專利名稱：一種免疫抑制藥物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬制藥領(lǐng)域，具體涉及一種以去甲澤拉木醛為有效成分的免疫抑制藥物及其制備方法以及由其制劑在器官移植后抗排斥反應(yīng)及治療某些自身免疫性疾病的應(yīng)用。
已有研究從植物雷公藤中分離到一種淡黃色結(jié)晶物質(zhì)，其分子量為480，熔點(diǎn)為260℃(分解)，分子式為C29H36O6的酚性去甲基三萜化合物，其英文名稱為demethylzeylasteral(簡(jiǎn)稱Dzy，T-96，TZ-93)，定名去甲澤拉木醛。其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下所表示
本發(fā)明藥物按下述步驟進(jìn)行制備1.原料藥去甲澤拉木醛的提取工藝過程包括雷公藤原料的干燥、粉碎、有機(jī)溶劑的提取，有機(jī)溶劑的回收，用硅膠分離，單體化合物的鑒定。其特征是將經(jīng)干燥并粉碎藥材，置回流鍋內(nèi)，加入1-3倍的乙酸乙酯，加熱回流3小時(shí)，重復(fù)2次，得乙酸乙酯提取液，回收溶媒，得干浸膏，得率為8.25％，取浸膏5-10倍量的硅膠進(jìn)行柱層析，采用正己烷/丙酮梯度洗脫，得到去甲澤拉木醛淡黃色結(jié)晶物質(zhì)。2.去甲澤拉木醛制劑的制備1)由去甲澤拉木醛原料藥制備去甲澤拉木醛緩釋膠囊的工藝如下將硬脂醇在水浴上加熱熔融，加入去甲澤拉木醛攪勻，冷后，研碎，加羥丙甲纖維素凝膠制成軟材，制粒，干燥，整粒，裝入膠囊即得。
2)由去甲澤拉木醛原料藥制備去甲澤拉木醛軟膠囊的工藝如下去甲澤拉木醛與少量植物油混合，待分散均勻后加入余量植物油混溶，得藥液。另配明膠液，其中明膠100份，甘油55份，水100份備用，采用滴制法，制得去甲澤拉木醛軟膠囊。
3)由去甲澤拉木醛原料藥制備去甲澤拉木醛的注射劑工藝如下去甲澤拉木醛加適量乙醇和丙二醇研勻，分次加入水混合，微孔濾膜過濾，分裝玻璃安瓿中，滅菌，即得。
4)由去甲澤拉木醛原料藥制備去甲澤拉木醛的軟膏劑工藝如下取單甘酯，十八醇和液狀石蠟加熱使熔融。另取去甲澤拉木醛10倍量的氯仿和等量的甲醇，加入到去甲澤拉木醛中，使溶解，再緩緩加入上述已熔融的藥液中，溫度在80℃，不斷攪拌，使均勻。另將尼泊金乙酯、十二烷基流酸鈉、甘油和水混合后在直火加熱至90℃時(shí)全部溶解，待溫度至80℃時(shí)與上述藥液在不停攪伴的情況下，緩緩加入完，再繼續(xù)不停攪伴直至冷成稠膏狀，加入適量阿唑蒽，攪勻即得。
本發(fā)明對(duì)原料藥去甲澤拉木醛進(jìn)行了藥效及毒理實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下(一)藥效結(jié)果1、去甲澤拉木醛在體外對(duì)免疫抑制的實(shí)驗(yàn)研究1)、去甲澤拉木醛對(duì)脾細(xì)胞在絲裂原刺激下轉(zhuǎn)化的抑制作用取BALB/c小鼠脾臟制成脾細(xì)胞懸液，在含有10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中孵育，加入不同濃度的去甲澤拉木醛、環(huán)胞素A(CsA)和雷公藤多甙(TII)，分別在ConA和PHA有絲分裂原刺激下，應(yīng)用MTT方法測(cè)定脾細(xì)胞的轉(zhuǎn)化情況，了解去甲澤拉木醛對(duì)脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化的抑制程度。
