本發(fā)明涉及一種青蚶線粒體cytochromecoxidasesubuniti(coi)基因擴(kuò)增引物的篩選方法，屬于漁業(yè)相關(guān)的基因生物信息分析學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

青蚶(barbatiavirescens)隸屬于軟體動(dòng)物門(mollusca)、雙殼綱(bivalvia)、列齒目(taxodonta)、蚶科(arcidae)、須蚶屬(barbatia)，主要分布于我國(guó)浙江嵊山以南至海南沿海，日本、越南、菲律賓等國(guó)也有分布。青蚶主要棲息于潮間帶到數(shù)十米深的淺水區(qū)，以足絲附著于巖礁縫隙中。青蚶作為蚶科貝類中的經(jīng)濟(jì)品種，肉味鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，具有較大的養(yǎng)殖開發(fā)潛力。青蚶作為沿海生態(tài)系統(tǒng)中的濾食性物種，在海岸生態(tài)系統(tǒng)的綜合功能中具有重要作用，同時(shí)也是我國(guó)重要的漁業(yè)資源之一。

然而，由于我國(guó)近年來(lái)不斷增長(zhǎng)的海產(chǎn)品需求，導(dǎo)致過度捕撈和棲息地被破壞，青蚶的自然資源量持續(xù)下降，野生種群已難以采集。因此，對(duì)青蚶的自然資源的保護(hù)，以及對(duì)其遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的研究迫在眉睫。目前對(duì)于青蚶的研究相對(duì)較少，僅在青蚶的人工育苗、精子超微結(jié)構(gòu)、血紅蛋白亞基結(jié)構(gòu)等方面有報(bào)道，基于分子標(biāo)記的遺傳多樣性的研究還未見報(bào)道，這種現(xiàn)狀極大的阻礙了對(duì)青蚶種質(zhì)資源的開發(fā)利用和保護(hù)。

線粒體脫氧核糖核酸(mitochondrialdna，即mtdna)因其單親遺傳、進(jìn)化速度快、核苷酸替代率高、分子量小，已作為一種重要的分子標(biāo)記，廣泛應(yīng)用于群體遺傳學(xué)和系統(tǒng)發(fā)生的研究中。其中，線粒體細(xì)胞色素c氧化酶i（cytochromecoxidasesubuniti,coi）基因作為進(jìn)化速率相對(duì)較快的區(qū)域，在無(wú)脊椎動(dòng)物系統(tǒng)分類、種類鑒別、群體遺傳多樣性和分子進(jìn)化方面得到廣泛應(yīng)用。folmer等(1994)設(shè)計(jì)的coi基因擴(kuò)增引物（coil-1490和coih-2198）是目前在無(wú)脊椎動(dòng)物中廣泛使用的通用引物。然而，該通用引物在青蚶群體中擴(kuò)增效率低，大部分個(gè)體無(wú)法獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。

因此，開發(fā)適用性好、擴(kuò)增效率高的青蚶coi基因擴(kuò)增引物將為青蚶種質(zhì)資源的保護(hù)和利用以及遺傳多樣性評(píng)估奠定重要基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種青蚶線粒體coi基因擴(kuò)增引物，另一目的是提供該引物的篩選方法，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取的具體技術(shù)方案為：

一種青蚶線粒體coi基因擴(kuò)增引物，該引物序列為：

coiq-f：5’-tcatattcggctaaatctt-3’，

coiq-r：5’-catctttccacacctcaa-3’。

上述青蚶線粒體coi基因擴(kuò)增引物的篩選方法，包括以下步驟：

1、下載已有的青蚶線粒體coi序列；

2、將下載的青蚶線粒體coi序列比對(duì)分析，確定序列兩端保守區(qū)域；

3、在確定的保守區(qū)域設(shè)計(jì)多對(duì)引物，并進(jìn)行合成；

4、提取青蚶dna，分別與合成的多對(duì)引物在反應(yīng)體系下進(jìn)行pcr反應(yīng)；

5、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，篩選出條帶單一、擴(kuò)增效率最高的一對(duì)引物coiq-f和coiq-r：

coiq-f為5’-tcatattcggctaaatctt-3’，

coiq-r為5’-catctttccacacctcaa-3’。

進(jìn)一步的，上述步驟1中通過登陸美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation，ncbi)的dna序列數(shù)據(jù)庫(kù)（genbank）進(jìn)行青蚶線粒體coi序列的下載。

