對hpv18 e7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種對HPV18E7具有結(jié)合親和力的多肽及其應(yīng)用，首次揭示了一種對HPV18的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽；本發(fā)明還提供了該多肽作為藥物或分子靶向試劑的診斷或治療用途。
【專利說明】
對HPV18 E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體是一種對HPV18E7(人乳頭瘤病毒18型的E7蛋 白）具有結(jié)合親和力的多肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 宮頸癌是威脅人類健康和生命的主要疾病，在女性的癌癥發(fā)病率居第二位，僅次 于乳腺癌，在發(fā)展中國家更為多見，近幾年甚至出現(xiàn)年輕化的趨勢。在我國，每年宮頸癌的 新病例大概是13.15萬，占全世界的1/7,宮頸癌的發(fā)病率和死亡率居全球第二位。雖然近60 年來，國內(nèi)外的學(xué)者們進(jìn)行了大量研究，并且宮頸癌的預(yù)防疫苗已經(jīng)上市，但由于多方面因 素的共同存在，目前臨床對于宮頸癌的治療，效果仍不理想。
[0003] 人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus, HPV)感染是宮頸癌的重要病因。流行病 學(xué)研究表明90%以上的宮頸癌與HPV感染相關(guān)，尤其是高危型HPV中的HPV16和18型，宮頸鱗 狀細(xì)胞癌中，HPV 16型感染陽性占51%以上，而宮頸腺癌中HPV 18型感染陽性占56% APV基 因組約有8 000 bp，結(jié)構(gòu)上由早期轉(zhuǎn)錄區(qū)（Early transcribed region，E區(qū)）、晚期轉(zhuǎn)錄區(qū) (Late transcribed region，L區(qū)）和非編碼區(qū)（Non-coding region，URR)組成。E區(qū)有E1、 E2、E4、E5、E6、E7等6個(gè)開放讀碼框(Open reading frame，0RF)，它們編碼的蛋白均參與病 毒復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的過程，其中E6和E7為腫瘤原性蛋白，E6與P53結(jié)合，E7和pRB蛋白結(jié)合，誘導(dǎo) 感染細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，細(xì)胞因復(fù)制失控而致永生化。
[0004]親和體分子，英文名affibody，是一類親新的親和性配體，其結(jié)構(gòu)由58個(gè)氨基酸 組成、相對分子量小，約為6.5 X 103，其功能類似于抗體，可與相應(yīng)的抗原、受體或配體結(jié) 合，但又有著一些抗體所沒有的性質(zhì)，如相對分子量小，僅為6.5 X 103、折疊速率快、選擇性 和親和力高，以及理化性質(zhì)穩(wěn)定，可耐受化學(xué)修飾等，因此人們稱其為"人工抗體"。 affibody分子所具備的這些獨(dú)特性質(zhì)，使其在各個(gè)免疫學(xué)領(lǐng)域和生物科學(xué)領(lǐng)域中迎來了 廣闊的應(yīng)用前景，從20世紀(jì)80年代首次報(bào)道以來，研究者們便對其產(chǎn)生了濃厚的興趣，因 此它的發(fā)展也極為迅速。
[0005] 基于上述說明，本領(lǐng)域仍然亟待研究靶向性治療HPV相關(guān)腫瘤疾病的新藥物或新 方法，以改善目前臨床現(xiàn)狀。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，而提供一種HPV18E7具有 結(jié)合親和力的多肽及其應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的第一個(gè)目的，其技術(shù)方案是一種對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白具有結(jié) 合親和力的多肽，其特征在于:該多肽是以葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列作為骨架，進(jìn) 行12-20個(gè)氨基酸變異后獲得的多肽。
[0008] 進(jìn)一步設(shè)置是相對于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列，該多肽在第9-11，13_ 14，17-18，24-25，27-28，32，35，43 位上發(fā)生氨基酸突變。
