專利名稱：：滅活的流感疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及滅活的佐劑流感疫苗。
背景技術(shù)：
：流感病毒為能夠感染鳥類和哺乳動(dòng)物的正粘病毒(Orthomyxoviridae)科(流感病毒)的RNA病毒。流感病毒具有RNA的8段反義單鏈(節(jié)段)RNA的節(jié)段基因組(segmentedgenome)，縮寫為PB2，PB1，PA，HA，NP，NA，M和NS。這些節(jié)段編碼10個(gè)基因。HA節(jié)段編碼血細(xì)胞凝集素蛋白，其為在病毒顆粒的蛋白質(zhì)外殼(病毒包膜)中發(fā)現(xiàn)的抗原性蛋白。所述蛋白參與病毒的細(xì)胞進(jìn)入。NA節(jié)段編碼神經(jīng)氨酸酶，其為也在流感病毒顆粒的表面上發(fā)現(xiàn)的抗原性糖基化酶。其促進(jìn)子代病毒從感染細(xì)胞的釋放。存在3種流感病毒A、B、和C。人類能夠被A、B和C型流感病毒感染。A型流感病毒基于兩種主要的糖蛋白血細(xì)胞凝集素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)被進(jìn)一步分類為亞型。對(duì)于B和C型流感尚未鑒定出不同的H和N亞型。對(duì)于A型流感病毒存在16種已知的HA亞型和9種已知的NA亞型。例如，“H5m”病毒具有屬于亞型5的HA蛋白和屬于亞型1的NA蛋白。目前全世界在人們中傳播的A型流感亞型包括H1N1、H1N2和H3N2病毒。然而，已經(jīng)報(bào)道人類被其它亞型感染，例如H9N2、H7N7或H2N2，引起發(fā)病和死亡。B型流感病毒不進(jìn)一步分類，盡管描述了兩種獨(dú)特的基因和抗原性世系(維多利亞(Victoria)和亞馬它達(dá)(Yamagata))。在流感病毒中存在兩種類型的抗原性變異，稱為"抗原性漂移(antigenicdrift)"和“抗原性轉(zhuǎn)變(antigenicshift)，，。抗原性漂移為連續(xù)出現(xiàn)的新流感菌株的一部分，所述新流感菌株與其祖先的不同之處在于HA和NA基因中的突變(點(diǎn)突變)。改變的量可以為微小的或顯著的?？乖宰儺惖牡诙愋蜑椤乖赞D(zhuǎn)變”。當(dāng)共感染相同宿主的兩種不同的流感病毒，交換全基因組節(jié)段時(shí)，能夠發(fā)生基因轉(zhuǎn)變。這能夠?qū)е戮哂行禄蛐亲?geneconstellation)并因此具有新性質(zhì)的“重排”病毒。當(dāng)病毒亞型在中間宿主中不經(jīng)重排直接跨越種間屏障時(shí)，也能夠發(fā)生基因轉(zhuǎn)變?？乖赞D(zhuǎn)變的發(fā)生可能引起基因改變，使新的流感病毒能夠在人類中復(fù)制以及更重要的是有效地在人類中傳播。當(dāng)此類病毒具有人類群體對(duì)其免疫學(xué)上幼稚(naYve)的亞型時(shí)，可能發(fā)生大流行病。在過(guò)去的世紀(jì)中發(fā)生了3次流感大流行病，其中1918年的西班牙流感是最嚴(yán)重的。此次大流行在全世界殺死了約50百萬(wàn)人。由于在亞洲、歐洲和非洲在家禽群體中的持續(xù)爆發(fā)和相當(dāng)量的人類病例(317，dd29June2007)(其中60%是致命的)，目前禽流感(H5N1)具有日益增長(zhǎng)的全世界關(guān)注。該病毒是高度傳染性的并且超過(guò)200百萬(wàn)家禽已經(jīng)被挑出殺死或死于隨后的感染。到目前為3止人-人傳播是高度無(wú)效的，但是當(dāng)適應(yīng)時(shí)該病毒可以獲得此能力。此類事件將顯著地增加大流行病爆發(fā)上的風(fēng)險(xiǎn)。在大流行病的控制中，疫苗可以起重要作用。如果由于非易感性或抗性，通過(guò)化學(xué)或藥學(xué)產(chǎn)品(例如抗生素或抗病毒劑)，或通過(guò)衛(wèi)生措施，不能與病因的傳染源戰(zhàn)斗，控制可能甚至完全依賴于免疫接種。眾所周知在免疫接種后誘導(dǎo)的抗體在針對(duì)流感的保護(hù)上起關(guān)鍵作用。除了體液免疫性之外，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性起重要作用以消滅感染。