對進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的退火溫度具體可為50°C。采用所述rm23引物對進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的退火溫度具體可為48°C。采用所述rm244引物對進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的退火溫度具體可為48°C。采用所述rm253引物對進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的退火溫度具體可為48°C。采用所述η 67引物對進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的退火溫度具體可為50°C。采用所述η 96引物對進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的退火溫度具體可為46°C。采用所述rm223引物對進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的退火溫度具體可為50°C。采用所述 rm258引物對進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的退火溫度具體可為48°C。采用所述各個引物對進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系均可為如下15μ 1體系 所述基因組 DNAQOng/μ 1)2. 5 μ 1，Taq polymerase (5u/ μ 1) 0. 18 μ 1,10 X Buffer 1· 5μ 1，MgCl2 (15mM/μ 1)1. 5 μ 1，所述上游引物(66ng/μ 1) 0. 7 μ 1，所述下游引物(66ng/ μ 1)0. 7 μ 1, dNTP(10mM/y 1)0. 18 μ 1, H2O 7. 74μ1。實施例中采用的是 15ul PCR 反應(yīng)體系，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將反應(yīng)體系擴(kuò)大或縮小，也可以將引物含量增多或減少。采用所述各個引物對進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序均可如下95°C預(yù)變性5分鐘； 95°C變性30秒，采用所述退火溫度退火1分鐘，72 °C延伸1分鐘30秒，30個循環(huán)；72°C延
7伸10分鐘。檢測采用各個所述引物對得到的所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物方法可為所述方法中可采用變性膠聚丙烯酰胺凝膠電泳。所述電泳中，優(yōu)選采用銀染法染色。檢測采用各個所述引物對得到的所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法具體可為將所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行8%聚丙烯酰胺變性凝膠電泳(優(yōu)選采用70W恒功率進(jìn)行電泳)，然后進(jìn)行銀染染色。檢測采用各個所述引物對得到的所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法具體可為將所述PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。所述方法中，可采用CTAB法提取待測水稻的基因組DNA。所述方法中，用于提取所述基因組DNA的水稻材料可為新鮮的，也可為干品。本發(fā)明基于水稻秈亞種內(nèi)的3種生態(tài)型的DNA序列差異，提供了引物組合物，可用于水稻秈亞種中三種生態(tài)型的鑒定。基于所述引物組合物，本發(fā)明的發(fā)明人還提出了秈稻 3種主要生態(tài)型的典型特征等位變異及判別關(guān)系式。本發(fā)明采用4 個水稻樣本對本發(fā)明的引物組合物和方法進(jìn)行了驗證。所選用的材料有很好的代表性，為用SSR標(biāo)記進(jìn)行品種鑒別研究提供了很好的平臺。與傳統(tǒng)利用表型的鑒別方法相比，本發(fā)明提供的方法極大的縮短了鑒別時間；僅用秈稻各生態(tài)型特征等位變異，在苗期就可以完成鑒別，無需田間大面積種植，無鑒別時間限制和環(huán)境影響，省時省力，是一種簡單、快速、穩(wěn)定的鑒別水稻秈亞種內(nèi)各生態(tài)型的方法。本發(fā)明具有快捷高效、靈敏度高、分辨力好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點，適用于水稻品種的鑒定、水稻育種以及植物進(jìn)化研究等方面的應(yīng)用。本發(fā)明利用分子標(biāo)記系統(tǒng)分析稻種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)、演化，通過對秈稻種質(zhì)資源的SSR分析，提出了秈稻亞種內(nèi)的分類體系，為研究秈亞種內(nèi)的生態(tài)型的鑒別方法奠定了基礎(chǔ)，具有重要的理論意義和實踐價值，對水稻分類及雜種優(yōu)勢的利用具有重要意義。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。實施例1、引物組合物的制備各條引物的核苷酸序列如下rm216引物對(退火溫度為48°C )上游引物5，-gcatggccgatggtaaag-3'(序列表的序列1)；下游引物5，-tgtataaaaccacacggcca-3，(序列表的序列2)；rm225引物對(退火溫度為48°C )上游引物5，-tgcccatatggtctggatg-3，(序列表的序列3)；下游引物5，-gaaagtggatcaggaaggc-3，(序列表的序列4)；rm235引物對(退火溫度為50°C )上游引物5，-agaagctagggctaacgaac-3，(序列表的序列5)；下游引物5’-tcacctggtcagcctctttc-3’(序列表的序列 6)；rm25引物對(退火溫度為50°C )