結(jié)果對(duì)脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化的抑制作用在加入濃度為0.125、0.25μg/ml去甲澤拉木醛時(shí)，無論是ConA還是PHA刺激，其0D值與未加去甲澤拉木醛的相當(dāng)(P＞0.05)，而在濃度為0.5μg/ml和1.0μg/ml的去甲澤拉木醛中，OD值明顯下降，與未加去甲澤拉木醛比較有顯著性差異(P＜0.001)，顯示去甲澤拉木醛對(duì)ConA、PHA誘導(dǎo)的脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化有明顯的抑制作用。其中加0.5μg/ml去甲澤拉木醛的0D值比加入1μg/ml的TII的OD值更小(p＜0.05)，與加入1μg/ml的CsA時(shí)OD值無差異(p＞0.05)，說明去甲澤拉木醛的抑制作用比TII強(qiáng)，且達(dá)到一定濃度時(shí)與CsA的抑制作用相當(dāng)。
2)、去甲澤拉木醛對(duì)混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的抑制試驗(yàn)取C57BL/6小鼠脾細(xì)胞與滅活的BALB/c小鼠脾細(xì)胞混合，在RPMI-1640培養(yǎng)液中孵育，并分別加不同濃度的去甲澤拉木醛、CsA或TII，在終止培養(yǎng)前4h加入1μci3H-TdR，將細(xì)胞收集于玻璃纖維濾紙上，在β液閃爍計(jì)數(shù)儀上測(cè)定dpm值，觀察脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況，了解去甲澤拉木醛、TII與CsA對(duì)脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化的抑制程度。
結(jié)果混合脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化的抑制作用與絲裂原刺激脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化的試驗(yàn)研究相似，本試驗(yàn)加入不同濃度的去甲澤拉木醛、TII或CsA均顯示對(duì)脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化有抑制作用，不同濃度抑制強(qiáng)度不一。加入1μg/ml濃度的去甲澤拉木醛對(duì)混合脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化抑制作用特別強(qiáng)。3)、去甲澤拉木醛對(duì)誘生IL-2抑制作用的試驗(yàn).
取BALB/c小鼠脾制成脾細(xì)胞懸液，在RPMI-1640培養(yǎng)液中孵育，不加或加ConA刺激觀察細(xì)胞生成IL-2，并加不同濃度的去甲澤拉木醛、TII或CsA，取上清液為待測(cè)樣本。用依賴IL-2的CTLL-2細(xì)胞和已制備的待測(cè)樣本在RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，用MTT方法測(cè)定CTLL-2的轉(zhuǎn)化，以標(biāo)準(zhǔn)的rIL-2結(jié)果計(jì)算樣本的IL-2活性。
結(jié)果去甲澤拉木醛對(duì)淋巴細(xì)胞生成IL-2的抑制作用在對(duì)淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)中，不加ConA刺激，成熟的淋巴細(xì)胞也生成并釋放IL-2，其釋放量較低。不加抑制藥時(shí)，在12小時(shí)、24小時(shí)和36小時(shí)培養(yǎng)時(shí)間，IL-2的釋放量分別是7.50±0.26、2.43±0.12和2.37±0.007u/ml，其中12小時(shí)與另兩個(gè)時(shí)間組比較有明顯差異(p＜0.001)，顯示淋巴細(xì)胞釋放的IL-2活性以培養(yǎng)12小時(shí)最高，去甲澤拉木醛、TII和CsA對(duì)成熟淋巴細(xì)胞釋放的IL-2無影響，證實(shí)去甲澤拉木醛無直接的殺傷細(xì)胞作用。