本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及藥物的新用途，特別涉及抑制自噬的藥物在促進(jìn)心肌再生方面的新應(yīng)用。

背景技術(shù)：

心臟作為人體最重要的器官之一，它的主要功能是為血液流動(dòng)提供壓力，將血液運(yùn)輸?shù)缴眢w的各處。心臟的體積伴隨發(fā)育過(guò)程不斷增大，其中心肌細(xì)胞的增殖和肥大是心臟發(fā)育兩大主要途徑。出生以后心肌細(xì)胞逐漸喪失增殖能力。心衰是全球范圍內(nèi)廣泛存在的嚴(yán)重的，致死率極高的心血管疾病。成年人發(fā)生心肌梗塞或心衰后，心肌細(xì)胞數(shù)目的損失幾乎是不可逆的，這與哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞的增殖能力有限密切相關(guān)，因此，疾病或缺血等因素造成的心肌損傷難以修復(fù)。因此，心肌細(xì)胞增殖一直是領(lǐng)域內(nèi)研究的焦點(diǎn)。

中心體由兩對(duì)互相垂直的桶狀結(jié)構(gòu)中心粒和周圍電子致密物構(gòu)成。它作為一種重要的細(xì)胞器參與到細(xì)胞增殖的過(guò)程中，在特定的細(xì)胞周期里細(xì)胞含有兩個(gè)中心體更利于細(xì)胞的分裂。而在關(guān)于心肌細(xì)胞增殖能力的研究中，觀察到例如DNA合成降低、多核體及多倍體細(xì)胞比例增加、有絲分裂水平降低和胞質(zhì)分裂過(guò)程受阻等現(xiàn)象與中心體有關(guān)。所以，對(duì)于在心肌細(xì)胞增殖再生的研究中，中心體可能是一個(gè)重要的研究對(duì)象。

細(xì)胞自噬作為一種清除降解途徑在細(xì)胞受到饑餓或者其他壓力時(shí)發(fā)揮作用，通過(guò)降解大分子、細(xì)胞器或者功能紊亂的蛋白質(zhì)維持細(xì)胞的內(nèi)部平衡。近期研究發(fā)現(xiàn)小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞自噬可以參與調(diào)節(jié)中心體數(shù)目。但是在心肌細(xì)胞中，該過(guò)程是否存在還處于未知的狀態(tài)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于探索心肌細(xì)胞中自噬作用對(duì)心肌細(xì)胞增殖再生的影響，發(fā)現(xiàn)具有抑制自噬作用的藥物的新用途。

本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)育過(guò)程中心肌細(xì)胞中心體的數(shù)目減少，而中心體數(shù)目的減少與自噬相關(guān)。通過(guò)藥物抑制心肌細(xì)胞中心體自噬，能夠緩解在發(fā)育過(guò)程由于心肌細(xì)胞中心體數(shù)目減少導(dǎo)致的細(xì)胞無(wú)法再生的現(xiàn)象，并提高心肌細(xì)胞EdU的攝取率。

在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提出抑制自噬的藥物可促進(jìn)心肌細(xì)胞的再生，從而有望應(yīng)用于心衰或其他導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡的疾病治療。

一個(gè)完整的自噬過(guò)程需要多個(gè)步驟的參與，包括自噬體的形成、自噬體與溶酶體的融合及自噬溶酶體內(nèi)容物的降解三個(gè)過(guò)程。抑制自噬的藥物及其衍生物可能干擾其中的一個(gè)或多個(gè)過(guò)程，從而抑制自噬的發(fā)生。例如：

3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)可以通過(guò)抑制自噬過(guò)程中的III型磷脂酰肌醇激酶(Phosphoinositide 3-Kinase)信號(hào)通路，從而阻遏自噬體的產(chǎn)生。除此之外，渥曼青霉素(Wortmannin)、LY294002均可以阻斷III型磷脂酰肌醇激酶信號(hào)通路，從而抑制自噬的發(fā)生。

氯喹(Chloroquine，CQ)可通過(guò)提高溶酶體pH值影響自噬體與溶酶體的融合過(guò)程，使得自噬過(guò)程被阻斷。除此之外，羥氯喹、巴伐洛霉素A1(Bafilomycin A)、長(zhǎng)春堿及諾考達(dá)唑(nocodazole)也可以抑制自噬體與溶酶體的融合，從而影響自噬的發(fā)生。