上游引物5，-ggaaagaatgatcttttcatgg-3‘(序列表的序列7)；下游弓丨物5，-ctaccatcaaaaccaatgttc-3，(序列表的序列 8)；rm23引物對(退火溫度為48°C )上游引物:5，-cattggagtggaggctgg-3，(序列表的序列9)；下游引物:5，-gtcaggcttctgccattctc-3，(序列表的序列10)；rm244引物對(退火溫度為48°C )上游引物5，-ccgactgttcgtccttatca-3，(序列表的序列11)；下游引物5’-ctgctctcgggtgaacgt-3，(序列表的序列 12)；rm253引物對(退火溫度為48°C )上游引物5，-tccttcaagagtgcaaaacc-3，(序列表的序列13)；下游引物:5，-gcattgtcatgtcgaagcc-3，(序列表的序列14)；rm267引物對(退火溫度為50°C )上游引物5，-tgcagacatagagaaggaagtg-3，(序列表的序列15)；下游引物5，-agcaacagcacaacttgatg-3，(序列表的序列16)；rm296引物對(退火溫度為46°C )上游引物5，-cacatggcaccaacctcc-3‘(序列表的序列1了)；下游引物5，-gccaagtcattcactact-3，(序列表的序列18)；rm223引物對(退火溫度為50°C )上游引物5，-gagtgagcttgggctgaaac-3‘(序列表的序列I9)；下游引物5，-gaaggcaagtcttggcactg-3‘(序列表的序列2O)；rm258引物對(退火溫度為48°C )上游引物5，-tgctgtatgtagctcgcacc-3，(序列表的序列21)；下游引物:5，-tggccttaaagctgtcgc-3，(序列表的序列22)；分別合成以上各條引物，以上各條引物組成引物組合物，各條引物單獨包裝。實施例2、引物組合物的應(yīng)用428份水稻材料均屬于秈稻亞種，均獲自于中國國家作物種質(zhì)資源庫，表2中所列統(tǒng)一編號為每份材料在中國國家作物種質(zhì)資源庫的統(tǒng)一編號(參見http://iCgr. caas. net. cn/) 0張冬玲等Q009)利用SSR標(biāo)記和中國稻種資源初級核心種質(zhì)分析遺傳結(jié)構(gòu)和地理演化，將秈亞種分為早秈生態(tài)型、晚秈生態(tài)型和中間型生態(tài)型三個生態(tài)型(^iang Dongling, Zhang Hongliang, Wang Meixing, Sun Junli, Qi Yongwen, Wang Fengmei, Wei Xinghua,Han Longzhi,Wang Xiangkun,Li Zichao. The Hierarchical Genetic Structure and Differentiation of Oryza sativa L. in China Revealed by MicrosatelIites. Theor Appl Genet 2009116(6) :1105-1117)。依照文獻(xiàn)的劃分標(biāo)準(zhǔn)，4 份水稻材料中，早秈生態(tài)型品種157份、中間型生態(tài)型品種99份、晚秈生態(tài)型品種172份。應(yīng)用實施例1制備的引物組合物分別鑒定4 份水稻材料，步驟如下一、CTAB法提取水稻的基因組DNA(1)稱取0. 4g-0. 5g的新鮮葉片，在研缽中加入液氮迅速研磨粉碎，然后轉(zhuǎn)入 1. 5ml的無菌離心管中。
(2)每管加入預(yù)熱65°C的CTAB提取緩沖液(pH8. 0) 700 μ 1 (配方見表1)，65°C水浴30分鐘，每隔5分鐘取出搖勻一次。(3)加入400 μ 1氯仿/異戊醇04 1)輕柔混搖10分鐘，然后12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。(4)取上清液轉(zhuǎn)入另一 1.5ml的無菌離心管中，加入300 μ 1氯仿/異戊醇 (24 1)輕柔混搖10分鐘，然后以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘；(5)將上清液再次轉(zhuǎn)入新的1. 5ml的無菌離心管中，加入等體積的預(yù)冷的(_20°C ) 異丙醇和1/10體積的預(yù)冷的(_20°C)乙酸鈉(pH = 5. 2)，將離心管上下顛倒數(shù)次，置于-20°C冰箱30分鐘以上。(6)將離心管以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取沉淀。(7) 70%乙醇漂洗沉淀兩次，無水乙醇漂洗一次，離心后，小心去掉乙醇。(8)晾干或風(fēng)干后加入滅菌水溶解，使終濃度達(dá)到20ng/y 1，備用。表1提取緩沖液的配方(1000ml) pH = 8.0
權(quán)利要求
1.輔助鑒別水稻秈亞種生態(tài)型的引物組合物，由rm216引物對、rm225引物對、rm235 引物對、rm25引物對、rm23引物對、rm244引物對、rm253引物對、η 67引物對、rm296引物對、rm223引物對和rm258引物對組成；所述rm216引物對為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述rm225引物對為序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對；所述rm235引物對為序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA組成的引物對；所述rm25引物對為序列表的序列7所示DNA和序列表的序列8所示DNA組成的引物對；所述rm23引物對為序列表的序列9所示DNA和序列表的序列10所示DNA組成的引物對；所述rm244引物對為序列表的序列11所示DNA和序列表的序列12所示DNA組成的引物對；所述rm253引物對為序列表的序列13所示DNA和序列表的序列14所示DNA組成的引物對；所述rm267引物對為序列表的序列15所示DNA和序列表的序列16所示DNA組成的引物對；所述η 96引物對為序列表的序列17所示DNA和序列表的序列18所示DNA組成的引物對；所述rm223引物對為序列表的序列19所示DNA和序列表的序列20所示DNA 組成的引物對；所述rm258引物對為序列表的序列21所示DNA和序列表的序列22所示DNA 組成的引物對。