在培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞中，加入有絲分裂原ConA后，IL-2的活性顯著增高，在不加抑制劑的樣本中，其在培養(yǎng)12小時(shí)、24小時(shí)和36小時(shí)中IL-2量分別為48.75±3.14、45.33±2.24和27.37±1.16U/ml，36小時(shí)較1 2小時(shí)為低(p＜0.05)。在加入去甲澤拉木醛藥后，培養(yǎng)12小時(shí)去甲澤拉木醛濃度為1μg/ml時(shí)，IL-2的抑制十分顯著(12.36±2.39U/ml)，與對(duì)照樣本(48.75±3.14U/ml)比較有顯著差別(p＜0.001)，與1μg/ml濃度的TII樣本(43.17±2.65U/ml)比較，去甲澤拉木醛樣本內(nèi)IL-2明顯低于TII樣本，提示去甲澤拉木醛較TII的抑制作用強(qiáng)(p＜0.001)；與各濃度的CsA抑制作用比較，去甲澤拉木醛的抑制作用不及CsA作用強(qiáng)，CsA在0.25、0.5、1μg/ml時(shí)的IL-2活性分別是10.17±1.59、8.70±0.46、5.37±0.70u/ml，均有顯著性抑制，其IL-2的生成量較1μg/ml濃度的去甲澤拉木醛均低。值得提出的是與CsA和對(duì)照樣本比較，IL-2活性應(yīng)隨12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸消耗減少，但在有去甲澤拉木醛的樣本內(nèi)培養(yǎng)12小時(shí)至36小時(shí)，IL-2活性并未見減低的趨勢(shì)，提示去甲澤拉木醛除有抑制IL-2生成外，還有抑制IL-2受體活性的作用，而減少IL-2的消耗。
4)、去甲澤拉木醛對(duì)重組IL-2促進(jìn)CTLL-2細(xì)胞增殖的抑制作用在依賴IL-2的CTLL-2細(xì)胞懸液中加入不同濃度的去甲澤拉木醛、TII、CsA，并加rIL-2使CTLL-2轉(zhuǎn)化，用MTT方法測(cè)定OD值，了解去甲澤拉木醛對(duì)rIL-2促CTLL-2細(xì)胞轉(zhuǎn)化的抑制作用。
結(jié)果在培養(yǎng)的依賴IL-2的CTLL-2細(xì)胞中加入rIL-2，空白OD值為0.154±0.013，當(dāng)加入0.5μg/ml和1μg/ml濃度的去甲澤拉木醛后，其OD值明顯下降，分別為0.024±0.001和0.014±0.003，提示去甲澤拉木醛有抑制IL-2受體活性的作用(p＜0.001)。在0.5μg/ml和1μg/ml濃度的TII組中，其OD值與對(duì)照組比較也有小幅下降(P＜0.05和P＜0.01)，但不及去甲澤拉木醛強(qiáng)。各濃度的CsA OD值均與空白樣本相當(dāng)(p＞0.05)，表明CsA對(duì)IL-2受體活性無影響。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)去甲澤拉木醛對(duì)有絲分裂原ConA或PHA以及異體MHC抗原刺激小鼠脾細(xì)胞的轉(zhuǎn)化有明確的抑制作用，去甲澤拉木醛抑制免疫反應(yīng)的作用比TII的作用更強(qiáng)，在達(dá)到一定濃度時(shí)，其抑制作用的強(qiáng)度甚至與CsA相當(dāng)。去甲澤拉木醛不僅有抑制脾淋巴細(xì)胞生成或釋放IL-2的作用，還有對(duì)IL-2受體活性的抑制作用。