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性的誘導(dǎo)是重要的，因?yàn)門細(xì)胞識(shí)別保守性表位，其導(dǎo)致針對(duì)不同菌株的廣泛保護(hù)。目前滅活的流行性流感疫苗用3種流感病毒菌株生產(chǎn)，該3種流感病毒菌株被世界衛(wèi)生組織基于從全球流感監(jiān)視獲得的信息每年推薦。這些疫苗的抗原通常在雞胚胎卵中生產(chǎn)。這些季節(jié)性疫苗包含15μg血細(xì)胞凝集素每菌株。由于人群對(duì)于大流行病流感菌株是免疫學(xué)上幼稚(nai've)的，劑量高得多的大流行病流感疫苗對(duì)于誘導(dǎo)保護(hù)性免疫是需要的。已經(jīng)顯示為了誘導(dǎo)針對(duì)H5m菌株的保護(hù)性免疫，需要兩劑量的90μg血細(xì)胞凝集素?？紤]到可利用的抗原的受限的量，此類高劑量是不方便的。佐劑的使用可能克服針對(duì)大流行病流感疫苗菌株的差的應(yīng)答。疫苗的組成，特別是佐劑的性質(zhì)，在免疫應(yīng)答的動(dòng)力學(xué)上起重要作用。不僅是免疫反應(yīng)的水平，而且還有免疫反應(yīng)的開始和持續(xù)受疫苗組成影響。眾所周知儲(chǔ)存性(repository)(油性)佐劑例如油包水乳液為強(qiáng)佐劑，誘導(dǎo)穩(wěn)定增加的免疫應(yīng)答，其達(dá)到高的最大水平并且持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間。另一方面，水性佐劑誘導(dǎo)快速開始的免疫性，但是通常，達(dá)到低的多的最大水平，其持續(xù)短的多的時(shí)間。為了規(guī)避不充分水平的免疫性，增強(qiáng)免疫常常在首次注射3周或更多周后給予，其顯著地延長(zhǎng)了建立免疫性所需的總時(shí)間(‘免疫時(shí)間’)。在大流行病而不是流行病的情況下，時(shí)間和生產(chǎn)能力是關(guān)鍵因素。用最小濃度的抗原，在單次注射(一次注射(one-shot))后短時(shí)間(例如1周)建立保護(hù)性免疫的疫苗，對(duì)于控制大流行病將開放機(jī)會(huì)，其將大于需要幾周或甚至用包含高濃度抗原的制劑第二次施用的產(chǎn)品的可能性。誘導(dǎo)高水平抗體并伴隨著細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性的誘導(dǎo)的疫苗可以不僅針對(duì)同源性菌株(確切的大流行病菌株)，而且針對(duì)相同亞型的異源性，或不完全匹配流感菌株保護(hù)人群。這將對(duì)潛在的大流行病爆發(fā)能夠形成甚至更及時(shí)的應(yīng)答，如使用佐劑H5N2疫苗在家禽中控制H5W爆發(fā)所例舉的。在新興大流行病的首次警報(bào)信號(hào)顯示后可以快速和大規(guī)模(劑量數(shù)量)生產(chǎn)的此類疫苗，將有利于控制。實(shí)際上，顯著地降低首次警報(bào)信號(hào)(‘出發(fā)時(shí)間(cbparturetime)’)和人類群體以充分程度被保護(hù)的情況(到達(dá)時(shí)間)之間的時(shí)間的每一和任何措施具有積極影響。因此，對(duì)于盡可能大的群體在新興大流行病過(guò)程期間盡可能早的獲得理想的大流行病疫苗，并且在盡可能多的受試者中盡可能早地建立充分水平的保護(hù)性免疫(體液和細(xì)胞)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供克服已存在的滅活的流感疫苗的許多缺點(diǎn)的疫苗。本發(fā)明提供滅活的流感疫苗，包括0丙內(nèi)酯(BPL)滅活的全流感病毒和包括作為佐劑的一種或多種單_或二糖衍生物，所述單_或二糖衍生物具有至少一個(gè)但不多于N-1個(gè)脂肪酸酯基團(tuán)和任選的，一個(gè)但不多于N-1個(gè)硫酸酯基團(tuán)，其中N為所述衍生物衍生自的單-或二糖的羥基的數(shù)量。此類佐劑描述于W00140240,HilgersL.A.，andBlomA.G.Sucrosefattyacidsulphateestersasnovelvaccineadjuvant。Vaccine24:S2_81(2006),禾口BlomA.G.,andHilgersL.A.SucrosefattyacidsulphateestersasnovelvaccineadjuvantseffectofthechemicalcompositionVaccine23:743-54(2004)。