進(jìn)一步的，上述步驟2中利用mega6.0軟件進(jìn)行對(duì)比。

進(jìn)一步的，上述步驟3中利用引物設(shè)計(jì)軟件primerpremier5。

進(jìn)一步的，上述步驟4中反應(yīng)體系為：100ng模板dna，0.25utaq聚合酶，1×pcrbuffer，0.2mmdntps，1.5mmmgcl2，引物各1μm。pcr擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，48℃退火溫度30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果：

本發(fā)明篩選出一對(duì)用于擴(kuò)增青蚶線粒體部分coi基因序列的引物coiq-f和coiq-r，并確定了其反應(yīng)體系和pcr擴(kuò)增條件，經(jīng)檢測(cè)證明該引物具有條帶單一、擴(kuò)增效率高的特點(diǎn)，且其擴(kuò)增效率高達(dá)94％，能夠滿足青蚶遺傳多樣性分析的需要。

具體實(shí)施方式

以下通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步解釋和說明。

本實(shí)施例選用50例青蚶，福建霞浦28例，廣東陽(yáng)江22例。

本實(shí)施例通過以下步驟篩選青蚶線粒體coi基因的擴(kuò)增引物：

1、登陸美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(ncbi，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，下載已有的12條青蚶線粒體coi序列(genbank登錄號(hào)為：kj774469，ku341920-341927，hq258840-258841)。

2、用序列處理軟件mega6.0對(duì)上述序列進(jìn)行多重比對(duì)分析，確定出前后端比較保守的區(qū)域。

3、經(jīng)比對(duì)后，在前后端各100個(gè)堿基對(duì)的較保守區(qū)域內(nèi)，用引物設(shè)計(jì)軟件primerpremier5設(shè)計(jì)引物。設(shè)計(jì)的多對(duì)引物交由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

4、用苯酚-氯仿法對(duì)兩個(gè)野生群體的青蚶共50個(gè)個(gè)體進(jìn)行dna提取，經(jīng)檢測(cè)dna無(wú)明顯降解，后加稀釋為100ng/μl的工作液備用。

5、在10μlpcr反應(yīng)體系中用合成的多對(duì)引物分別擴(kuò)增50個(gè)青蚶個(gè)體的coi基因片段，該體系為：100ng模板dna，0.25utaq聚合酶(takara)，1×pcrbuffer，0.2mmdntps，1.5mmmgcl2，引物各1μm。pcr擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，48℃退火溫度30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。

擴(kuò)增出的產(chǎn)物用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，篩選出條帶單一，擴(kuò)增效率高的一對(duì)引物coiq-f和coiq-r。該引物的coi基因擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度約600bp，50個(gè)個(gè)體中47個(gè)個(gè)體成功擴(kuò)增，明亮條帶，擴(kuò)增效率為94％。

再利用abiprism3130測(cè)序儀(appliedbiosystems)雙向測(cè)序。測(cè)序所得序列用seqman軟件拼接，與已有的12條青蚶coi序列進(jìn)行多重比對(duì)分析，確定所得序列為青蚶線粒體coi基因序列：

coiq-f為5’-tcatattcggctaaatctt-3’，

coiq-r為5’-catctttccacacctcaa-3’。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對(duì)本發(fā)明作其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化和改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。

sequencelisting

<110>中國(guó)海洋大學(xué)

<120>一種青蚶線粒體coi基因的擴(kuò)增引物

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>coiq-f

<400>1

tcatattcggctaaatctt19

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>coiq-r

<400>2

catctttccacacctcaa18