中浸泡4小時，濾網(wǎng)脫除游離水分后，再用10倍重量的0.5%鹽酸浸泡5小時，然后再以0.5%氫氧化鈉溶液中和至中性，水洗脫除鹽分，濾網(wǎng)瀝干，作為水溶性膠原蛋白提取用原料魚鱗。
[0039]將原料魚鱗裝入蒸煮釜，加入8倍重量的去離子水，100°C加熱6?8小時，收集溶液部分為水溶性膠原蛋白。
[0040]2.魚鱗膠原蛋白ACE抑制五肽的制備
[0041]步驟I中制備的水溶性膠原蛋白經(jīng)胃蛋白酶酶解24小時后，酶解產(chǎn)物經(jīng)超濾，取分子量小于3000道爾頓的組分，采用S印hadex G_25，流動相為30 %的甲醇溶液，柱溫為室溫，檢測波長為280nm，跟蹤檢測分離組分的ACE抑制活性，按照時間依次收集目標組分。
[0042]經(jīng)S印hadex G_25分離后得到的具有ACE抑制活性的組分V和組分VI (圖1)，其中組分V先洗脫。
[0043]3.ACE抑制五肽的分離
[0044]步驟2中經(jīng)Sephadex G_25分離所得組分V通過離子交換層析進一步分離純化，并對分離所得餾分的ACE抑制活性進行測定，結果如圖2顯示出，組分V經(jīng)過離子交換柱后洗脫出了 3個峰，按照時間順序，依次為組分Va，Vb和Vc，其中組分Vb具有ACE抑制活性，在最大峰值處的餾分的ACE抑制活性為84.0%。
[0045]4.ACE抑制五肽的純化及測序
[0046]對步驟3分離獲得的組分Vb用PR-HPLC進一步純化，分離結果如圖3所示，收集具有ACE抑制活性的組分Vba，冷凍干燥得產(chǎn)物T-1。
[0047]PR-HPLC 條件包括:
[0048]Hypersil C18柱；檢測波長215nm，室溫，進樣體積20 μ I ;
[0049]梯度洗脫:0?60min:流動相A，100?50%線性降低；
[0050]流動相B，O?50%線性升高；
[0051]60 ?80min:流動相 A，0% ;流動相 B，100% ；
[0052]其中，流動相A為:按照體積百分比，含0.1 % TFA水溶液，用前超聲脫氣；
[0053]流動相B為:按照體積百分比，含0.1 % TFA的乙腈，用前超聲脫氣。
[0054]產(chǎn)物T-1經(jīng)過蛋白質(zhì)序列分析儀分析，序列為Gly-Ser-Val-Gly-Tyr (GSVGY)。
[0055]并測得產(chǎn)物T-1對ACE的半抑制濃度IC5tl為0.045mol/L。
[0056]實施例2.靜脈注射動物實驗
[0057]選擇20只自發(fā)性高血壓大白鼠為實驗模型，大白鼠飼養(yǎng)一周后，將其分成2組，每一組10只，每日按大白鼠體重20mg/kg劑量(中劑量組)靜脈注射產(chǎn)物T-1。
[0058]結果表明，I周后對照組大白鼠的血壓持續(xù)升高，而治療組自發(fā)性高血壓大白鼠的血壓明顯下降，高血壓大白鼠的平均收縮壓從190mmHg下降到160mmHg說明產(chǎn)物T-1經(jīng)靜脈給藥具有明顯的降血壓效果。
[0059]實施例3.灌胃動物實驗
[0060]選擇20只自發(fā)性高血壓大白鼠為實驗模型，大白鼠飼養(yǎng)一周后，將其分成3組，每一組10只，每日按大白鼠體重20mg/kg劑量(中劑量治療組)灌胃產(chǎn)物T-1，另一組陽性藥物卡普托力(Captopril)對照組，每日按大白鼠體重20mg/kg劑量灌胃，結果如圖4所示。[0061 ] 4周后對照組大白鼠的血壓持續(xù)升高，而治療組自發(fā)性高血壓大白鼠的血壓明顯下降，高血壓大白鼠的平均收縮壓從185mmHg下降到160mmHg說明產(chǎn)物T-1經(jīng)口服給藥具有明顯的降血壓效果，并且與陽性藥物降血壓效果及趨勢基本一致。
【主權項】