自噬體與溶酶體融合后最終通過(guò)溶酶體中的水解酶降解內(nèi)容物，E46d和Pepstatin A對(duì)溶酶體的降解進(jìn)行抑制，使得被降解的囊泡內(nèi)容物大量蓄積與溶酶體中，從而達(dá)到抑制自噬的作用。

本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)推測(cè)，抑制自噬的藥物及其衍生物可能參與到心肌細(xì)胞的再生過(guò)程，從而提供了一種通過(guò)抑制自噬促進(jìn)心肌細(xì)胞再生的新思路。

以抑制自噬的藥物及其衍生物作為活性成分，可用于制備促進(jìn)心肌細(xì)胞再生的藥物制劑。將抑制自噬的化合物或分子和藥學(xué)上可接受的輔劑制成各種形式的藥物制劑，用于心衰或其他導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡的疾病治療。

所述“藥學(xué)上可接受的輔劑”包括藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑等，它們與活性成分(抑制自噬的化合物或分子)相容。運(yùn)用藥學(xué)上可接受的輔劑制備藥物制劑對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的。所述藥物制劑可以是固體制劑或液體制劑。本發(fā)明的制劑可以為單位劑量形式，如片劑、膠囊(包括持續(xù)釋放或延遲釋釋放形式)、栓劑、丸劑、粉劑、膏劑、混懸劑、顆粒劑、酊劑、糖漿劑、乳液劑、懸浮液、針劑等各種劑型以及各種緩釋劑型，從而適合各種給藥形式，例如口服、非腸道注射、粘膜、肌肉、靜脈內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、皮內(nèi)或經(jīng)過(guò)皮膚等的給藥形式。

綜上，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制自噬可以促進(jìn)心肌細(xì)胞再生，從而抑制心肌細(xì)胞自噬的藥物可能成為心力衰竭、心肌梗塞及其他導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡的疾病的治療成分。

附圖說(shuō)明

圖1.大鼠心肌細(xì)胞中心體數(shù)目在發(fā)育早期的變化情況，其中，0Ctr表示心肌細(xì)胞細(xì)胞中不含有中心體；1Ct表示心肌細(xì)胞中含有一個(gè)中心體；2Ctr表示心肌細(xì)胞中含有兩個(gè)中心體；mCtr表示心肌細(xì)胞中含有大于2個(gè)中心體。

圖2.實(shí)施例2中測(cè)得的大鼠發(fā)育過(guò)程中中心體與自噬體共定位比例變化情況統(tǒng)計(jì)圖，*P<0.05。

圖3.實(shí)施例3中通過(guò)CQ或3-MA抑制自噬后，心肌細(xì)胞中心體數(shù)目的變化情況，*P<0.05，**P<0.01。

圖4.實(shí)施例4中抑制自噬后心肌細(xì)胞EdU攝取率變化情況，*P<0.05。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1.心肌細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中中心體數(shù)目減少

利用γ-tubulin(γ微管蛋白)作為中心體的標(biāo)記物(γ-tubulin作為中心體的主要成分，通過(guò)NEDD1/GCP-WD錨定在中心粒周圍物質(zhì)中)，觀察在發(fā)育過(guò)程中大鼠心肌細(xì)胞中心體的變化情況。

利用0.1％胰蛋白酶及0.08％膠原酶II分離不同日齡大鼠的心室肌細(xì)胞。培養(yǎng)36小時(shí)后，預(yù)冷甲醇-20℃固定打孔7分鐘，之后血清封閉30分鐘后，利用γ微管蛋白及心肌細(xì)胞標(biāo)記物抗體標(biāo)記中心體及心肌細(xì)胞，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡成像后，統(tǒng)計(jì)發(fā)育過(guò)程中中心體數(shù)目。

結(jié)果如圖1所示，大鼠從出生后1天(P1)到9天(P9)的過(guò)程中，心肌細(xì)胞中含有兩個(gè)中心體的比例從56％降至24％，而細(xì)胞中不含中心體的細(xì)胞比例從4％上升至32％。