2.如權(quán)利要求1所述引物組合物，其特征在于所述水稻秈亞種生態(tài)型為早秈生態(tài)型、 中間型生態(tài)型或晚秈生態(tài)型。
3.權(quán)利要求1所述引物組合物在輔助鑒別水稻秈亞種生態(tài)型中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述水稻秈亞種生態(tài)型為早秈生態(tài)型、中間型生態(tài)型或晚秈生態(tài)型。
5.權(quán)利要求1所述的引物組合物在制備輔助鑒別水稻秈亞種生態(tài)型的試劑盒中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述水稻秈亞種生態(tài)型為早秈生態(tài)型、中間型生態(tài)型或晚秈生態(tài)型。
7.一種輔助鑒別水稻秈亞種生態(tài)型的試劑盒，含有權(quán)利要求1所述的引物組合物。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述水稻秈亞種生態(tài)型為早秈生態(tài)型、中間型生態(tài)型或晚秈生態(tài)型。
9.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述引物組合物輔助鑒別水稻秈亞種生態(tài)型的方法，包括如下步驟(1)以待測水稻的基因組DNA為模板，分別用所述rm216引物對、所述rm225引物對、 所述rm235引物對、所述rm25引物對、所述rm23引物對、所述η 44引物對、所述rm253引物對、所述rm267引物對、所述η 96引物對、所述rm223引物對和所述rm258引物對進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；(2)檢測采用各個所述引物對得到的所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，按照如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行賦值采用所述RM216引物對，如果得到130bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm216_130 = 1，如果沒有得到 130bp 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物、rm216_130 = 0 ；采用所述rm225引物對，如果得到146bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm225_146 = 1，如果沒有得到 146bp 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物、rm225_146 = 0 ；采用所述rm235引物對，如果得到IMbp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm235_124 = 1，如果沒有得到 124bp 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物、rm235_124 = 0 ；采用所述rm25引物對，如果得到148bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm25_148 = 1，如果沒有得到 148bp 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物、rm25_148 = 0 ；采用所述rm223引物對，如果得到147bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm223_147 = 1，如果沒有得到 147bp 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物、rm223_147 = 0 ；采用所述rm23引物對，如果得到134bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm23_134 = 1，如果沒有得到 134bp 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物、rm23_134 = 0 ；采用所述rm244引物對，如果得到152bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、η 44_152 = 1，如果沒有得到 152bp 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物、ηι 44_152 = 0 ；采用所述rm258引物對，如果得到122bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm258_122 = 1，如果沒有得到 122bp 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物、rm258_122 = 0 ；采用所述rm244引物對，如果得到151bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、η 44_151 = 1，如果沒有得到 