[0009] 進(jìn)一步設(shè)置是相對于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列，該多肽的： 第9位氨基酸突變?yōu)镻、F或A; 第10位氨基酸突變?yōu)镕、L或V; 第11位氨基酸突變?yōu)镃、L或R; 第13位氨基酸突變?yōu)镽、M或S; 第14位氨基酸突變?yōu)镼、V或G; 第17位氨基酸突變?yōu)镾、F或A; 第18位氨基酸突變?yōu)镻、W或V; 第24位氨基酸突變?yōu)镠、E或P; 第25位氨基酸突變?yōu)镠或E; 第27位氨基酸突變?yōu)镋、A或D; 第28位氨基酸突變?yōu)镻、E或L; 第32位氨基酸突變?yōu)镚、R或P; 第35位氨基酸突變?yōu)镻、H、Q或V; 第43位氨基酸突變?yōu)镋、D或K。
[0010] 進(jìn)一步設(shè)置是該多肽與人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白相互作用的KD值為IX 1(T6M 至3X10-7M〇
[0011] 本發(fā)明的第二個(gè)目的，提供一種靶向人乳頭瘤病毒18型的靶向性分子，所述的靶 向性分子包括前文所述的任一多肽，以及與該多肽相連接(或偶聯(lián)）的偶聯(lián)物，所述的偶聯(lián) 物包括:半胱氨酸殘基，多肽標(biāo)簽，抑制人乳頭瘤病毒18型的藥物，或可檢測標(biāo)記物(如熒 光標(biāo)記，酶，生物素或放射性同位素）。
[0012] 本設(shè)置中，所述的偶聯(lián)物與所述的對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白具有結(jié)合親和 力的多肽構(gòu)成融合多肽。本設(shè)置中，所述的多肽標(biāo)簽包括但不限于:His標(biāo)簽(如6XHis)， Myc標(biāo)簽，GST標(biāo)簽，F(xiàn)lag標(biāo)簽，所述酶包括但不限于:堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。
[0013] 進(jìn)一步設(shè)置是所述的抑制人乳頭瘤病毒18型的藥物包括:毒素;所述毒素是具 有抑制人乳頭瘤病毒18型病毒感染或抑制腫瘤作用的毒素，如白喉毒素、蓖麻毒素、綠膿 桿菌外毒素或所述毒素的功能性片段;且所述的腫瘤是人乳頭瘤病毒18型陽性的腫瘤。
[0014] 本設(shè)置中，所述的毒素是綠膿桿菌外毒素A，或所述毒素的功能性片段是綠膿桿菌 外毒素A的活性片段PE38KDEL。較佳地，該綠膿桿菌外毒素A或其功能性片段連接于所述 的對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽的羧基末端(C末端）。本設(shè)置中， 所述的偶聯(lián)物與所述的對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽以柔性肽 連接，所述柔性肽包括(但不限于）：（Gly4Se r)3。
[0015] 本發(fā)明的第三個(gè)目的，提供一種分離的多核苷酸，其編碼前文任一所述的對人乳 頭瘤病毒18型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽。
[0016] 本發(fā)明的第四個(gè)目的，提供一種多核苷酸，其編碼前文所述的靶向人乳頭瘤病毒 18型的靶向性分子，且其中所述的偶聯(lián)物是肽。
[0017] 本發(fā)明的第五個(gè)目的，提供一種重組載體，該載體包含前文所述的多核苷酸。
[0018] 本發(fā)明的第六個(gè)目的，提供一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含前文所述的重組載體， 或其包含有或基因組中整合有前文所述的多核苷酸。
[0019] 本發(fā)明的第七個(gè)目的，提供一種制備前文所述的任一對人乳頭瘤病毒18型的 E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 培養(yǎng)前文所述的細(xì)胞，從而表達(dá)前文所述任一的對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白 具有結(jié)合親和力的多肽； (2) 分離純化(1)獲得的多肽。
[0020] 本發(fā)明的第八個(gè)目的，提供一種前文所述的任一對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白 具有結(jié)合親和力的多肽或所述的靶向人乳頭瘤病毒18型的靶向性分子的用途，用于制備 治療人乳頭瘤病毒18型感染疾病或人乳頭瘤病毒18型表達(dá)陽性腫瘤的藥物;或用于制備 檢測人乳頭瘤病毒18型病毒感染的檢測試劑;或用于制備診斷人乳頭瘤病毒18型感染疾 病或人乳頭瘤病毒18型表達(dá)陽性腫瘤的診斷試劑。