該類型的佐劑不像油性佐劑一樣形成抗原的儲(chǔ)存庫(kù)(depot)，其導(dǎo)致抗原對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的立即可用性。特別在大流行病情況下免疫性的快速開始是重要的。該佐劑優(yōu)選為CoVaccineHT。CoVaccineHT包含在亞微米的水包角鯊?fù)槿橐?squalane-in-wateremulsion)中引入的蔗糖脂肪酸硫酸酯。蔗糖脂肪酸硫酸酯的劑量為0.1至40mg。優(yōu)選地，蔗糖脂肪酸硫酸酯的劑量為0.25至10mg。最優(yōu)選，蔗糖脂肪酸硫酸酯的劑量為0.5至4mg。角鯊?fù)榈膭┝繛?.4至160mg。優(yōu)選地，角鯊?fù)榈膭┝繛?至40mg。最優(yōu)選，角鯊?fù)榈膭┝繛?至16mg。血細(xì)胞凝集素的劑量為0.1至60iig。優(yōu)選地，血細(xì)胞凝集素的劑量為0.25至15yg。最優(yōu)選，血細(xì)胞凝集素的劑量為1至3iig。CoVaccineHT刺激Thl和Th2應(yīng)答(對(duì)于誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性是重要的)二者，而例如氫氧化鋁僅給出Th2應(yīng)答。CoVaccineHT在挑戰(zhàn)感染(challengeinfection)后不誘導(dǎo)增強(qiáng)的病理。在根據(jù)本發(fā)明的疫苗中的流感病毒優(yōu)選為細(xì)胞培養(yǎng)物源的。用于在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生流感病毒的方法在本領(lǐng)域是已知的。該病毒可以在哺乳動(dòng)物、鳥類或人類起源(origen)的細(xì)胞，例如MadinDarbyCanineKidney(MDCK)，Vero,MDBK,CLDK,EBx或PerC6細(xì)胞上生長(zhǎng)。MDCK細(xì)胞在本領(lǐng)域是已知的細(xì)胞。MDCK細(xì)胞系由S.H.Madin和N.B.Darby于1958年9月上從表面上正常的成體雌性考克斯班尼犬(cockerspaniel)的腎獲得。最初的MDCK細(xì)胞系(NBL-2)保藏在ATCC(目錄編號(hào)ATCCCCL34)。MDCK細(xì)胞可以例如在轉(zhuǎn)瓶中或在微載體上，優(yōu)選在無(wú)血清介質(zhì)中粘附地生長(zhǎng)(Merten,0.ff.,etal.Productionofinfluenzavirusincellculturesforvaccinepreparation。AdvExpMedBiol.；397:141_51(1996)；Kalbfuss,B.,etal.HarvestingandconcentrationofhumaninfluenzaAvirusproducedinserum-freemammaliancellculturefortheproductionofvaccines.BiotechnologyandBioengeneering,97(2007)。MDCK細(xì)胞還可以懸浮培養(yǎng)地生長(zhǎng)(Nakamura，K.，etal.MethodofsuspensioncultureforMDCKcellsandisolationofinfluenzavirusinMDCKsuspensionculturedcells.KansenshogakuZasshi；54:306_12(1980)。用于大流行病用途的疫苗旨在保護(hù)人類抵抗具有大流行病潛力的高度病原性(禽)流感病毒的感染，例如H5m菌株。根據(jù)本發(fā)明的疫苗優(yōu)選基于H5型，特別是H5m型的滅活的流感病毒。5測(cè)試了基于流感病毒菌株NIBRG-14的疫苗，所述NIBRG-14在MDCK細(xì)胞上培養(yǎng)，用BPL滅活并且輔助有CoVaccineHT。令人驚奇的是，在雪貂(ferret)(流感疫苗的動(dòng)物模型)中單次注射該疫苗，賦予高的病毒-中和抗體滴度，表明高度的保護(hù)。