專利名稱：一種腐蝕性產(chǎn)酸菌的培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明屬于腐蝕與防護領域中的一種新型腐蝕性產(chǎn)酸菌中的生產(chǎn)培育工藝過程，特別是一種腐蝕性產(chǎn)酸菌的培養(yǎng)方法。
背景技術：
海洋微生物引起的腐蝕對海洋結構物造成了日益嚴重的危害，其特征是微生物附著于金屬表面并形成生物膜，微生物的活動改變了生物膜內的微觀環(huán)境條件(如溶解氧、pH值、各種離子含量等)。海洋中的腐蝕性微生物極易引起或加速破壞性極強的局部腐蝕(如縫隙腐蝕、孔蝕)，因而微生物腐蝕造成的危害是相當嚴重的。
好氧微生物在有氧的條件下，經(jīng)呼吸鏈產(chǎn)生的電子通常被氧分子接收。在發(fā)酵條件下，電子被細胞內其他的高氧化還原電勢的物質接收，從而產(chǎn)生有機酸(如乙酸、乳酸)或無機酸(硫酸)。能夠向胞外分泌無機酸或有機酸的微生物被統(tǒng)稱為產(chǎn)酸菌。產(chǎn)酸菌是一類重要的腐蝕性微生物。隨著各種實驗技術的發(fā)展，人們對微生物腐蝕的認識越來越深入。Mansfeld等人的研究表明，在生物膜內部，產(chǎn)酸菌可使周圍局部pH值降低，形成強酸性條件。J.A1hajji證明醋酸菌產(chǎn)生的醋酸和硫氧化菌產(chǎn)生的硫酸對腐蝕有明顯的促進作用。
目前對產(chǎn)酸菌引起的腐蝕研究多采用實驗室模擬生物腐蝕的實驗方法。即采用人造生物膜和特征性酸性代謝產(chǎn)物相結合的方法來模擬產(chǎn)酸微生物的腐蝕行為，研究其腐蝕機理，這種模擬方法的缺點是與實際腐蝕過程差距很大，也不能用來研制抗菌防腐材料。
因此，從實際環(huán)境中分離純化、篩選到產(chǎn)酸性能好、在實驗室內可以穩(wěn)定培養(yǎng)的產(chǎn)酸菌菌株，并建立培養(yǎng)方法，對于研究微生物腐蝕機理和防護方法具有重要意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術存在的缺點，尋求一種從自然環(huán)境中分離純化高性能產(chǎn)酸菌，并探索該菌株在實驗室內的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)工藝，使其在實驗室內能夠穩(wěn)定、高密度培養(yǎng)，為研究產(chǎn)酸菌的腐蝕機理、微生物腐蝕的控制技術以及抗菌材料的研制提供方便有利的研究手段。
為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明涉及產(chǎn)酸菌的分離純化及其保藏與鑒定等內容。
產(chǎn)酸菌的分離純化以無菌操作方式，先從在實海中浸泡180天的銅鎳合金表面上剝離下生物膜，再在室溫下用2216E培養(yǎng)基進行富集培養(yǎng)，富集液按10-1，10-2，10-3，10-4進行梯度稀釋后在產(chǎn)酸平板上劃線分離，然后挑取生成清晰透明水解圈的菌落進一步純化，重復此步驟直至得到產(chǎn)酸菌的純培養(yǎng)；最后對所得純培養(yǎng)進行斜面?zhèn)鞔?，選取經(jīng)50次傳代后，產(chǎn)酸性能穩(wěn)定的菌株，進行保藏。
產(chǎn)酸平板培養(yǎng)基配方包括蛋白胨5-10g；酵母膏1-5g；葡萄糖10-20g；碳酸鈣6-12g；磷酸高鐵0.01-0.03g；海水1000ml；瓊脂20g；pH7.6。
斜面培養(yǎng)基配方包括酵母膏1-3g；磷酸高鐵0.01-0.05g；蛋白胨5-10g；海水1000ml；瓊脂20g；pH7.6。
液體培養(yǎng)基配方包括酵母膏1-3g；磷酸高鐵0.01-0.05g；蛋白胨5-10g；海水1000ml；pH7.6。
產(chǎn)酸菌的保藏與鑒定本發(fā)明中培養(yǎng)和所用的浸麻類芽孢桿菌(Paenibacillus macerans)是一種具有強產(chǎn)酸能力的細菌，對銅合金有很強的選擇性腐蝕。該菌株已于2004年9月1日在中國微生物菌種保藏管理委員會典型培養(yǎng)物保藏中心登記，保藏號為CCTCC NO.M204064。
該菌株在斜面培養(yǎng)基上呈淡黃色，菌落表面光滑。在光學顯微鏡下觀察，細胞呈短桿狀。
對該菌株進行生理生化試驗，將所得產(chǎn)酸菌的生理生化特征列表如下表1產(chǎn)酸菌的生理生化特征


注表中+表示陽性，-表示陰性。
將新鮮的產(chǎn)酸菌斜面制成菌懸液后，按4％的接種比例接入液體培養(yǎng)基進行搖床震蕩培養(yǎng)，轉速260轉/分，培養(yǎng)溫度30℃。24小時后取菌液10ul滴在產(chǎn)酸平板表面，18小時后觀察產(chǎn)酸平板上形成直徑為1cm的清晰透明水解圈。產(chǎn)酸平板培養(yǎng)基中含有碳酸鈣鹽，因而整個培養(yǎng)基為白色混濁固體培養(yǎng)基，當培養(yǎng)基遇酸時，若酸性物質能與培養(yǎng)基中的碳酸鈣生成可溶性鈣鹽，則混濁的白色固體變成透明的固體物質。所分離菌株的菌液在產(chǎn)酸平板上能夠形成清晰的水解圈。這就表明，產(chǎn)酸菌在其新陳代謝過程中能夠生成并將酸性物排到細胞外。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有分離純化工藝方法簡便，原理性能穩(wěn)定，安全可靠，其培養(yǎng)的菌種純正，應用效果優(yōu)良等優(yōu)點。