2、去甲澤拉木醛對(duì)大鼠原位腎移植模型的實(shí)驗(yàn)研究1)、建立大鼠原位腎移植研究模型采用250-300g體重，雄性Wistar和SD大鼠作為腎移植的供、受體鼠。暴露供體大鼠的左腎并在手術(shù)顯微鏡下解剖游離左腎動(dòng)靜脈、輸尿管上段，阻斷左腎血管的上下腹主動(dòng)脈，經(jīng)腹主動(dòng)脈對(duì)左腎灌注0～4℃的腎保存液8ml，切取左腎并修整左腎血管和輸尿管。充分暴露受體大鼠的左側(cè)腎臟，在手術(shù)顯微鏡下游離左腎及血管、輸尿管上段，緊靠腹主動(dòng)脈阻斷腎動(dòng)脈、靜脈，橫斷動(dòng)靜脈及輸尿管上段切除左腎，殘端血管肝素鹽水沖洗，分別間斷端端吻合供腎動(dòng)脈與受體腎動(dòng)脈，兩定點(diǎn)連續(xù)端端縫合腎靜脈，開放血管見腎血供良好、顏色紅潤(rùn)、輸尿管流尿，輸尿管與輸尿管上段間斷縫合，切除右腎。術(shù)畢大鼠保溫直到蘇醒。結(jié)果經(jīng)本方法建立的大鼠腎移植模型的成功率較高，可達(dá)80％的成功率，手術(shù)成功的大鼠排泄性尿路造影見移植腎功能好，排泄通暢，無明顯尿路梗阻。血BUN、Cr檢查正常范圍。與術(shù)前自身的BUN、Cr比較，t檢驗(yàn)P＞0.05，差別無顯著性，提示腎功能良好。手術(shù)3天移植腎切取做病理觀察，鏡下腎組織有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小球及腎小管完好。結(jié)論在手術(shù)顯微鏡下建立左腎原位大鼠腎移植模型，能達(dá)到腎功能正常的要求。
2)、去甲澤拉木醛與TII抑制大鼠移植腎排斥作用的比較研究雄性Wistar、SD大鼠為供、受體，行腎移植大鼠70只，隨機(jī)分為7個(gè)組，每組8只，其一為對(duì)照組。每組另有2只預(yù)備在14天時(shí)處死。對(duì)照組每天每只鼠生理鹽水4ml灌胃，去甲澤拉木醛用藥三個(gè)組分別每天每鼠灌4ml內(nèi)含5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg的去甲澤拉木醛藥液，TII分三個(gè)組，分別每天每鼠灌胃4ml內(nèi)含20mg/kg、40mg/kg和60mg/kg藥液。灌胃時(shí)間為每天至死亡或14天。觀察大鼠活動(dòng)和進(jìn)食情況，用藥前及用藥14天各取血一次檢查血紅蛋白、肝功能情況，用藥14天處死1只或死亡時(shí)取腸、肝、腎行病理組織學(xué)檢查。分別記錄各組大鼠存活天數(shù)。
結(jié)果去甲澤拉木醛用藥5mg/kg大鼠平均存活時(shí)間為7.1±0.65天，與對(duì)照組6.9±0.64天比較無顯著性差異(P＞0.05)，提示去甲澤拉木醛5mg/kg對(duì)大鼠移植腎排斥無抑制作用；去甲澤拉木醛用10mg/kg和20mg/kg時(shí)，其平均生存期提高到14.7±1.04天和18.0±1.51天，與對(duì)照組比較差異顯著(p＜0.001)，表明此兩個(gè)劑量去甲澤拉木醛對(duì)大鼠移植腎存活有延長(zhǎng)作用。其兩組間比較20mg/kg組較10mg/kg組存活期長(zhǎng)。與TII用藥組比較，去甲澤拉木醛10mg/kg存活期與TII 40mg/kg和60mg/kg的存活期相當(dāng)(p＞0.05)，但去甲澤拉木醛20mg/kg的存活期較TII任何一組都長(zhǎng)(p＜0.01)。組織病理學(xué)檢查對(duì)照組死亡鼠腎臟表現(xiàn)為典型及嚴(yán)重的急性排斥反應(yīng)，去甲澤拉木醛5mg/kg組與TII 20mg/kg組的移植腎改變與對(duì)照組相似。去甲澤拉木醛10mg/kg組與TII 40mg/kg和60mg/kg組，在14天移植腎組織中見較多的淋巴細(xì)胞，已有排斥反應(yīng)出現(xiàn)，只有去甲澤拉木醛20mg/kg組14天時(shí)腎組織中僅見少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，未見有明顯的排異征象。小腸和肝組織檢查未見異常。用藥前和用藥14天的血紅蛋白、ALT、TP檢查差別無顯著性(p＞0.05)。
