Ace抑制五肽的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物來源的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制肽及其類似物。
【背景技術(shù)】
[0002]高血壓是最常見的心血管疾病之一，它能造成大腦、心血管、腎臟的損害，是引起腦卒中、心力衰竭和冠心病等的重要因素，嚴重威脅著人類的健康。因此，治療和預防高血壓對提高人類的健康水準，延長壽命有著重要的意義。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶在人體腎素-血管緊張素系統(tǒng)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)中，對血壓調(diào)節(jié)起著重要的作用。ACE可以將血管緊張素I轉(zhuǎn)換為血管緊張素II，使周圍小動脈、血管平滑肌收縮，同時刺激醛固酮分泌，促進人體腎臟對Na+、K+的重吸收，引起鈉儲量和血容量的增加，使血壓升高；還可以使舒緩激肽失活，引起血壓升高。綜上所述，ACE —方面產(chǎn)生使血壓上升的血管緊縮素II，另一方面，使具有血管舒張作用的舒緩激肽失活，這都造成了血壓的上升。所以，如果抑制了 ACE的活性，就可以起到降壓的作用。
[0003]現(xiàn)有的作為治療高血壓的合成物卡普托利就是ACE的抑制劑，但它有很多副作用，所以源于食品蛋白中的ACE抑制肽因其無毒副作用，同時具有其它療效而被廣泛應用，市場前景極好。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種分離自水溶性魚鱗膠原蛋白酶解液的活性短肽，該短肽具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制活性。
[0005]本發(fā)明所述的ACE抑制五肽，氨基酸序列為Gly-Ser-Val-Gly-Tyr (GSVGY)。
[0006]上述本發(fā)明的ACE抑制五肽應當包括由氨基酸璇光度不同而定義為L型氨基酸或D型氨基酸的不同構(gòu)型的五肽。
[0007]優(yōu)選地，本發(fā)明所述的ACE抑制五肽源自魚鱗膠原蛋白。
[0008]另一方面，本發(fā)明的目的還在于提供上述本發(fā)明所述的ACE抑制五肽的制備方法，包括原料預處理、水溶性膠原蛋白提取及酶解，以及活性五肽分離的步驟，其中所述的活性五肽分離包括超濾、凝膠過濾及C18高效液相色譜分離的步驟，分離過程中跟蹤檢測分離組分的ACE抑制活性，收集具有ACE活性的組分進行下一步分離。
[0009]作為具體的實施方式之一，上述本發(fā)明的ACE抑制五肽的制備方法中所述及的活性五肽分離包括如下步驟:
[0010](I)酶解產(chǎn)物超濾后，取分子量小于3000道爾頓的組分，采用S印hadex G_25分離，流動相為30%的甲醇溶液，柱溫為室溫，檢測波長為280nm ;
[0011]跟蹤檢測分離組分的ACE抑制活性，按時間收集具有ACE抑制活性的組分V ;
[0012](2)步驟⑴所得的組分V經(jīng)離子交換層析進一步分離，跟蹤檢測分離組分的ACE抑制活性，收集具有ACE抑制活性的組分Vb，冷凍干燥備用；
[0013](3)步驟(2)所得的組分Vb經(jīng)PR-HPLC純化，跟蹤檢測分離組分的ACE抑制活性，收集具有ACE抑制活性的組分Vba，冷凍干燥。
[0014]上述本發(fā)明的ACE抑制五肽的制備方法中，所述步驟⑵中，組分V經(jīng)離子交換層析進一步分離，獲得3個組分，按時間收集，中間組分具有ACE抑制活性，為組分Vb。
[0015]上述本發(fā)明的ACE抑制五肽的制備方法中，所述步驟(3)中，中PR-HPLC條件包括:
[0016]Hypersil C18柱；檢測波長215nm，室溫，進樣體積20 μ I ;
[0017]梯度洗脫:0?60min:流動相A，100?50%線性降低；
[0018]流動相B，O?50%線性升高；
