多肽的修飾的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生產(chǎn)具有期望的結(jié)合活性的多膚配體的方法。特別地，本發(fā)明設(shè)及多 膚的生產(chǎn)，所述多膚共價結(jié)合于分子支架，從而兩個或更多膚環(huán)在支架的附著點之間相對。 分子支架與多膚的附著在純化樹脂上進(jìn)行，純化樹脂可W為磁性樹脂珠粒的形式。
【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)膚能夠W高親和性結(jié)合并特異性地祀向蛋白祀標(biāo)，因而是用于治療開發(fā)的有 吸引力的分子類型。實際上，數(shù)個環(huán)膚已經(jīng)成功用于臨床，例如，抗菌膚萬古霉素，免疫抑 制藥物環(huán)抱霉素或抗癌藥物奧曲膚（ocreotide)值riggers等人，化tRevDrugDiscov 2008, 7 (7)，608-24)。良好的結(jié)合特性來自膚和祀標(biāo)之間形成的相對大的相互作用表面， W及降低的環(huán)狀結(jié)構(gòu)構(gòu)象柔性。通常，大環(huán)結(jié)合數(shù)百平方埃的表面，例如，環(huán)膚CXCR4括抗 劑CVX15 ( 400A: ;Wu，B.等人，Science330 化007)，1066-71)，結(jié)合整合素aVb3 的具有 Arg-Gly-Asp基序的環(huán)膚（355A2 )狂iong,J.P.等人，Science2002, 296 巧565)，151-5)、 或結(jié)合尿激酶型纖溶酶原激活物的環(huán)膚抑制劑upain-1 ( 60.;A2 ;Zhao,G.等人，JStruct Biol2007, 160(1)， 1-10)。
[0003] 由于其環(huán)狀構(gòu)型，大環(huán)膚比線性膚柔性低，導(dǎo)致了在結(jié)合祀標(biāo)時賭損失較少，得到 了較高的結(jié)合親和性。降低的柔性還導(dǎo)致鎖定祀標(biāo)特異性構(gòu)象，與線性膚相比增加了結(jié)合 特異性。該效果已經(jīng)被基質(zhì)金屬蛋白酶8(MMP-8)有效的選擇性抑制劑例證了，其中當(dāng)所述 抑制劑的環(huán)打開時，失去了對其他MMP的選擇性（Cherney,R.J.等人，JMed化em1998， 41 (11)，1749-51)。通過大環(huán)化實現(xiàn)的有利的結(jié)合特性，甚至在具有一個W上膚環(huán)的多環(huán)膚 中更顯著，例如，在萬古霉素、乳酸鏈球菌膚（nisin)或放線菌素中。
[0004] 之前不同的研究小組將帶有半脫氨酸殘基的多膚連接至合成的分子結(jié)構(gòu)上 (Kemp,D.S和McNamara,P.E. ,J.Org.Qiem, 1985Jimmerman,P.等人，QiemBioQiem, 200f5)。 Meloen和合作者使用S(漠甲基）苯和相關(guān)分子將多個膚環(huán)快速且定量地環(huán)化至合成的支 架上，用于蛋白表面的結(jié)構(gòu)化模擬（Timmerman,P.等人，ChemBioChem,200f5)。生成候選藥 物化合物的方法公開于W02004/077062和W02006/078161中，其中通過將含有半脫氨酸的 多膚連接至例如=(漠甲基）苯的分子支架生成所述化合物。 陽0化]W02004/077062公開了選擇候選藥物化合物的方法。特別地，該文獻(xiàn)公開了包括第 一和第二反應(yīng)基團(tuán)的各種支架分子，W及使所述支架與另外的分子接觸，來在偶聯(lián)反應(yīng)中 在支架和另外的分子之間形成至少兩個連接。
