本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含AKT抑制劑和IRE1抑制劑的藥物組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥是僅次于心血管疾病的高死亡率疾病，全球癌癥患者和死亡病例都在不斷地增加。新增癌癥病例有近一半出現(xiàn)在亞洲，其中大部分在中國，中國新增癌癥病例高居世界第一位。尤其是在肝癌、食管癌、胃癌和肺癌等4種惡性腫瘤中，中國新增病例和死亡人數(shù)均居世界首位。這些癌癥的治療雖然以手術(shù)為主，但由于早期患者一般無明顯癥狀，在首次被確診的癌癥患者中，很多已為中晚期，失去了手術(shù)切除的機(jī)會(huì)，故非手術(shù)治療在腫瘤的綜合治療中有著十分重要的地位。其中，化療無論是術(shù)前化療、術(shù)后輔助化療還是姑息性化療，在綜合治療中占據(jù)舉足輕重的地位。目前常用的化療藥物多以長春瑞濱、紫杉醇、氟尿嘧啶、順鉑、5-氟尿嘧啶為主，其產(chǎn)生的化療反應(yīng)，如惡心嘔吐較強(qiáng)烈以及對(duì)肝腎功能和骨髓損害等，一定程度上限制了其應(yīng)用。

AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路之一，它參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、遷移、黏附、腫瘤血管生成等過程，并在多種常見腫瘤(如乳腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、宮頸癌和血液系統(tǒng)腫瘤)中均有高表達(dá)。因此，以AKT為靶點(diǎn)的分子靶向治療也逐漸得到人們的重視。其中，MK-2206是一種高度選擇性的AKT1/2/3抑制劑，其主要作用是抑制AKT磷酸化，對(duì)250種其他蛋白激酶沒有抑制活性，目前已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)研究。Perifosine(KRX-0401)是一種新型的AKT抑制劑，為一雜環(huán)的烷基磷酸膽堿，可靶向作用于Akt的pleckstrin同源結(jié)構(gòu)域來抑制AKT的活性，表現(xiàn)出良好的抑制乳腺癌在內(nèi)的多種實(shí)體瘤活性，目前已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)研究。Ipatasertib(GDC-0068)是一種高選擇性的廣譜AKT抑制劑，靶向作用于AKT1/2/3，比作用于PKA選擇性高620倍，目前已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)研究。AZD5363作為AKT抑制劑，可有效抑制AKT(AKT1/2/3)的所有亞型，對(duì)P70S6K/PKA也具有相似的抑制效果，而對(duì)ROCK1/2抑制活性較低，目前已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)研究。

肌醇需求激酶1(IRE1)是一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的跨膜蛋白，參于未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)信號(hào)通路中信息的傳遞。其中，IRE1α/Xbp1通路是UPR的重要傳感通路，IRE1α通過感知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，使激酶區(qū)域自磷酸化進(jìn)而激活核酸酶活性，在mRNA水平上剪切其下游轉(zhuǎn)錄因子Xbp1，激活一系列的UPR相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，還可通過非依賴Xbp1的途徑，激活JNK，引發(fā)細(xì)胞的凋亡。STF-083010是一種特異性IRE1核酸內(nèi)切酶抑制劑，具有劑量和時(shí)間依賴性的細(xì)胞抑制能力和細(xì)胞毒性，STF-083010可抑制XBP1剪接，抑制IRE1α的核酸內(nèi)切酶活性，但不影響IRE1α的激酶活性。APY29是IRE1變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，能抑制IRE1R自磷酸化，并激活I(lǐng)RE1RNase活性。而4μ8C是高效的選擇性IRE1抑制劑，它可阻斷基底(RIDD)接近IRE1的活性部位，并選擇性使Xbp1剪接作用和IRE1介導(dǎo)的mRNA降解失活。目前，關(guān)于IRE1α/Xbp1通路的研究多與脂肪代謝調(diào)控有關(guān)，很少涉及到腫瘤的防治。

隨著腫瘤分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，腫瘤分子靶向治療已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)，在多種腫瘤的治療中發(fā)揮了重要的作用。然而，大部分腫瘤的生物學(xué)行為并非由單一信號(hào)傳導(dǎo)通路所支配，而是多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路共同起作用的，因此聯(lián)合用藥針對(duì)多靶點(diǎn)進(jìn)行靶向治療將不僅旨在減少或延緩耐藥性的出現(xiàn)、降低毒性，而且通過多種藥物對(duì)癌細(xì)胞殺傷的協(xié)同作用取得更好的療效。目前，沒有關(guān)于AKT抑制劑和IRE1抑制劑聯(lián)合用藥用于抗腫瘤的相關(guān)研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種藥物組合物及其在制備防治腫瘤的藥物中的應(yīng)用，具體涉及含有AKT抑制劑和IRE1抑制劑的藥物組合物及其在制備治療肺癌、肝癌、食管癌、腸癌、胃癌、腦瘤、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌或前列腺癌的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含有AKT抑制劑和IRE1抑制劑。

