在培養(yǎng)期間減少乳酸累積的方法和生產(chǎn)多肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】 [0001] 。
[0002] 本發(fā)明設(shè)及減少細(xì)胞培養(yǎng)物中的乳酸累積的方法，所述方法包括將二價(jià)過渡金屬 鹽添加至細(xì)胞培養(yǎng)物的步驟。本發(fā)明還設(shè)及生產(chǎn)多膚的方法，所述方法包括將二價(jià)過渡金 屬鹽添加至細(xì)胞培養(yǎng)基W減少乳酸累積，W及使多膚發(fā)酵和回收多膚的步驟。更具體地，本 發(fā)明設(shè)及使細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中生長的方法，所述細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)減少培養(yǎng)基中的乳酸累 積。
【背景技術(shù)】
[0003] 動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥研究和制藥工業(yè)。評估細(xì)胞生長和代謝活 動是成功控制和改進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)過程的關(guān)鍵。最常用的兩種被監(jiān)測代謝產(chǎn)物是葡萄糖和乳 酸。葡萄糖作為大部分培養(yǎng)基配方的主要碳源和重要的能量來源。葡萄糖進(jìn)入糖酵解途徑 導(dǎo)致形成丙酬酸作為終產(chǎn)物。在動物細(xì)胞中，丙酬酸可W穿梭于TCA循環(huán)中或被轉(zhuǎn)化成乳 酸。由于葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)楸晁岬母咄縒及糖酵解和TCA循環(huán)之間的低效結(jié)合，導(dǎo)致在連 續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)中易于發(fā)生乳酸累積。積聚的乳酸轉(zhuǎn)而導(dǎo)致培養(yǎng)環(huán)境的酸化。此外，即使在控 制K1的情況下，乳酸本身也可能對哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生毒性。乳酸的積累往往是細(xì)胞培養(yǎng)過 程的關(guān)鍵限制因素，特別是當(dāng)細(xì)胞密度高時(shí)。
[0004] 在生物制藥生產(chǎn)中，由于簡單和可靠的測量及其在培養(yǎng)基中的化學(xué)穩(wěn)定性，監(jiān)測 葡萄糖和乳酸已成為日常操作。更重要的是，葡萄糖濃度用于評估能量，而乳酸作為代謝副 產(chǎn)物累積的重要參數(shù)和培養(yǎng)環(huán)境惡化的指標(biāo)。在生物反應(yīng)器操作中，作為重要的培養(yǎng)參數(shù)， 葡萄糖和乳酸測量通常是設(shè)計(jì)過程控制，比如進(jìn)料或灌注策略，的關(guān)鍵部分。
[0005] 在過去，對葡萄糖和乳酸代謝與細(xì)胞密度的相關(guān)性做了很大努力。葡萄糖的消耗 速率和乳酸的累積速率反映培養(yǎng)的細(xì)胞的代謝活性。
[0006] 如之前所述，有毒副產(chǎn)物，如乳酸，的積累對細(xì)胞生長和抗體的生產(chǎn)有抑制作用。 過量的乳酸積聚可W導(dǎo)致培養(yǎng)基的滲透壓的增加，或在不控制抑的情況下，導(dǎo)致培養(yǎng)PH下 降。乳酸的主要負(fù)面影響是由乳酸分泌至培養(yǎng)基中引起的抑值的降低造成的。
[0007] 美國專利號6156570教導(dǎo)用于培養(yǎng)細(xì)胞優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞的、使乳酸累積量最小 化的方法。
[0008] 美國專利號7429491教導(dǎo)在動物細(xì)胞培養(yǎng)中將有限的葡萄糖用于分批補(bǔ)料培養(yǎng) 的提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量的方法。
[0009] 在過去，已經(jīng)嘗試降低乳酸水平，主要通過A]補(bǔ)充并保持非常低水平的葡萄糖； 或B]利用分子生物技術(shù)的細(xì)胞代謝工程。
[0010] 本發(fā)明掲示了添加二價(jià)過渡金屬鹽(銅，鋒）和乳酸累積之間的相關(guān)性W及減少乳 酸累積的可能途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 因此，本發(fā)明設(shè)及減少細(xì)胞培養(yǎng)物中的乳酸的累積的方法，所述方法包括將二價(jià) 過渡金屬鹽加入細(xì)胞培養(yǎng)物中的步驟；W及生產(chǎn)多膚的方法，所述方法包括W下步驟：a) 將二價(jià)過渡金屬鹽加入細(xì)胞培養(yǎng)物中W減少乳酸累積；W及b)使多膚發(fā)酵并回收多膚。
【附圖說明】
[0012] 圖1A展示了存在銅鹽的情況下Vs對照的乳酸累積水平的區(qū)別。