[0006] W02006/078161公開了結(jié)合化合物、免疫原性化合物和模擬膚。該文獻(xiàn)公開了來 自現(xiàn)有蛋白的膚的各種集合的人工合成。之后將運些膚與恒定的合成膚組合W生成組合文 庫，其中恒定的合成膚具有某些引入的氨基酸改變。通過由化學(xué)連接將運種多樣性引入來 區(qū)分W各種氨基酸改變?yōu)樘卣鞯哪w，為發(fā)現(xiàn)期望的結(jié)合活性提供了增加的機會。該文獻(xiàn)的 附圖1顯示了各種環(huán)膚構(gòu)建體的合成的示意圖。該文獻(xiàn)中公開的構(gòu)建體依賴-甜功能化膚， 典型地包含半脫氨酸殘基，和支架上的雜芳基，典型地包含芐基面素取代基如二-或=-漠 苯基苯。運樣的基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，在膚和支架之間形成硫酸連接。
[0007] 化inis等人最近開發(fā)了基于隧菌體展示的組合方法，來產(chǎn)生和篩選興趣祀標(biāo)的雙 環(huán)膚的大文庫化einis等人，化t化emBiol2009,5(7)，502-7;也可參見國際專利申請 W02009/098450)。簡言之，將線性膚的組合文庫在隧菌體上展示，其中線性膚含有=個半脫 氨酸殘基和六個隨機氨基酸（切S-狂aa)6-切S-狂aa)6-切S)的兩個區(qū)域，并通過半脫氨酸 側(cè)鏈共價連接至小分子（=(漠甲基）苯）進(jìn)行環(huán)化。在對人蛋白酶組織蛋白酶G和血 漿激膚釋放酶（PK)的親和性選擇中，分離的雙環(huán)膚具有納摩爾級的抑制常數(shù)。最好的抑 制劑PK15W3nM的Ki抑制人PK化PK)。在數(shù)個分離雙環(huán)膚的氨基酸序列中的相似性表明 兩個膚環(huán)均有助于結(jié)合。在最高測試濃度（10yM)下，PK15既不抑制大鼠PK(81%序列 同一性），也不抑制同源的人類絲氨酸蛋白酶因子XIa化巧la;69%序列同一性）或凝血酶 (36%序列同一性HHeinis等人，化tChemBiol2009,5(7)，502-7)。運一發(fā)現(xiàn)表明雙環(huán) 抑制劑擁有對其祀標(biāo)高度的親和性，并且是高度特異的。
[0008] 盡管化inis等人公開的方法對于展示的多膚配體的修飾來產(chǎn)生雙環(huán)膚是有效 的，但其效率非常低。例如，W每初始隧菌體顆粒350分之1的比例生成感染性隧菌體。因 此我們開發(fā)了一種改進(jìn)的方法，用于修飾遺傳展示系統(tǒng)上展示的多膚配體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 在第一方面，本發(fā)明提供了一種方法，用于將遺傳展示系統(tǒng)上展示的膚與分子支 架綴合，包括步驟：
[0010] (a)將在遺傳展示系統(tǒng)上展示的多膚與純化樹脂相組合，使得展示系統(tǒng)結(jié)合樹脂， 并用還原劑處理結(jié)合的展示系統(tǒng)；
[0011] 化）使結(jié)合的展示系統(tǒng)接觸分子支架；
[0012] (C)從結(jié)合的展示系統(tǒng)中去除未反應(yīng)的分子支架；W及
[0013] (d)從純化樹脂上洗脫展示系統(tǒng)。
[0014] 化inis等人的原始方法在自由溶液（化eesolution)中實施膚和分子支架 (TBMB)的綴合。之后通過離屯、分離攜帶有綴合于（或未綴合）TBMB支架的膚的隧菌體。通 過將隧菌體綴合于固相純化樹脂，我們獲得了改進(jìn)的結(jié)果，純化樹脂之后可用于分離隧菌 體。例如，該樹脂可W通過離屯、分離，或保留在柱子中；在一個優(yōu)選的實施方式中，該樹脂是 磁性的并且可W通過施加磁場來分離。
[0015] 化inis等人使用無二硫化物隧菌體（disul地ide-化ee地age)獲得了更好的膚 和分子支架（TBMB)綴合結(jié)果。使用本文所述的技術(shù)，通過將多膚綴合于野生型pin外殼蛋 白使得其展示在隧菌體顆粒上，我們獲得了改進(jìn)的結(jié)果，比化inis等人獲得的結(jié)果更好。