其中，所述的AKT抑制劑選自MK-2206、Perifosine(KRX-0401)、Ipatasertib(GDC-0068)或AZD5363。

所述的IRE1抑制劑選自STF-083010、APY29或4μ8C。

優(yōu)選地，所述的AKT抑制劑為MK-2206。

優(yōu)選地，所述的IRE1抑制劑為STF-083010。

優(yōu)選地，所述的藥物組合物包含有MK-2206和STF-083010。

進(jìn)一步地，所述的藥物組合物中MK-2206和STF-083010的摩爾濃度比為1～20:10～60。

優(yōu)選地，所述的藥物組合物中MK-2206和STF-083010的摩爾濃度比為5:40。

此外，本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)上述的藥物組合物在制備防治腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述的腫瘤包括但不限于肺癌、肝癌、食管癌、腸癌、胃癌、腦瘤、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌或前列腺癌。

優(yōu)選地，本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)上述的藥物組合物在制備防治肺癌、肝癌、食管癌藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，所述的藥物組合物可配以藥學(xué)可接受的添加劑制成注射制劑或口服制劑，優(yōu)選注射制劑，尤其是靜脈注射制劑。

磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)及蛋白激酶B(AKT)所組成的信號(hào)通路與腫瘤增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、侵襲及血管生成密切相關(guān)。作為該通路的核心，異?；罨腁KT通過磷酸化其下游分子(如mTOR)促進(jìn)腫瘤惡性增殖及抵抗凋亡，并參與調(diào)節(jié)腫瘤對(duì)放化療及靶向治療的敏感性。特異性抑制AKT分子活化能有效阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制腫瘤增殖，促進(jìn)凋亡。本發(fā)明人以MK-2206單獨(dú)處理食管癌細(xì)胞株Kyse450、Kyse510、TE-1、Eca-109、EC9706，發(fā)現(xiàn)MK-2206對(duì)食管癌細(xì)胞的生長具有一定的抑制作用，使癌癥細(xì)胞數(shù)明顯減少，并且發(fā)現(xiàn)MK-2206通過抑制AKT及mTOR的磷酸化，使p-AKT和p-mTOR的表達(dá)顯著下調(diào)，從而有效阻斷PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，充分發(fā)揮抑制腫瘤增殖，促進(jìn)凋亡效果。

一方面，本發(fā)明人以MK-2206和STF-083010聯(lián)合用藥，觀察其對(duì)食管癌、肺癌、肝癌細(xì)胞和正常血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MK-2206和STF-083010聯(lián)合用藥，可顯著抑制癌細(xì)胞的存活，減少癌細(xì)胞的數(shù)量，效果顯著優(yōu)于單獨(dú)使用MK-2206或STF-083010，對(duì)食管癌、肺癌、肝癌細(xì)胞的抑制效果均顯示出較佳的協(xié)同作用，同時(shí)，聯(lián)合用藥對(duì)正常血管內(nèi)皮細(xì)胞的毒性較小。

另一方面，本發(fā)明人還考察了MK-2206和STF-083010聯(lián)合用藥對(duì)食管癌細(xì)胞克隆形成的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組以及單藥組相比，聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞克隆形成具有明顯的協(xié)同抑制作用，聯(lián)合用藥組細(xì)胞克隆數(shù)量最少，同時(shí)體積也最小，表明MK-2206和STF-083010聯(lián)合用藥聯(lián)合用藥對(duì)抑制食管癌細(xì)胞克隆具有較佳的協(xié)同作用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于：

本發(fā)明提供一種用于防治腫瘤的藥物組合物，具體為將AKT抑制劑和IRE1抑制劑組合使用，更具體為以MK-2206和STF-083010聯(lián)合用藥，為腫瘤患者提供一種新的治療方案，所述的MK-2206和STF-083010聯(lián)合用藥，可有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長和細(xì)胞克隆形成，效果顯著優(yōu)于單獨(dú)用藥，具有相加或協(xié)同效應(yīng)，同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用低，安全性高，可應(yīng)用于制備抗腫瘤的藥物領(lǐng)域。