結(jié)論去甲澤拉木醛給藥對(duì)大鼠移植腎的排斥有確切的抑制作用，其作用強(qiáng)度與劑量呈正相關(guān)。，10mg/kg和20mg/kg用藥14天均能顯著延長(zhǎng)移植腎的存活，但以20mg/kg組更為理想，與TII用藥組比較，去甲澤拉木醛20mg/kg作用要強(qiáng)。去甲澤拉木醛20mg/kg給藥14天尚不至于對(duì)大鼠造成毒性副作用。3)、去甲澤拉木醛與CsA抑制大鼠移植腎排斥作用的比較研究以雄性Wistar、SD大鼠為供、受體，行腎移植大鼠80只，隨機(jī)分為8組，每組8只。每組另有2只預(yù)備在14天時(shí)處死。各組分別給予4ml含Pred 10mg/kg、去甲澤拉木醛10mg/kg、去甲澤拉木醛20mg/kg、去甲澤拉木醛10mg/kg+Pred 10mg/kg、CsA 5mg/kg、CsA10mg/kg和CsA 10mg/kg+Pred 10mg/kg藥液，每鼠每天灌胃一次至死亡或14天。同時(shí)觀察記錄各組大鼠的生存天數(shù)，取死亡鼠或14天處死預(yù)備大鼠取小腸、肝、腎等做組織病理切片檢查，以及用藥前和14天時(shí)的血紅蛋白、ATL、TP檢查。
結(jié)果單用去甲澤拉木醛兩個(gè)劑量組(10mg/kg和20mg/kg)均能顯著延長(zhǎng)大鼠的存活時(shí)間，與對(duì)照組比較均有明顯差異(p＜0.01)。其中10mg/kg組存活時(shí)間與單用CsA的5mg/kg劑量組相當(dāng)，差別無顯著性(p＞0.05)。單用強(qiáng)的松10mg/kg預(yù)防大鼠移植腎排斥幾乎無作用，其平均生存期與對(duì)照組比較差別無顯著性意義(p＞0.05)。但去甲澤拉木醛10mg/kg與Pred 10mg/kg合用卻能延長(zhǎng)大鼠的生存期至31.75±6.48天。用藥14天時(shí)的移植腎在去甲澤拉木醛20mg/kg、CsA10mg/kg組及兩個(gè)聯(lián)合用藥組，腎病理檢查無明顯病變，而其他組已有不同程度的排斥征象如淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。各組在用藥14天的血紅蛋白、ALT、TP檢查無異常，14天時(shí)取肝、小腸做病理檢查也未見異常。
結(jié)論證實(shí)去甲澤拉木醛具有較強(qiáng)的免疫抑制作用，單獨(dú)應(yīng)用10mg/kg或20mg/kg能顯著地延長(zhǎng)大鼠移植腎的存活時(shí)間，存活時(shí)間在一定范圍內(nèi)隨劑量加大而延長(zhǎng)。單獨(dú)應(yīng)用Pred 10mg/kg對(duì)腎移植大鼠存活期無延長(zhǎng)作用，但與去甲澤拉木醛10mg/kg合用，卻能成倍地延長(zhǎng)單用同劑量的去甲澤拉木醛的大鼠存活時(shí)間，在短時(shí)間內(nèi)應(yīng)用適當(dāng)劑量的去甲澤拉木醛，不會(huì)出現(xiàn)可見的毒性副作用。(二)、毒理實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、急性毒性試驗(yàn)取雌雄小鼠體重為18～22g，各30只，隨機(jī)分為6組，每組雌雄小鼠各5只，各組分別按192mg/kg、240mg/kg、300mg/kg、375mg/kg和468mg/kg給每只小鼠去甲澤拉木醛一次灌胃，對(duì)照組給生理鹽水，容積為0.8-0.9ml，觀察小鼠死亡情況，求LD50值，并取臟器病理檢查。
結(jié)果去甲澤拉木醛的LD50為286.135mg/kg。LD50的95％可信限283.92-288.39mg/kg。去甲澤拉木醛的主要毒性器官是腸道和肝。