[0016] 雖然野生型pin受制于在將分子支架偶聯(lián)于多膚的步驟中使用的還原劑造成的 二硫鍵降解，我們發(fā)現(xiàn)相比于無二硫化物隧菌體，攜帶野生型pin的隧菌體的增強的感染 性大大彌補了二硫鍵降解造成的任何活性損失。
[0017] 優(yōu)選地，多膚通過融合于fd隧菌體（如fd-tet隧菌體）的pin蛋白上來展示。
[0018] 在實施方式中，遺傳展示系統(tǒng)選擇自隧菌體展示、核糖體展示、mRNA展示、酵母展 示和細(xì)菌展示。在一個實施方式中，遺傳展示系統(tǒng)是隧菌體展示。
[0019] 在一個實施方式中，在加入分子支架前，緊隨步驟（a)的是洗涂步驟。例如，可W 用還原劑的溶液進(jìn)行洗涂，例如步驟（a)中使用的還原劑。有利地，洗涂步驟中使用的還原 劑比步驟（a)中使用的還原劑不那么強或更稀。
[0020] 優(yōu)選地，包括低于500mM，優(yōu)選低于200mM，有利地低于lOOmM濃度的步驟（a)中所 用的還原劑。例如，還原劑存在的濃度為lOmM或更低，如ImM。 陽〇2U 優(yōu)選地，包括低于500iiM，優(yōu)選低于200iiM，有利地低于100iiM濃度的步驟化） 中的還原劑。例如，還原劑存在的濃度為10yM或更低，如1iiM。
[0022] 結(jié)合于樹脂的多膚可純化的形式暴露于還原劑，或者可W出現(xiàn)在培養(yǎng)中。遺 傳展示系統(tǒng)設(shè)及在細(xì)胞如細(xì)菌或酵母中復(fù)制；運些細(xì)胞可W經(jīng)純化去除，在運種情況下步 驟（a)可W包含洗涂步驟，在洗涂步驟中結(jié)合于樹脂的多膚在緩沖液中洗涂，并與細(xì)胞培 養(yǎng)雜質(zhì)相分離。
[0023] 一種合適的還原劑是TCEP。其他還原劑，如DTT，如本文所述可W使用。
[0024] 還原和綴合反應(yīng)優(yōu)選在室溫下實施，如25°C。在一些實施方式中，綴合反應(yīng)可W在 30°C下實施。在前述的化inis等人的方法中，反應(yīng)在高于室溫的溫度下實施，例如42°C。
[0025] 還原和綴合反應(yīng)有利地實施少于一小時的一段時間。例如，反應(yīng)可W實施30分 鐘、20分鐘、15分鐘或10分鐘。
[00%] 多膚優(yōu)選是含有至少=個反應(yīng)基團(tuán)的多膚，其被至少兩個序列隔開，當(dāng)綴合于分 子支架時可W形成多膚的"環(huán)"。運些環(huán)可W是任何合適的長度，如二、=、四、五、六、屯或更 多氨基酸長。運些環(huán)可W是同樣長度，或不同。優(yōu)選地，至少提供兩個環(huán)。在一些實施方式 中，可W出現(xiàn)立、四、五、六或更多的環(huán)。
[0027] 多膚中的反應(yīng)基團(tuán)能夠與支架形成共價連接。最常見地，反應(yīng)基團(tuán)包括半脫氨酸 殘基。
[0028] 膚與純化樹脂相組合，純化樹脂可W是作為固相用于蛋白質(zhì)材料純化的任何合適 樹脂。許多樹脂，如包括珠粒和色譜材料的離子交換樹脂，在本領(lǐng)域公知可用于運種目的。
[0029] 在一個有利的實施方式中，該樹脂是磁性樹脂，其允許結(jié)合在遺傳展示系統(tǒng)上的 多膚的磁分離。
[0030] 支架可W是為多膚反應(yīng)基團(tuán)提供多個附著點的任何結(jié)構(gòu)。典型的支架在下面描 述。支架分子綴合于多膚，同時多膚滲入遺傳展示系統(tǒng)中，使得遺傳展示系統(tǒng)展示包含分子 支架的多膚配體。多余的支架被去除。
[0031] 支架綴合于多膚上之后，從樹脂上洗脫滲入了多膚配體的遺傳展示系統(tǒng)。該多膚 之后可綴合形式在遺傳展示系統(tǒng)上展示，W及通過已知的方法選擇。