151bp 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物、ηι 44_151 = 0 ；采用所述rm253引物對，如果得到140bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm253_140 = 1，如果沒有得到 140p 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物、rm253_140 = 0 ；采用所述rm267引物對，如果得到156bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、η 67_156 = 1，如果沒有得到 156ρ 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物、rm267_156 = 0 ；采用所述rm296引物對，如果得到118bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、η 96_118 = 1，如果沒有得到 118ρ 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物、ηι 96_118 = 0 ；采用所述rm23引物對，如果得到144bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、rm23_144 = 1，如果沒有得到 144p 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物、rm23_144 = 0 ；(3)將步驟( 得到的各個賦值代入如下判別式a = (0.6*rm216_130+0. 59*rm225_146+0. 91*rm235_124+0. 74*rm25_148)/ (0. 6+0. 59+0. 91+0. 74)；b = (l*rm223_147+0.67*rm23_l34+0.51*rm244_152+1*rm258_122)/ (1+0. 67+0. 51+1)；c = (0.6*rm244_151+0. 64*rm253_140+0. 7*rm267_156+0. 61*rm296_l18+0. 67打 m23_144)/(0. 6+0. 64+0. 7+0. 61+0. 67)。對于該水稻品種，如果a > b且a > c，待測水稻為候選的早秈稻生態(tài)型； 對于該水稻品種，如果b > 3且13 > c，待測水稻為候選的中間型生態(tài)型； 對于該水稻品種，如果c > a且c > b，待測水稻為候選的晚秈稻生態(tài)型； 所述水稻秈亞種生態(tài)型為早秈生態(tài)型、中間型生態(tài)型或晚秈生態(tài)型。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于采用所述rm216引物對進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為48°C ；采用所述rm225引物對進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為48°C ；采用所述rm235引物對進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為50°C;采用所述rm25引物對進(jìn)行所述PCR 擴(kuò)增的退火溫度為50°C;采用所述rm23引物對進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為48°C;采用所述rm244引物對進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為48°C ；采用所述rm253引物對進(jìn)行所述 PCR擴(kuò)增的退火溫度為48°C;采用所述rm267引物對進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為50°C; 采用所述η 96引物對進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為46°C ；采用所述rm223引物對進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為50°C ；采用所述rm258引物對進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為 48 "C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于鑒別水稻秈亞種生態(tài)型的引物組合物及其應(yīng)用。所述引物組合物由如下引物對組成序列1和2所示DNA組成rm216引物對、序列3和4所示DNA組成rm225引物對、序列5和6所示DNA組成rm235引物對、序列7和8所示DNA組成rm25引物對、序列9和10所示DNA組成rm23引物對、序列11和12所示DNA組成rm244引物對、序列13和14所示DNA組成rm253引物對、序列15和16所示DNA組成rm267引物對、序列17和18所示DNA組成rm296引物對、序列19和20所示DNA組成rm223引物對、序列21和22所示DNA組成rm258引物對。該引物組合物可用于水稻秈亞種生態(tài)型鑒定，具有快捷高效、靈敏度高、分辨力好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK102296123SQ20111027184
公開日2011年12月28日 申請日期2011年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月14日
發(fā)明者宋立瑩, 張冬玲, 張洪亮, 李自超, 王鳳梅, 王美興, 馬占峰 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)