實(shí)施例2.發(fā)育過(guò)程中中心體與自噬體的共定位比例增加

微管相關(guān)蛋白輕鏈3(Microtubule-associated protein 1light chain 3,LC3)參與了自噬體的形成，定位在自噬體膜上，并被證明了是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中常見(jiàn)的自噬體標(biāo)記蛋白之一。同樣利用0.1％胰蛋白酶及0.08％膠原酶II分離不同日齡大鼠的心室肌細(xì)胞。培養(yǎng)36小時(shí)，預(yù)冷甲醇-20℃固定打孔7分鐘，之后血清封閉30分鐘后，利用γ微管蛋白、自噬體及心肌細(xì)胞標(biāo)記物抗體做免疫細(xì)胞化學(xué)，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡成像后，統(tǒng)計(jì)發(fā)育過(guò)程中中心體與自噬體共定位的比例。

在大鼠發(fā)育過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞中心體與自噬體(LC3標(biāo)記)的共定位比例逐漸增多，由P1時(shí)的26％升高至P7時(shí)的52％(圖2)，說(shuō)明在發(fā)育的過(guò)程中，中心體數(shù)目減少和自噬有關(guān)。

實(shí)施例3.抑制細(xì)胞自噬緩解心肌細(xì)胞中心體數(shù)目減少

為了進(jìn)一步驗(yàn)證自噬是否參與到中心體數(shù)目的減少這一過(guò)程，我們利用藥物(CQ和3-MA)對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射，以達(dá)到抑制自噬的目的，從而觀察中心體數(shù)目在細(xì)胞自噬受到抑制后的變化情況。氯喹(Chloroquine，CQ)，可通過(guò)提高溶酶體PH值影響自噬體與溶酶體的融合過(guò)程，使得自噬過(guò)程被阻斷。3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)能夠抑制自噬過(guò)程中的III型磷脂酰肌醇激酶(Phosphoinositide 3-Kinase)信號(hào)通路，從而阻遏自噬體的產(chǎn)生。

向不同日齡的大鼠乳鼠腹腔注射生理鹽水(作為對(duì)照)、氯喹(60mg/kg)和3-甲基腺嘌呤(30mg/kg)，注射12小時(shí)后分離心室肌細(xì)胞，利用γ微管蛋白、自噬體及心肌細(xì)胞標(biāo)記物抗體做免疫細(xì)胞化學(xué)，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡成像后，統(tǒng)計(jì)不同實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中中心體與自噬體共定位的比例變化情況。結(jié)果表明，在抑制自噬后，與對(duì)照組相比心肌細(xì)胞中含有兩個(gè)中心體的比例明顯升高(圖3)。

實(shí)施例4.抑制細(xì)胞自噬后提高了心肌細(xì)胞EdU的攝取率

5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷(EdU)是一種胸腺嘧啶核苷類似物，在細(xì)胞增殖時(shí)能夠插入正在復(fù)制的DNA分子中，可以有效地標(biāo)記處于S期的細(xì)胞。利用EdU這一特點(diǎn)，向不同日齡的大鼠乳鼠腹腔注射生理鹽水(作為對(duì)照)、氯喹和3-甲基腺嘌呤，12小時(shí)后分離心肌細(xì)胞，并向培養(yǎng)基中添加EdU，培養(yǎng)兩天后利用cy5染料標(biāo)記EdU及利用心肌細(xì)胞標(biāo)記物抗體做免疫細(xì)胞化學(xué)，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡成像后，統(tǒng)計(jì)不同實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中EdU攝取率的變化情況。我們發(fā)現(xiàn)，在抑制細(xì)胞自噬的過(guò)程中，相較于對(duì)照組，注射氯喹和3-甲基腺嘌呤的心肌細(xì)胞EdU的攝取率明顯提高(圖4)，暗示抑制細(xì)胞自噬可能促進(jìn)了心肌細(xì)胞的增殖。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在乳鼠發(fā)育過(guò)程中，自噬參與到調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞中心體數(shù)目的過(guò)程中。抑制自噬可以有效緩解這一過(guò)程，并且對(duì)增加發(fā)育過(guò)程中心肌細(xì)胞增殖能力提供了一定的借鑒。為臨床治療心肌梗塞提供思路。