[0032] 在實施方式中，多膚配體是多特異性的。在第一架構(gòu)中，例如，通過多膚與分子支 架相互作用形成的多膚環(huán)能夠結(jié)合于一個W上的祀標(biāo)。在運種架構(gòu)中，在一個實施方式中 可W單獨選擇環(huán)來結(jié)合期望的祀標(biāo)，之后進(jìn)行組合。在另一個實施方式中，環(huán)作為單獨結(jié)構(gòu) 的一部分被一起選擇，來結(jié)合不同的期望祀標(biāo)。
[0033] 在第二架構(gòu)中，功能基團(tuán)可W附著至多膚的N或C末端，或兩端。該功能基團(tuán)可W 采用能結(jié)合于祀標(biāo)的結(jié)合基團(tuán)的形式，如多膚，包括抗體結(jié)構(gòu)域、Fc結(jié)構(gòu)域或如上面描述的 其他結(jié)構(gòu)化的膚。此外，其可W采用能化學(xué)鍵合于祀標(biāo)的反應(yīng)基團(tuán)的形式。再者，其可W為 效應(yīng)基團(tuán)，包括大的血漿蛋白，如血清白蛋白，W及細(xì)胞穿透膚。
[0034] 在第S架構(gòu)中，功能基團(tuán)可W附著至分子支架自身。功能基團(tuán)的示例是如前述的 架構(gòu)。
[0035] 在其他實施方式中，多膚配體包含Wn個附著點連接于分子支架的多膚，其中所 述多膚被環(huán)化，并形成n個分開的環(huán)，分開的環(huán)在分子支架上所述n個附著點之間相對，其 中n大于或等于2。
[0036] 多膚優(yōu)選通過N-到C-末端融合來環(huán)化，并且可W在附著于分子支架之前或之后 進(jìn)行環(huán)化。優(yōu)選附著先于環(huán)化。
[0037] 用于膚環(huán)化的一些方法是本領(lǐng)域已知的。例如，多膚通過N-C交聯(lián)環(huán)化，使用交聯(lián) 劑如邸C。
[0038] 在另一個實施方式中，膚可W設(shè)計成包含保護(hù)的r或C°衍生氨基酸，并且通過保 護(hù)的^或C°衍生氨基酸的去保護(hù)來環(huán)化，進(jìn)而將所述氨基酸偶聯(lián)至多膚的對向末端。
[0039] 在優(yōu)選的實施方式中，多膚通過酶的方法環(huán)化。 W40] 例如，該酶是轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶，例如微生物轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶，如茂源鏈霉菌 (Str巧tomycesmobaraensis)轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶。為了利用酶環(huán)化，有必要在多膚中為酶滲入 N-和/或C-末端底物序列。一些或全部的底物序列能夠在酶反應(yīng)中除去，意味著環(huán)化的多 膚在其最終架構(gòu)中可能不會含有底物序列。
[0041] 在再進(jìn)一步的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的多膚配體特異于人類激膚釋放酶，并且 包含含有至少=個反應(yīng)基團(tuán)的多膚，被至少兩個環(huán)序列分隔開，W及與多膚的反應(yīng)基團(tuán)形 成共價鍵的分子支架，使得在分子支架上形成至少兩個多膚環(huán)，其中膚配體的環(huán)包含=、四 或五，但少于六個氨基酸。
[0042] 令人驚訝地，我們發(fā)現(xiàn)在各環(huán)中包含少于6個氨基酸的膚對激膚釋放酶具有更高 的結(jié)合親和性。 W43] 在一個實施方式中，膚配體的環(huán)包含立個氨基酸，并且多膚有共有序列 GfFxxGfRVxGr，其中Gr是反應(yīng)基團(tuán)。