以其作為人類流感疫苗的用途為目的，NIBRG-14病毒由NationallnstituteforBiologicalStandardsandControl(PottersBar，England)設(shè)計(jì)。NIBRG—14為減毒的重排病毒，包含來(lái)自A/Vietnam/1194/2004(H5m)的2個(gè)表面基因(改性的HA&NA)和來(lái)自egg-highgrowthA/PR/8/34(HlNl)的6個(gè)內(nèi)部基因。為了提高該菌株的安全性，除去了在血細(xì)胞凝集素基因中的多堿基裂解位點(diǎn)(polybasiccleavagesite)。該疫苗菌株的非病原性在胚卵、雞和雪貂中確認(rèn)。(Wood,J.M.,etal.Fromlethalvirustolifesavingvaccine:developinginactivatedvaccinesforpandemicinfluenza.NatureReviewsinMicrobiology2，842-847(2004).用于病毒生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)物(代替卵)的(組合)使用，全病毒(代替裂解物或亞單位)、BPL(代替交聯(lián)劑)、水性(代替油性)、非儲(chǔ)存性(代替儲(chǔ)存性)佐劑和/或簡(jiǎn)單的添加(代替乳化)抗原和佐劑賦予重要的優(yōu)點(diǎn)。首先，該疫苗導(dǎo)致免疫性的快速開始，其在面對(duì)大流行病威脅時(shí)是關(guān)鍵的。此外，根據(jù)本發(fā)明的疫苗更易于以更高產(chǎn)量(劑量的數(shù)量)生產(chǎn)。由于使用根據(jù)本發(fā)明的疫苗，僅需要單次注射的事實(shí)，所需的抗原的量降低。由于該疫苗誘導(dǎo)高的抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答的事實(shí)，可以獲得不僅針對(duì)同源性，而且針對(duì)異源性菌株的保護(hù)。本發(fā)明由以下給出的實(shí)施例進(jìn)一步舉例說(shuō)明。提出的試驗(yàn)顯示根據(jù)本發(fā)明的疫苗在單次免疫后達(dá)到意想不到高的HI抗體滴度。這些滴度使用比較疫苗不能夠達(dá)到，所述比較疫苗的不同之處僅在于佐劑的選擇(氫氧化鋁代替CoVaccineHT)。具體實(shí)施例方式實(shí)施例實(shí)施例1疫苗的形成流感病毒NIBRG14(H5N1))在MDCK細(xì)胞上生長(zhǎng)。發(fā)酵3_5天后，在用BPL(0.025%w/v)滅活前收獲病毒上清液并且將其澄清。滅活后，滅活的病毒通過(guò)超濾濃縮并且進(jìn)一步純化?？乖瓭舛韧ㄟ^(guò)單向免疫擴(kuò)散(SRID)分析確定。疫苗通過(guò)將病毒抗原與所需量的佐劑和/或磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)混合來(lái)配制(表1)。佐劑CoVaccineHT由CoVaccineBV(Utrecht,TheNetherlands)友情提供。實(shí)施例2在小鼠中使用CoVaccineHT輔助的細(xì)胞培養(yǎng)物源的滅活的全病毒疫苗的免疫接種/挑戰(zhàn)試驗(yàn)(challengeexperiment)試驗(yàn)設(shè)計(jì)6-8周年齡的雌性Swiss小鼠隨機(jī)分成5組(n=5)。疫苗以0.lmL通過(guò)肌肉內(nèi)(IM)注射施用至后腿。所述疫苗制劑如表1中所示。挑戰(zhàn)病毒(Challengevirus)(A/PuertoRico/8/34)(H1N1)通過(guò)將0.2mL病毒接種入9-11天大小的SPF胚卵(embryonatedSPFegg)中來(lái)生產(chǎn)。在34°C-37°C下3天孵育時(shí)間后，收獲尿囊液并將其在MDCK細(xì)胞上滴定。為了評(píng)價(jià)抗體的誘導(dǎo)，在免疫接種后24天取血液樣品。抗體滴度通過(guò)血凝抑制檢驗(yàn)來(lái)確定。抗原特異性IgGl和IgG2a抗體滴度通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)來(lái)測(cè)定。免疫接種后4周，所有動(dòng)物用小鼠適應(yīng)的(A/PuertoRico/8/34；H1N1)挑戰(zhàn)(challenge，也可稱為“攻擊”)。