附圖說明

圖1MK-2206單獨(dú)使用對(duì)食管癌細(xì)胞生長的影響。

圖2MK-2206單獨(dú)使用對(duì)食管癌細(xì)胞形態(tài)的影響。

圖3MK-2206單獨(dú)使用對(duì)食管癌細(xì)胞mTOR/AKT通路的影響。

圖4MK-2206與STF-083010聯(lián)合作用對(duì)食管癌細(xì)胞生長的影響。

圖5MK-2206與STF-083010聯(lián)合作用對(duì)食管癌細(xì)胞形態(tài)的影響。

圖6MK-2206與STF-083010聯(lián)合作用對(duì)食管癌細(xì)胞的聯(lián)用效果分析。

圖7MK-2206、順鉑、5-氟尿嘧啶與STF-083010聯(lián)合作用對(duì)腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞的影響。

圖8MK-2206與STF-083010聯(lián)合作用對(duì)食管癌細(xì)胞克隆形成的影響。

具體實(shí)施方式

以下通過具體實(shí)施方式進(jìn)一步描述本發(fā)明，但本發(fā)明不僅僅限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1MK-2206單獨(dú)處理后對(duì)食管癌細(xì)胞生長的影響

首先檢測(cè)Kyse450、Kyse510、TE-1、Eca-109、EC9706食管癌細(xì)胞對(duì)MK-2206單獨(dú)使用的藥物敏感性。

1、實(shí)驗(yàn)方法

將腫瘤細(xì)胞以每孔4000-6000個(gè)細(xì)胞的數(shù)量接種到96孔板，待細(xì)胞貼壁(24h)后，將MK-2206藥物稀釋成一定的梯度濃度，每濃度設(shè)5復(fù)孔，分為實(shí)驗(yàn)組及調(diào)零組加藥。48h后采用MTT法進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)，每孔加入10μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸除孔內(nèi)液體，避免接觸孔內(nèi)結(jié)晶物，每孔加入100μl的DMSO，于恒速搖床上避光搖晃。待結(jié)晶物充分溶解后，在酶標(biāo)儀上讀取OD值(波長570nm，參考波長630nm)，測(cè)得吸光度A值。

生長抑制率的計(jì)算公式為：生長抑制率(％)＝(1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組)×100％。根據(jù)各濃度的抑制率可作圖得到劑量反應(yīng)曲線，作圖軟件為Graphpad，采用Logit法精確計(jì)算藥物的IC₅₀(half maximal inhibitory concentration)值。具體結(jié)果見圖1和圖2。

從圖1可以看出，MK-2206對(duì)食管癌細(xì)胞株Kyse450、Kyse510、TE-1、Eca-109、EC9706的IC₅₀值分別為14.3、12.4、9.4、7.6和11.5，表明MK-2206對(duì)食管癌細(xì)胞的生長具有一定的抑制作用。從圖2也可以看出，MK-2206單獨(dú)作用于食管癌細(xì)胞株Kyse450、Kyse510后，細(xì)胞數(shù)明顯減少。

實(shí)施例2MK-2206單獨(dú)使用對(duì)食管癌細(xì)胞mTOR/AKT通路的影響

利用Western blot方法檢測(cè)經(jīng)MK-2206單獨(dú)處理及聯(lián)合處理后食管癌細(xì)胞Kyse450和Kyse510細(xì)胞內(nèi)mTOR/AKT通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。先將Kyse450和Kyse510細(xì)胞分別以每孔2×10⁵個(gè)細(xì)胞的密度接種至6孔板。待細(xì)胞貼壁后，按實(shí)施例1給藥。處理48h后，分別收取各組細(xì)胞全蛋白。先經(jīng)SDS電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5％脫脂奶粉室溫封閉1h，孵育所需檢測(cè)的蛋白相對(duì)應(yīng)的一抗，4℃孵育過夜。24h回收一抗，用TBST清洗3次，每次5min，之后孵育二抗，室溫孵育1h。后用TBST清洗3次，每次5min，之后ECL顯影，結(jié)果見圖3。

從圖3可以看出，在Kyse450和Kyse510細(xì)胞中，當(dāng)用MK-2206單獨(dú)處理后，p-AKT和p-mTOR的表達(dá)顯著下調(diào)，說明MK-2206能夠抑制AKT及mTOR的磷酸化，使p-AKT和p-mTOR的表達(dá)顯著下調(diào)，從而有效阻斷PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，充分發(fā)揮抑制腫瘤增殖，促進(jìn)凋亡效果。