[0044] 在另一個實施方式中，膚配體的環(huán)包含五個氨基酸，并且第一環(huán)包含共有序列 GfGGxxNGr，其中Gr是反應(yīng)基團(tuán)。
[0045] 例如，多膚的兩個相鄰的環(huán)可W包含共有序列GfGGxxNGfRxxxxGr。
[0046] 在一個實施方式中，膚配體的環(huán)包含五個氨基酸，并且第一環(huán)包含基序GfxVpPxV ?Gf，其中Gf是反應(yīng)基團(tuán)。在本上下文中，提及"第一"環(huán)時，并不一定指序列中環(huán)的特定位置。 不過，在一些實施方式中，第一環(huán)可W是氨基末端到簇基末端膚序列中的近端環(huán)。例如，多 膚進(jìn)一步包含第二遠(yuǎn)端環(huán)，其含有基序GfT/JlVTxLGf。第一環(huán)的序列的示例包括GfXWPARGf， GfXWPSRGr，GfXFPFRGr和GfXFPYRGr。在運些示例中，X可W是任何氨基酸，但例如是S或R。
[0047] 在一個實施方式中，膚配體的環(huán)包含五個氨基酸，并且第一環(huán)包含基序Gf址址LGf， 其中Gf是反應(yīng)基團(tuán)。
[0048] 在一個實施方式中，膚配體的環(huán)包含五個氨基酸，并且第一環(huán)包含基序G；fflxxLGf， 其中Gf是反應(yīng)基團(tuán)。 W例在一個實施方式中，多膚包含兩個鄰近的環(huán)，其包含基序Gfx7pPxVKGfT/；HVTDLGf。
[0050] 在本文的實施例中，數(shù)字表示環(huán)中的位置，并且忽略反應(yīng)基團(tuán)。因此，在GfxVpPxV nGrVLHVTDLGr中，X在位置1，T/L在位置6。
[0051] 在前述實施方式中，反應(yīng)基團(tuán)優(yōu)選是反應(yīng)性氨基酸。優(yōu)選地，反應(yīng)性氨基酸是半脫 氨酸。
[0052] 如上所述，可通過鑒定對突變有用的那些殘基并通過制備在那些位置上包含突變 的文庫，制備根據(jù)本發(fā)明運一方面的多膚變體。
[0053] 在另一方面中，提供了根據(jù)本發(fā)明的前述方面的多膚配體，其包含一個或更多非 天然氨基酸取代，并且抵抗蛋白酶降解。
[0054] 我們發(fā)現(xiàn)某些非天然氨基酸允許WnMKi來結(jié)合血漿激膚釋放酶，同時顯著增加 在血漿中的停留時間。
[0055] 在一個實施方式中，非天然氨基酸選自N-甲基精氨酸、高精氨酸 (homo-arginine)和徑脯氨酸。優(yōu)選地，精氨酸的N-甲基和同型化omo-)衍生物被用來取 代精氨酸，另外優(yōu)選地脯氨酸3可W被徑脯氨酸、氮雜環(huán)下燒簇酸（azetidinecarboxylic acid)、或a取代氨基酸如氨基異下酸（aminoisobutyricacid)取代。在另一個實施方式 中，精氨酸可W被脈基-苯丙氨酸（guanid}d-phenylalanine)取代。
[0056] 在一個實施方式中，多膚包含含有基序GfXWPARGf的第一環(huán)，其中P被氮雜環(huán)下燒 簇酸取代；和/或R被N-甲基精氨酸取代；和/或R被高精氨酸取代；和/或R被脈基-苯 丙氨酸取代。
[0057] 在一個實施方式中，多膚包含含有基序GfXFPYRGf的第一環(huán)，其中R被N-甲基精氨 酸取代；和/或R被高精氨酸取代，并且其中脯氨酸被氮雜環(huán)下燒簇酸取代；和/或R被脈 基-苯丙氨酸取代。
[0058] 在一個實施方式中，多膚配體可W進(jìn)一步包含肌氨酸聚合物，用作接頭來將多膚 配體連接在一起，或連接一個或更多功能基團(tuán)。
[0059] 在一些實施方式中，多膚配體可W是蛋白酶抗性的。蛋白酶抗性的綴合物可W通 過篩選多膚配體庫的蛋白酶抗性來選擇。
【附圖說明】 W60] 圖1 :評估連接隧菌體展示的膚和S(漠甲基）苯燈BMB)的反應(yīng)條件。（A)與20mM畑4肥〇3中的10yMTBMB、5mMEDTA、p