每天測(cè)定體重以評(píng)價(jià)針對(duì)臨床癥狀的保護(hù)。挑戰(zhàn)后12天殺死所有動(dòng)物。表1疫苗制劑組抗原(滅活的全病毒)佐劑1PBS2A/Pr/8/3470ngHA/劑量3A/Pr/8/3470ngHA/劑量氧氧化招(0.2%)(BrenntagBiosector,Denmark)4A/Pr/8/3470ngHA/劑量CoVaccineHT(2mg/劑量)(CoVaccineBV,theNetherlands)5A/Pr/8/3470ngHA/劑量CoVaccineHT(0.5mg/劑量)(CoVaccineBV)結(jié)果為了評(píng)價(jià)佐劑CoVaccineHT提高細(xì)胞培養(yǎng)物源的滅活全病毒流感疫苗的免疫原性的能力，將小鼠用不同的疫苗制劑接種。免疫接種后3周，HI抗體滴度在從來(lái)自組的免疫接種的和對(duì)照動(dòng)物取得的血清中確定。如在表2中所示，CoVaccineHT不強(qiáng)烈地增強(qiáng)針對(duì)A/Pr/8/34的HI滴度。該HI滴度甚至低于由包含氫氧化鋁的疫苗誘導(dǎo)的滴度。表2在免疫接種后24天取得的血清中的針對(duì)A/Pr/8/34的HI滴度組抗原佐劑HI滴度f(wàn)Log)1PBS<3.32A/Pr/8/3470ngHA/劑量5.1士1.13A/Pr/8/3470ngHA/劑量氫氧化鋁(0.2%)7.3士1.34A/Pr/8/3470ngHA/劑量CoVaccineHT(2mg/劑量)5.1士1.35A/Pr/8/3470ngHA/劑量CoVaccineHT(0.5mg/劑量)6.1士1.67確定IgG同種型以確定CoVaccineHT是否對(duì)誘導(dǎo)的免疫性的類型具有影響。如表3中所示，氫氧化鋁的共遞送誘導(dǎo)高滴度的IgGl和IgG2a。隨著IgGl/IgG2a比強(qiáng)烈地降低，CoVaccineHT的共遞送明顯地誘導(dǎo)IgG同種型上的轉(zhuǎn)變。該轉(zhuǎn)變成降低的IgGl/IgG2a比可能是重要的，因?yàn)榈偷腎gGl/IgG2a比在小鼠中與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性(Thl應(yīng)答)的良好誘導(dǎo)有關(guān)，而高比例與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性(Th2應(yīng)答)的差的誘導(dǎo)有關(guān)。表3在血清中的抗A/Pr/8/34IgG同種型組佐齊[JIgGlIgG2aIgGl/IgG2a比~~210.024+0.031~1.486+1.101NC^S氧化鋁(0.2%)2.964+0.359~1.790+1.0661.656~CoVaccineHT(2mg/0.131士0.0992.133士1.1650.061mW)~CoVaccineHT(0.50.253士0.1892.583士1.2520.097mg/齊[J量)NC=未計(jì)算，因?yàn)槠骄鵌gGl滴度低于背景兩次。將血清預(yù)稀釋200倍并且在用抗原包被的96孔ELISA板中連續(xù)地稀釋2倍。免疫接種后27天，將所有小鼠用同源性小鼠適應(yīng)的A/Pr/8/34挑戰(zhàn)。每天測(cè)定體重。在PBS對(duì)照組中的所有動(dòng)物在體重上下降并且在8天內(nèi)死亡。在組2(僅抗原)中的動(dòng)物證明清除組(cleargroup)平均體重降低直到挑戰(zhàn)后6天，其后體重增加至正常水平。在組3-5中的動(dòng)物被更好的保護(hù)，因?yàn)檫@些動(dòng)物在挑戰(zhàn)后未失重。盡管CoVaccineHT比氫氧化鋁不誘導(dǎo)更高的HI滴度，其對(duì)應(yīng)答的Thl/Th2比具有有益的效果。實(shí)施例3在雪貂中的CoVaccineHT輔助的細(xì)胞培養(yǎng)物源的滅活的全病毒疫苗(菌株A/Pr/8/34)的免疫原性(試驗(yàn)I)·(免疫接種/挑戰(zhàn))CoVaccineHT對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物源的滅活的全病毒流感疫苗的免疫原性的影響也在雪貂中評(píng)價(jià)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)四組閹割的雄性雪貂(η=7)用于該試驗(yàn)。