[0013] 圖1B展示了存在鋒鹽的情況下Vs對照的乳酸累積水平的區(qū)別。
[0014] 圖2A展示了存在銅鹽的情況下Vs對照的乳酸累積水平的區(qū)別。
[0015] 圖2B展示了存在鋒鹽的情況下Vs對照的乳酸累積水平的區(qū)別。
[0016] 圖3展示了存在鋒鹽的情況下Vs對照的乳酸累積水平的區(qū)別。
[0017] 圖4A展示了存在銅鹽的情況下Vs對照的乳酸累積水平的區(qū)別。
[0018] 圖4B展示了存在鋒鹽的情況下Vs對照的乳酸累積水平的區(qū)別。
[0019] 圖5A展示了存在銅鹽的情況下Vs對照的乳酸累積水平的區(qū)別。
[0020] 圖5B展示了存在鋒鹽的情況下Vs對照的乳酸累積水平的區(qū)別。
[0021] 圖6展示了存在儀鹽的情況下Vs對照的乳酸累積水平的區(qū)別。
[0022] 圖7展示了存在鋒鹽的情況下Vs對照的乳酸累積水平的區(qū)別。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 本發(fā)明設(shè)及一種減少細(xì)胞培養(yǎng)物中的乳酸累積的方法，所述方法包括將二價(jià)過渡 金屬鹽加入細(xì)胞培養(yǎng)物的步驟。
[0024] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述二價(jià)過渡金屬鹽具有選自銅和鋒的金屬。
[00巧]在本發(fā)明的實(shí)施例中，銅鹽為硫酸銅，并且鋒鹽為硫酸鋒。
[00%] 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，所述細(xì)胞從哺乳動物細(xì)胞系獲得。
[0027] 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，所述哺乳動物細(xì)胞系選自中國倉鼠卵巢（CH0)細(xì)胞、 NS0 (非分泌型0)和BHK(幼侖鼠腎)。
[0028] 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，添加約0. 2mM至約0. 4mM的濃度范圍的所述二價(jià)過渡 金屬離子。
[0029] 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，所述培養(yǎng)在選擇W下的系統(tǒng)中進(jìn)行，包括，但不限于： 分批補(bǔ)料培養(yǎng)、分批培養(yǎng)、搖瓶和生物反應(yīng)器。
[0030] 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，乳酸水平累積量減少約5%至約40% 本發(fā)明也設(shè)及生產(chǎn)多膚的方法，所述方法包括將二價(jià)過渡金屬鹽加入細(xì)胞培養(yǎng)物W減 少乳酸累積，W及使多膚發(fā)酵并且回收多膚的步驟。
[0031] 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，所述細(xì)胞從哺乳動物細(xì)胞系獲得。
[0032] 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，所述哺乳動物細(xì)胞系選擇W下細(xì)胞系，包括，但不限 于：中國倉鼠卵巢（C冊）細(xì)胞、NS0和BHK。
[0033] 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，所述二價(jià)過渡金屬鹽具有選自銅和鋒的金屬。
[0034] 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，銅鹽為硫酸銅，并且鋒鹽為硫酸鋒。
[0035] 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，添加約0. 2mM至約0. 4mM濃度范圍的所述鹽。
[0036] 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，所述多膚選自W下抗體，包括但不限于：抗VEGF-A抗 體、抗化r-2抗體、抗CD6抗體，和抗TNF抗體。
[0037] 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，所述培養(yǎng)過程在選擇W下任一系統(tǒng)中進(jìn)行，包括，但不 限于：分批補(bǔ)料培養(yǎng)、分批培養(yǎng)、搖瓶和生物反應(yīng)器。
[0038] 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，本發(fā)明設(shè)及利用改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)方法降低乳酸累積量 的方法，所述改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)方法包括細(xì)胞生長階段和多膚生產(chǎn)階段。
[0039] 因此，本發(fā)明提供一種借助例如單克隆抗體來生產(chǎn)多膚的方法，該方法可W減少 乳酸累積量。 W40] 進(jìn)一步地，本發(fā)明描述減少的乳酸累積量的范圍為從約5%至約40%。