實(shí)施例3MK-2206與STF-083010聯(lián)合作用對(duì)食管癌細(xì)胞生長的影響

將人食管癌細(xì)胞Kyse450和Kyse510細(xì)胞以每孔4000-6000個(gè)細(xì)胞的數(shù)量接種到96孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入5μM濃度MK-2206和40μM濃度STF-083010，培養(yǎng)48h后，每孔加入10μl濃度為5mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后棄去培養(yǎng)液每孔加入100μl的DMSO，于恒速搖床上避光搖晃。待結(jié)晶物充分溶解后，在酶標(biāo)儀上讀取OD值(波長570nm，參考波長630nm)，讀取每孔的吸光值，計(jì)算兩藥合用后細(xì)胞存活率。用CompuSyn軟件進(jìn)行協(xié)同作用綜合因子(Combination Index,CI)分析，結(jié)果見圖4。并通過顯微鏡觀察5μM濃度MK-2206和40μM濃度STF-083010聯(lián)合作用于食管癌細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)變化，結(jié)果如圖5。

如圖4所示，5μM濃度MK-2206和40μM濃度STF-083010聯(lián)合使用具有很好的聯(lián)用效果。從圖5可知，MK-2206與STF-083010兩藥聯(lián)用后癌細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞形態(tài)較正常組及單獨(dú)用藥組相比無明顯變化。

CI值表示藥物聯(lián)合作用時(shí)的一個(gè)復(fù)合指數(shù)，CI值小于1、等于和大于1分別表示藥物協(xié)同作用、增效作用和拮抗作用。從圖6可以看出，MK-2206和STF-083010對(duì)食管癌細(xì)胞聯(lián)合使用時(shí)，其CI值基本都在小于1的范圍內(nèi)，特別是Kyse450，表明MK-2206和STF-083010在本發(fā)明的用量范圍內(nèi)聯(lián)合使用具有很好的協(xié)同作用。

實(shí)施例4MK-2206、順鉑、5-氟尿嘧啶和STF-083010聯(lián)合作用對(duì)腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞的影響

將Kyse450食管癌、Kyse510食管癌、A549肺癌、HepG2肝癌細(xì)胞和HUVEC正常血管內(nèi)皮細(xì)胞以每孔3000-6000個(gè)細(xì)胞的數(shù)量接種到96孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入對(duì)照組、5μM的MK-2206和40μM的STF-083010及聯(lián)合用藥組藥物；另鋪細(xì)胞Kyse450，按照如下方式進(jìn)行加藥：對(duì)照組、5μM MK-2206、40μM STF-083010、MK-2206+STF-083010、1μg/ml順鉑(CDDP)、順鉑(CDDP)+STF-083010、4μg/ml 5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟尿嘧啶(5-FU)+STF-083010，培養(yǎng)48h后，每孔加入10μl濃度為5mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后棄去培養(yǎng)液每孔加入100μl的DMSO，于恒速搖床上避光搖晃。待結(jié)晶物充分溶解后，在酶標(biāo)儀上讀取OD值(波長570nm，參考波長630nm)，讀取每孔的吸光值，計(jì)算兩藥合用后的細(xì)胞存活及抑制率，結(jié)果見圖7。

如圖7所示，YM155和STF-083010在腫瘤細(xì)胞中組合使用具有很好的聯(lián)合效果，且優(yōu)于順鉑、5-氟尿嘧啶與STF-083010組合，而對(duì)正常HUVEC細(xì)胞的毒性較小。

實(shí)施例5MK-2206和STF-083010聯(lián)合用藥對(duì)食管癌細(xì)胞克隆形成的影響

將人食管癌細(xì)胞Kyse450和Kyse510細(xì)胞接種到6孔板，待細(xì)胞貼壁過夜后，將細(xì)胞分為對(duì)照組、MK-2206單藥組、STF-083010單藥組及MK-2206和STF-083010藥物聯(lián)合用藥組，分別加入對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基或者藥物溶液，孵育7天，檢測(cè)細(xì)胞平板克隆形成情況。結(jié)果如圖8所示，與對(duì)照組以及單藥組相比，聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞克隆形成具有明顯的協(xié)同抑制作用，聯(lián)合用藥組細(xì)胞克隆數(shù)量最少，同時(shí)體積也最小。

以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，上述優(yōu)選實(shí)施方式不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)以權(quán)利要求所限定的范圍為準(zhǔn)。對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。