在免疫接種前1個(gè)周，雪貂同時(shí)地接受應(yīng)答器(BiomedicDataSystemsIPTT-200)以測(cè)定體溫和以能夠身份識(shí)別。所有動(dòng)物用不同的制劑通過(guò)肌肉內(nèi)注射0.5mL來(lái)免疫接種一次。HI滴度在免疫接種后21天和49天取得的血液樣品中確定。免疫接種后8周，雪貂用感染性A/PuertoRico/8/34(HlNl)挑戰(zhàn)。挑戰(zhàn)病毒(A/PuertoRico/8/34)(HlNl)通過(guò)將0.2mL病毒接種入9-11天大小的SPF胚卵(embryonatedSPFegg)中來(lái)生產(chǎn)。在34°C_37°C下3天孵育時(shí)間后，收獲尿囊液并將其在MDCK細(xì)胞上滴定。挑戰(zhàn)前，頻繁地測(cè)定體重和體溫以建立正常的基線值。挑戰(zhàn)后，每天兩次的監(jiān)視體重和體溫。在挑戰(zhàn)感染后第4天，在大體病理(grosspathology)進(jìn)行后將動(dòng)物通過(guò)心臟穿刺來(lái)失血致死。制劑示于表4。表4在雪貂試驗(yàn)I中的疫苗制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>結(jié)果如表5中所示，使用CoVaccineHT的免疫比用氫氧化鋁的免疫導(dǎo)致高6_至7_倍的HI滴度。表5在免疫接種后21和48天取得的血清中的針對(duì)A/Pr/8/34的HI滴度<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>雪貂在免疫接種后8周用同源性感染性病毒挑戰(zhàn)。在挑戰(zhàn)感染后第4天，將雪貂殺死并且取出肺組織以用于組織學(xué)。組1的未免疫接種的動(dòng)物在肺中顯示最嚴(yán)重的病理學(xué)損傷。免疫接種組(組2至4)的動(dòng)物僅顯示細(xì)支氣管/支氣管和肺泡的微小發(fā)炎。挑戰(zhàn)后，存在淋巴樣刺激，并伴隨著小血管的血管周淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(在組3中最高分)，和間質(zhì)單核細(xì)胞浸潤(rùn)(在組2和3中最高分，但是在對(duì)照組中最嚴(yán)重)。不同免疫接種組之間的差異不是非常明顯地降低(cut)。推斷出在雪貂而不是在小鼠中，CoVaccineHT比氫氧化鋁誘導(dǎo)顯著更高的HI抗體滴度。實(shí)施例4在雪貂中的CoVaccineHT輔助的細(xì)胞培養(yǎng)物源的滅活的全病毒疫苗(菌株NIBRG-14)的免疫原性(試驗(yàn)II).為了評(píng)價(jià)CoVaccineHT是否也提高H5W菌株的免疫原性，進(jìn)行新的免疫接種試驗(yàn)。為了產(chǎn)生疫苗，使用在GMP下產(chǎn)生的滅活的全病毒抗原。試驗(yàn)設(shè)計(jì)7組雄性雪貂(n=7)用于該試驗(yàn)。在免疫接種前1個(gè)周，雪貂同時(shí)地接受應(yīng)答器(BiomedicDataSystemsIPTT-200)以測(cè)定體溫和以能夠身份識(shí)別。所有動(dòng)物用不同的制劑通過(guò)在左股二頭肌中注射0.5mL兩次來(lái)免疫接種。為了產(chǎn)生疫苗，使用滅活的全病毒抗原(菌株NIBRG14(H5N1)，在GMP下產(chǎn)生)。不同的疫苗制劑在表6中示出。血液樣品在不同的時(shí)間點(diǎn)取得。表6在雪貂試驗(yàn)II中的疫苗制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>所有動(dòng)物以3周間隔免疫接種2次。如表7中所示，lmg/劑量CoVaccineHT的共遞送與氫氧化鋁佐劑疫苗相比在HI滴度上導(dǎo)致4.9倍的增加。41^/劑量0^肌(^1^肌111的共遞送甚至導(dǎo)致8.5倍的增加。該增強(qiáng)進(jìn)一步增加HI滴度。使用CoVaccineHT的制劑在第35天導(dǎo)致最高的HI滴度，但是使用氫氧化鋁佐劑疫苗的差異小于在第21天。