[0041] 本發(fā)明設(shè)及通過減少乳酸累積的過程來生產(chǎn)單克隆抗體的方法。
[0042] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，其中乳酸累積量的下低通常與標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)程序相關(guān)。
[0043] 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，描述了在分批補(bǔ)料培養(yǎng)系統(tǒng)中添加二價(jià)過渡金屬鹽降 低乳酸累積的方法。
[0044] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述二價(jià)過渡金屬鹽包括銅鹽和鋒鹽。 W45] 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，培養(yǎng)基中所用的鋒鹽和銅鹽的濃度為約0. 4mM。
[0046] 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，銅的二價(jià)過渡金屬鹽為硫酸銅，而鋒的金屬鹽為硫酸 鋒。
[0047] 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，所述二價(jià)過渡金屬鹽的濃度是指該鹽在培養(yǎng)基中的濃 度。
[0048] 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，運(yùn)些鋒和銅金屬離子是參與糖酵解&TCA途徑的酶活 性所需的，因此，添加運(yùn)些離子可改進(jìn)使大部分葡萄糖完全氧化的細(xì)胞的總代謝效率，從而 減少乳酸累積。
[0049] 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基為限定化學(xué)成分培養(yǎng)基，所述限定化學(xué)成 分培養(yǎng)基包括，但不限于HyCloneCDM4NS0和HyCloneCDM4M油。
[0050] 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，所述哺乳動物細(xì)胞選自如下細(xì)胞，包括，但不限于：中 國倉鼠卵巢（CH0)細(xì)胞、非分泌型0 (NS0)和幼侖鼠腎（BHK)。
[0051] 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，所述多膚選自W下抗體，包括但不限于：抗VEGF-A抗 體、抗化r-2抗體、抗CD6抗體，和抗TNF抗體。 W52] 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，用設(shè)備YSI7100MBS分析儀（YSI7100MBS Analyzer)分析培養(yǎng)基中的乳酸水平。
[005引在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，乳酸累積的減少使培養(yǎng)性能，如總PH維持、細(xì)胞維持， 總體更好。所述二價(jià)過渡金屬鹽的添加，例如鋒鹽/銅鹽，使乳酸累積減少，并且還維持培 養(yǎng)基的PH。
[0054] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述二價(jià)過渡金屬鹽還可W限定為二價(jià)固定金屬離子。
[0055] 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，本發(fā)明還設(shè)及改進(jìn)生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，例如，蛋白質(zhì)的 大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)，例如，抗體生產(chǎn)。
[0056] 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，本發(fā)明還設(shè)及使細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中生長的方法， 所述細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)減少培養(yǎng)基中的乳酸累積。
[0057] 在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，添加二價(jià)過渡金屬鹽，即，鋒鹽/銅鹽進(jìn)一步使乳酸累 積量減少約5%至約40%。 陽0郎]術(shù)語定義 在本發(fā)明的描述中，可w使用下列術(shù)語，其定義在此描述。
[0059] 術(shù)語"抗體"包括抗體或抗體衍生物，或其片段，并且抗體的說明也適用于本發(fā)明 的抗體的制備。在抗體的片段中，功能相當(dāng)或同源