[0019]60 ?80min:流動相 A，0% ;流動相 B，100% ；
[0020]其中，流動相A為:按照體積百分比，含0.1 % TFA水溶液，用前超聲脫氣；
[0021 ]流動相B為:按照體積百分比，含0.1 % TFA的乙腈，用前超聲脫氣。
[0022]進一步的【具體實施方式】之一，上述本發(fā)明的ACE抑制五肽的制備方法中所述的原料預處理包括如下步驟:將干魚鱗置于10?20倍重量的清水中浸泡2?4小時，濾網(wǎng)脫除游離水分后，再用10?12倍重量的質(zhì)量濃度為0.1?1.0%鹽酸浸泡I?6小時，然后以質(zhì)量濃度為0.1?0.5%氫氧化鈉溶液中和至中性，水洗脫除鹽分，濾網(wǎng)瀝干，作為水溶性膠原蛋白提取用原料魚鱗。
[0023]【具體實施方式】中，上述本發(fā)明的ACE抑制五肽的制備方法中所述的水溶性膠原蛋白提取及酶解是將經(jīng)預處理的原料魚鱗與去離子水按照質(zhì)量比1:2?10裝入蒸煮釜，60?120°C加熱2?8小時，收集溶液部分為水溶性膠原蛋白；然后以胃蛋白酶酶解24小時。
[0024]結(jié)合上述對ACE抑制五肽的制備方法的描述，本發(fā)明的目的也在于保護通過上述任意一種關(guān)于制備方法的技術(shù)方案所制得的ACE抑制五肽，抑或含所述制備方法所制得的組合物。
[0025]再一方面，本發(fā)明的目的還在于提供一種預防和/或治療高血壓組合物，所述組合物含有本發(fā)明所述的ACE抑制五肽。所述的組合物包括藥物或者食品組合物。
[0026]基于上文對本發(fā)明的充分理解，申請人相信，本領(lǐng)域技術(shù)人員應當容易理解，本發(fā)明所述的肽及通過通用方法所獲得的其它相關(guān)衍生產(chǎn)品，都應當屬于本發(fā)明保護所延及的范疇。上述通用方法舉例但不限于與酸反應產(chǎn)生鹽類，或者與金屬/陽離子形成的鹽類。所述的酸包括但不限于鹽酸，硫酸，硝酸，磷酸等無機酸；蟻酸，乙酸，丙酸，甘氨膽酸，蘋果酸，檸檬酸，酒石酸，琥珀酸等有機酸。所述的與金屬/陽離子形成的鹽類包括但不限于鈉鹽，鉀鹽，鈣鹽，銨鹽，或者與氨基乙醇，三乙氨，二環(huán)乙氨等形成的胺類鹽等。
[0027]另一方面，對本發(fā)明中所述及藥物的理解，申請人相信，結(jié)合本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)，所述“藥物”可以毫無疑義地理解為各種藥物制劑，包括但不限于加入各種醫(yī)藥輔料所制得的散劑、顆粒劑、片劑、膠囊、栓劑、懸浮液、乳化液、噴劑、注射液或粉針劑等。根據(jù)不同劑型特點，在使用這些藥物進行治療時，可以通過各種相應的途徑給藥，典型但不限于可經(jīng)口服給藥、注射給藥及粘膜給藥。
[0028]再一方面，對本發(fā)明中所述及的食品組合物的理解，即通常意義的食品或保健品，形態(tài)可以是清涼飲料，乳酸飲料，調(diào)味品，湯類，奶酪，火腿，點心等。
[0029]本發(fā)明相關(guān)的ACE抑制五肽或其相關(guān)制品，使用量是沒有特別的限制，具體的要根據(jù)高血壓的程度，患者的年齡，體重，身體狀況和給與的方法等因素，適當?shù)卮_定。
[0030]該五肽有明顯的降血壓效果。并且該活性五肽由食品來源，同時具有高安全性、廉價、可產(chǎn)業(yè)化的突出優(yōu)點。該活性五肽或其衍生物可用于制備高血壓治療/預防藥物，或作為功能食品添加劑，供高血壓患者長期治療保健使用。
【附圖說明】
[0031]本發(fā)明附圖4幅，其中:
[0032]圖1是S印hadex G-25對酶解產(chǎn)物的分離圖譜；
[0033]圖2是組分V的離子交換層析圖譜；
[0034]圖3是組分Vb的PR-HPLC分離圖譜；
[0035]圖4是魚鱗膠原蛋白肽對高血壓大白鼠的降血壓效果。
【具體實施方式】
[0036]下面以具體實施例的方式對本發(fā)明作進一步的闡述。無特殊說明，本發(fā)明參考102516358B的方法跟蹤檢測分離組分的ACE抑制活性。
[0037]1.水溶性膠原蛋白的制備
[0038]將干魚鱗置于16倍重量的清水