表7在第21天(首次免疫接種后21天)和在第35天(增強(qiáng)免疫接種后14天)取得的血清中針對(duì)NIBRG-14的HI滴度<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>從所述試驗(yàn)可以推斷出保護(hù)性的HI滴度可以在用輔助有CoVaccineHT的滅活的全病毒疫苗單次免疫接種后獲得(在人類中HI滴度>5.3認(rèn)為是保護(hù)性的)與CoVaccineHT共遞送的H5W菌株與氫氧化鋁的共遞送相比在HI滴度上導(dǎo)致8.5倍增加(4mg/劑量)或4.9倍增加(lmg/劑量)。單次免疫接種后，由7.5μgHA/劑量+CoVaccineHT誘導(dǎo)的HI滴度比由15μgHA/劑量+氫氧化鋁誘導(dǎo)的滴度高4倍。實(shí)施例6在非人靈長(zhǎng)類中CoVaccineHT和氫氧化鋁輔助的流感疫苗的比較本發(fā)明通過(guò)在非人靈長(zhǎng)類中的免疫接種研究進(jìn)一步舉例說(shuō)明。為此目的，將CoVaccineHT和氫氧化鋁輔助的H5W疫苗注射入3歲年齡的雌性食蟹猴(Cynomolgusmacaques(Macacafascicularis))(HartelustBV,Tilburg,TheNetherlands)并且在1和2次注射后測(cè)定抗體應(yīng)答。所述動(dòng)物以6只動(dòng)物每組住在使用鋸屑作為床具的正常籠中。動(dòng)物設(shè)備條件為晝/夜循環(huán)(12h/12h)，溫度21攝氏度士2°C，相對(duì)濕度40-60%。所述動(dòng)物具有不受限的自來(lái)水和食物(顆粒飼料(pellets)和水果)供應(yīng)。它們每天就疾病的明顯標(biāo)志檢查。符合用于動(dòng)物試驗(yàn)的荷蘭法，并且符合“Guideforthecareanduseoflaboratoryanimals”，ILAR推薦和AAALAC標(biāo)準(zhǔn)地進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)。動(dòng)物每天就副作用評(píng)價(jià)(移動(dòng)或呼吸困難、打噴嚏)。為了處理，動(dòng)物用氯胺酮(25mg/kg；肌肉內(nèi))鎮(zhèn)靜，其提供約20-40分鐘的深度鎮(zhèn)靜并且其為標(biāo)準(zhǔn)步驟。動(dòng)物由動(dòng)物設(shè)備技術(shù)員每天觀察兩次。在第0天，動(dòng)物免疫入其中皮膚被削去的左后腿股間肌(LH)。在研究第21天，將所述疫苗施用至其中皮膚被削去的右后腿(RH)股間肌。注射位點(diǎn)在每次免疫之前和每次免疫后4和24小時(shí)檢查。抗原的劑量為7.5iigHA(滅活的NIBRG-14)。氫氧化鋁以0.2%(w/v)的濃度使用。CoVaccineHT的劑量為2mgSFASE。結(jié)果未注意到局部或全身的不良事件，除了在少數(shù)情況下一些局部發(fā)紅之外。為了血凝抑制(HI)檢驗(yàn)，將病毒懸浮液用血清樣品的連續(xù)(2-倍)稀釋液孵育，所述血清樣品用cholerafiltrate(獲自Vibriocholeraecultures)預(yù)處理。隨后，將紅細(xì)胞添加至所述稀釋液，并且在孵育后將顯示血細(xì)胞凝集素的完全抑制的試劑的最大稀釋度定義為血凝抑制的滴度。表8在獼猴中用氫氧化鋁(組1)和CoVaccineHT-輔助的(組2)，全病毒H5W流感疫苗1和2次免疫后的HI抗體滴度。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>GMT為幾何平均滴度；SD為GMT的標(biāo)準(zhǔn)偏差；antilog為2~GMT；增長(zhǎng)因子為在某天的antilog除以在第0天的antilog,即10。HI測(cè)試系統(tǒng)的檢出限為10。用具有氫氧化鋁或CoVaccineHT作為佐劑的細(xì)胞培養(yǎng)物源的、全病毒、H5W流感病毒首次注射后3周，與第0天(免疫前)相比HI滴度分別增加至少1.6和17.2倍。用具有氫氧化鋁或CoVaccineHT作為佐劑的細(xì)胞培養(yǎng)物源的、全病毒、H5W流感病毒第二次注射后3周，與第0天(免疫前)相比HI滴度分別增加至少12.3和175.1倍。