具體實施例方式本發(fā)明培養(yǎng)成的腐蝕性產(chǎn)酸菌應用在加速銅合金腐蝕過程中能降低極化電阻，降低腐蝕電位，加速局部腐蝕。實例如下實施例1產(chǎn)酸菌對銅鎳合金B(yǎng)10腐蝕電位的影響將培養(yǎng)了24小時的新鮮菌液，按5％的比例接入新鮮的培養(yǎng)基中，監(jiān)測B10電位隨時間的變化，以空白培養(yǎng)基為對照，恒電位儀為美國M273A電化學工作站，B10合金在含有產(chǎn)酸菌的培養(yǎng)基中腐蝕電位負移很明顯，表明其腐蝕速率顯著增加，發(fā)生局部腐蝕的可能性大大增加。
實施例2產(chǎn)酸菌對B10合金極化電阻的影響利用線性極化法監(jiān)測了B10合金在有、無產(chǎn)酸菌的培養(yǎng)基中的線性極化曲線。線性極化測試采用經(jīng)典三電極體系，輔助電極為鉑電極，以飽和甘汞電極為參比電極，工作電極為銅鎳合金B(yǎng)10。恒電位儀為美國M273電化學工作站。掃描速度為0.4mv/s。將培養(yǎng)了24小時的新鮮菌液，按5％的比例接入新鮮的培養(yǎng)基中，監(jiān)測極化電阻隨時間的變化。以空白培養(yǎng)基為對照，B10合金線性極化電阻隨時間的變化關系清晰。在含有產(chǎn)酸菌的培養(yǎng)基中，B10合金的極化電阻在初始階段越來越大，這是因為產(chǎn)酸菌在開始時產(chǎn)生的酸較少，而細菌附著在電極表面，造成了電阻增大。20天后，合金在有菌培養(yǎng)基中的極化電阻迅速下降，并呈不斷減小的趨勢，這說明隨著酸的不斷積累，合金的腐蝕速率開始增大。
實施例3產(chǎn)酸菌對B10合金的腐蝕將斜面培養(yǎng)基上的新鮮浸麻類芽孢桿菌(Paenibacillus macerans)用接種針取一環(huán)接種于液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后，按5％比例接入已滅菌的液體培養(yǎng)基中。將經(jīng)紫外滅菌的B10合金試樣浸入含菌溶液，24天后取出，清除試樣表面腐蝕產(chǎn)物，腐蝕形貌清晰。B10、B30在含有產(chǎn)酸菌的介質中的腐蝕要比在無菌介質中嚴重的多，腐蝕形貌為麻點狀的坑蝕。
權利要求
1.一種腐蝕性產(chǎn)酸菌的培養(yǎng)方法，其特征在于產(chǎn)酸菌的分離純化以無菌操作方式，先從在實海中浸泡180天的銅鎳合金表面上剝離下生物膜，再在室溫下用2216E培養(yǎng)基進行富集培養(yǎng)，富集液按10-1，10-2，10-3，10-4進行梯度稀釋后在產(chǎn)酸平板上劃線分離，然后挑取生成清晰透明水解圈的菌落進一步純化，重復此步驟直至得到產(chǎn)酸菌的純培養(yǎng)；最后對所得純培養(yǎng)進行斜面?zhèn)鞔?，選取經(jīng)50次傳代后，產(chǎn)酸性能穩(wěn)定的菌株，進行保藏。
2.根據(jù)權利要求1所述的腐蝕性產(chǎn)酸菌的培養(yǎng)方法，其特征在于產(chǎn)酸平板培養(yǎng)基配方包括蛋白胨5-10g；酵母膏1-5g；葡萄糖10-20g；碳酸鈣6-12g；磷酸高鐵0.01-0.03g；海水1000ml；瓊脂20g；pH7.6。
3.根據(jù)權利要求1所述的腐蝕性產(chǎn)酸菌的培養(yǎng)方法，其特征在于斜面培養(yǎng)基配方包括酵母膏1-3g；磷酸高鐵0.01-0.05g；蛋白胨5-10g；海水1000ml；瓊脂20g；pH7.6。
4.根據(jù)權利要求1所述的腐蝕性產(chǎn)酸菌的培養(yǎng)方法，其特征在于液體培養(yǎng)基配方包括酵母膏1-3g；磷酸高鐵0.01-0.05g；蛋白胨5-10g；海水1000ml；pH7.6。
5.根據(jù)權利要求1所述的腐蝕性產(chǎn)酸菌的培養(yǎng)方法，其特征在于所分離培養(yǎng)的腐蝕性產(chǎn)酸菌應用在加速銅合金腐蝕過程中能降低極化電阻，降低腐蝕電位，加速局部腐蝕。
全文摘要
本發(fā)明屬于腐蝕與防護領域中的一種新型腐蝕性產(chǎn)酸菌中的生產(chǎn)培育工藝過程，特別是一種腐蝕性產(chǎn)酸菌的培養(yǎng)方法。產(chǎn)酸菌的分離純化以無菌操作方式，先從在實海中浸泡180天的銅鎳合金表面上剝離下生物膜，再在室溫下用2216E培養(yǎng)基進行富集培養(yǎng)，富集液按10
文檔編號C12N1/20GK1912105SQ200610069888
公開日2007年2月14日 申請日期2006年8月15日 優(yōu)先權日2006年8月15日
發(fā)明者劉光洲, 段東霞, 王軍 申請人:中國船舶重工集團公司第七二五研究所