2、亞急性毒性試驗(yàn)取小鼠40只，隨機(jī)分為4個(gè)組，每組10只，雌雄各半。分別給予各組按生理鹽水、去甲澤拉木醛10mg、20mg、和80mg/kg，給每只小鼠每天灌胃一次，共14天，容積為0.8ml，觀察小鼠活動(dòng)、飲食、體重、血常規(guī)、血生化和臟器的病理檢查。
結(jié)果去甲澤拉木醛每天80mg/kg給藥時(shí)，初始可造成小鼠厭食，體重下降，可能與進(jìn)食減少有關(guān)。80mg/kg組用藥14天，血紅蛋白和WBC有一定下降，肝功能檢查及病理檢查提示80mg/kg對(duì)肝臟有輕度的毒性作用，小腸粘膜絨毛輕度腫脹，固有膜內(nèi)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而10mg和20mg/kg組未見有上述病變。
毒理研究證明去甲澤拉木醛與目前雷公藤中提到的主要成分相比，如雷公藤多甙(TII)小鼠口服LD50為159.70mg/kg，腹腔注射為93.99mg/kg；雷公藤甲素(雷公藤內(nèi)酯醇)小鼠腹腔注射的LD50為0.9mg/kg；雷公藤紅素是10.9mg/kg；而去甲澤拉木醛的小鼠口服LD50為286.135mg/kg，毒性明顯低于這些化合物。
本發(fā)明免疫抑制藥物毒性副作用極少、來源廣泛、生產(chǎn)成本低，價(jià)格便宜、應(yīng)用方便，還可用于治療臨床其他自身免疫性疾病如紅斑狼瘡等。
權(quán)利要求
1.種免疫抑制藥物，其特征是含有有效劑量的去甲澤拉木醛和藥學(xué)上可接受的賦形劑。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫抑制藥物，其特征是所述的去甲澤拉木醛和賦形劑配比是1∶20-300。3、根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的免疫抑制藥物，其特征是可制成緩釋膠囊、軟膠囊，注射劑和軟膏劑。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物，其特征是去甲澤拉木醛的含量是a、緩釋膠囊每粒在10-30mg，，b、軟膠囊每粒在10-20mg，，c、注射劑每ml在1-5mg，，d、軟膏劑為0.15-3％。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫抑制藥物的制備方法，其中所述的去甲澤拉木醛是由下列方法得到雷公藤根皮經(jīng)干燥并粉碎處理，向已處理的原料中加入乙酸乙酯，，加熱回流，得提取液，回收溶媒，得干浸膏，進(jìn)行硅膠柱層析，用正己烷/丙酮梯度洗脫，得淡黃色粉狀物--去甲澤拉木醛原料藥。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其中所述的乙酸乙酯加入量為原料的1-3倍，所述的硅膠加入量為浸膏的5-10倍量。
全文摘要
本發(fā)明屬制藥領(lǐng)域,具體涉及一種從雷公藤中提取得到單體化合物去甲澤拉木醛,以其為有效成分的免疫抑制藥物及其制備方法。本發(fā)明單體化合物去甲澤拉木醛可作為藥物原料制成口服緩釋制劑、軟膠囊、注射劑、軟膏劑等。本發(fā)明免疫抑制藥物毒性副作用極少、來源廣泛、生產(chǎn)成本低,價(jià)格便宜、應(yīng)用方便,本發(fā)明藥物用于器官移植后抗排斥反應(yīng)效果明顯,還可用于治療臨床其他自身免疫性疾病如紅斑狼瘡等。
文檔編號(hào)C07J63/00GK1369266SQ0211082
公開日2002年9月18日 申請(qǐng)日期2002年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月8日
發(fā)明者楊春欣, 林宗明 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院