用于評(píng)估流感疫苗功效的3個(gè)EMEA標(biāo)準(zhǔn)為1)血清轉(zhuǎn)化的數(shù)量或HI滴度上的顯著增加應(yīng)該>40%，2)GMT上的增加應(yīng)該>2.5和3)具有HI滴度>40的受試者的比例應(yīng)該至少為70%。令人驚奇的是，單劑量的根據(jù)本發(fā)明的疫苗在未接觸抗原動(dòng)物(imprimedanimals)中導(dǎo)致容易滿足這些標(biāo)準(zhǔn)的免疫應(yīng)答，而對(duì)于傳統(tǒng)的氫氧化鋁_佐劑疫苗，需要兩次免疫。權(quán)利要求滅活的流感疫苗，包括β丙內(nèi)酯(BPL)滅活的全流感病毒和包括作為佐劑的一種或多種單-或二糖衍生物，所述單-或二糖衍生物具有至少一個(gè)但不多于N-1個(gè)脂肪酸酯基團(tuán)，其中N為所述衍生物衍生自的單-或二糖的羥基的數(shù)量。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的滅活的流感疫苗，其特征在于所述佐劑為在水包角鯊?fù)槿橐褐幸氲恼崽侵舅崃蛩狨ァ?.根據(jù)權(quán)利要求2所述的滅活的流感疫苗，其特征在于所述佐劑為CoVaccineHT。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的滅活的流感疫苗，其特征在于所述流感病毒為細(xì)胞培養(yǎng)物源的。5.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的滅活的流感疫苗，其特征在于所述細(xì)胞培養(yǎng)物為MDCK細(xì)胞培養(yǎng)物。6.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的滅活的流感疫苗，其特征在于所述流感屬于H5型。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的滅活的流感疫苗，其特征在于所述流感屬于H5W型。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的滅活的流感疫苗，其特征在于所述流感為NIBRG-14。9.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的滅活的流感疫苗，其特征在于一次劑量的疫苗包含0.1至60iigHA。10.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的滅活的流感疫苗，其特征在于一次劑量的疫苗包含0.lmg至40mg蔗糖脂肪酸(硫酸)酯。11.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的疫苗在保護(hù)人類或動(dòng)物抵抗流感的方法中的用途。12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其中所述人類或動(dòng)物以一次注射疫苗方案免疫接種。全文摘要本發(fā)明涉及滅活的佐劑流感疫苗。本發(fā)明提供克服已存在的滅活的流感疫苗的許多缺點(diǎn)的疫苗。本發(fā)明提供滅活的流感疫苗，包括β丙內(nèi)酯(BPL)滅活的全流感病毒和包括作為佐劑的一種或多種單-或二糖衍生物，所述單-或二糖衍生物具有至少一個(gè)但不多于N-1個(gè)脂肪酸酯基團(tuán)和任選的，一個(gè)但不多于N-1個(gè)硫酸酯基團(tuán)，其中N為所述衍生物衍生自的單-或二糖的羥基的數(shù)量。在根據(jù)本發(fā)明的疫苗中的流感病毒優(yōu)選為細(xì)胞培養(yǎng)物源的。用于在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生流感病毒的方法在本領(lǐng)域是已知的。該病毒可以在哺乳動(dòng)物、鳥類或人類起源的細(xì)胞，例如MadinDarbyCanineKidney(MDCK)，Vero，MDBK，CLDK，EBx或PerC6細(xì)胞上生長(zhǎng)。文檔編號(hào)A61K39/39GK101808659SQ200880108502公開日2010年8月18日申請(qǐng)日期2008年9月23日優(yōu)先權(quán)日2007年9月24日發(fā)明者H·L·戈蘭斯比克,J·G·M·海爾登斯申請(qǐng)人:諾比龍國(guó)際有限責(zé)任公司