1.ACE抑制五肽，氨基酸序列為Gly-Ser-Val-Gly-Tyr。2.根據(jù)權利要求1所述的ACE抑制五肽，其特征在于，包括由氨基酸璇光度不同而定義為L型氨基酸或D型氨基酸的不同構型的五肽。3.根據(jù)權利要求1所述的ACE抑制五肽，其特征在于，源自魚鱗膠原蛋白。4.權利要求1所述的ACE抑制五肽的制備方法，包括原料預處理、水溶性膠原蛋白提取及酶解，以及活性五肽分離的步驟，其特征在于，所述的活性五肽分離包括超濾、凝膠過濾及C18高效液相色譜分離的步驟，分離過程中跟蹤檢測分離組分的ACE抑制活性，收集具有ACE活性的組分進行下一步分離。5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的活性五肽分離包括如下步驟: (1)酶解產(chǎn)物超濾后，取分子量小于3000道爾頓的組分，采用S印hadexG_25分離，流動相為30%的甲醇溶液，柱溫為室溫，檢測波長為280nm ; 跟蹤檢測分離組分的ACE抑制活性，按時間收集具有ACE抑制活性的組分V ; (2)步驟(I)所得的組分V經(jīng)離子交換層析進一步分離，跟蹤檢測分離組分的ACE抑制活性，收集具有ACE抑制活性的組分Vb，冷凍干燥備用； (3)步驟(2)所得的組分Vb經(jīng)PR-HPLC純化，跟蹤檢測分離組分的ACE抑制活性，收集具有ACE抑制活性的組分Vba，冷凍干燥。6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的步驟(2)中，組分V經(jīng)離子交換層析進一步分離，獲得3個組分，按時間收集，中間組分具有ACE抑制活性，為組分Vb。7.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的步驟(3)中PR-HPLC條件包括: Hypersil C18柱；檢測波長215nm，室溫，進樣體積20 μ I ； 梯度洗脫:0?60min:流動相A，100?50%線性降低； 流動相B，O?50%線性升高； 60?80min:流動相A，0% ;流動相B，100% ； 其中，流動相A為:按照體積百分比，含0.1%TFA水溶液，用前超聲脫氣； 流動相B為:按照體積百分比，含0.1%TFA的乙腈，用前超聲脫氣。8.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的原料預處理包括如下步驟:將干魚鱗置于10?20倍重量的清水中浸泡2?4小時，濾網(wǎng)脫除游離水分后，再用10?12倍重量的質(zhì)量濃度為0.1?1.0%鹽酸浸泡I?6小時，然后以質(zhì)量濃度為0.1?0.5%氫氧化鈉溶液中和至中性，水洗脫除鹽分，濾網(wǎng)瀝干，作為水溶性膠原蛋白提取用原料魚鱗。9.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的水溶性膠原蛋白提取及酶解是將經(jīng)預處理的原料魚鱗與去離子水按照質(zhì)量比1:2?10裝入蒸煮釜，60?120°C加熱2?8小時，收集溶液部分為水溶性膠原蛋白；然后以胃蛋白酶酶解24小時。10.預防和/或治療高血壓組合物，含有權利要求1所述的ACE抑制五肽。
【專利摘要】ACE抑制五肽，氨基酸序列為Gly-Ser-Val-Gly-Tyr(GSVGY)。該短肽有明顯的降血壓效果。并且該活性五肽由食品來源，同時具有高安全性、廉價、可產(chǎn)業(yè)化的突出優(yōu)點。該活性五肽或其衍生物可用于制備高血壓治療/預防藥物，或作為功能食品添加劑，供高血壓患者長期治療保健使用。
【IPC分類】C07K14/78, C12P21/06, A61K38/39, A61P9/12, C07K1/34, C07K1/16, C07K1/36, C07K1/18
【公開號】CN104945502
【申請?zhí)枴緾N201510372643
【發(fā)明人】胡建恩, 高德友, 盧航, 武龍, 趙慧, 趙景華, 胡建蘭
【申請人】石獅海星食品有限公司
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年6月30日