[0021 ]本發(fā)明的第九個(gè)目的，提供一種藥物組合物，其包括前文所述的對人乳頭瘤病毒 18型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽或權(quán)利要求5或6所述的靶向人乳頭瘤病毒18型 的靶向性分子;和藥學(xué)上可接受的載體。
[0022]本發(fā)明的第十個(gè)目的，提供一種用于診斷或治療人乳頭瘤病毒18型感染疾病或 人乳頭瘤病毒18型表達(dá)陽性腫瘤的藥盒，所述的藥盒中包括:前文所述的任一對人乳頭瘤 病毒18型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽，或前文所述的靶向人乳頭瘤病毒18型的靶 向性分子，或前文所述的藥物組合物。
[0023 ]下面結(jié)合說明書附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明做進(jìn)一步介紹。
【附圖說明】
[0024] 圖1重組質(zhì)粒pET21a( + )/HPV16E7酶切鑒定圖； 圖1中：Ml:lkbDNAmarker; 1: pET21a( + )質(zhì)粒2: pET21a( + )/HPV18E7; 3: pET21a ( + )/HPV18E7//NdeI+XhoI;4: HPV18E7 DNA片段；M2: DL2000 DNA marker; 圖2 HPV18E7蛋白的SDS-PAGE電泳及 Western Blot分析； 圖2中，M: marker; 1-3?重組質(zhì)粒pET21a( + )/HPV18E7 分別經(jīng)IPTG誘導(dǎo)9h、6h、3h蛋 白表達(dá);4?重組質(zhì)粒pET21a( + )/HPV18E7未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá);5. E.coli. BL21 (DE3) 菌株。A:SDS_PAGE;B: Western Blotting分析（一抗為小鼠抗6 X His單克隆抗體（1: 5000))； 圖3 Elisa檢測三級庫單克隆的親和性的數(shù)據(jù)圖； 圖4選擇進(jìn)行研究的3個(gè)克隆氨基酸序列； 圖5A pET21a( + )/Z hpvi8 E7的重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖； 圖5B重組質(zhì)粒pET21a( + )/Z hpvi8E7酶切鑒定圖； 圖5B中，Ml: DL2000 DNA marker; 1: Z HPV18 E7 DNA片段2: pET21a( + )/Z hpvi8E7/ Ndel+EcoRI; 3: pET21a( + )/ZHpvi8E7重組質(zhì)粒；4: pET21a( + )質(zhì)粒；M2:. lkbDNA marker； 圖6A重組蛋白pET21a( + )/Z hpvi8E7的表達(dá)； 圖6A中，M: marker; 1. E.coli. BL21 (DE3)菌株；2?重組質(zhì)粒pET21a( + )/Z HPV18E7誘導(dǎo)前；3. pET21a( + )/Z HPV18E7:228重組蛋白；4. pET21a( + )/Z HPV18E7:242重組蛋白；5 .pET21a( + )/ZHPvi8E7:3i。重組蛋白；6. SPAZ蛋白； 圖6B重組蛋白pET21a( + )/Z hpvi8E7的純化圖； 圖6B中，M: marker;;l.純化后pET21a( + )/Z hpvi8E7:228蛋白；2.純化后pET21a( + )/Z HPV18E7:242蛋白；3.純化后pET21a( + )/Z HPV18E7:310蛋白；4.純化后Zwt蛋白； 圖7 Z Hm8E7與HPV18 E7親和力的表面等離子共振鑒定； 圖7A:不同濃度Z HPV18E7:228獲得的傳感；圖7B:不同濃度Z HPV18E7:242獲得的傳感；圖 7C:不同濃度 Z HPV18E7:31Q 獲得的傳感；圖 7D: Z HPV18E7:228、Z HPV18E7:242、Z HPV18E7:31Q 及其 SPA-Z對照蛋白與HPV18 E7結(jié)合的表面等離子共振比較； 圖8 Z HPV18E7與HPV18 E7天然蛋白親和力的細(xì)胞免疫熒光方法鑒定(共聚焦激光顯微 鏡 X400); 圖8A:Z HPV18E7:228蛋白的間接細(xì)胞免疫焚光檢測；圖8B:Z HPV18E7:242蛋白的間接細(xì)胞 免疫熒光檢測；圖8C: Z Hm8E7:31Q蛋白的間接細(xì)胞免疫熒光檢測； 圖9 HeLa細(xì)胞各數(shù)量組接種裸鼠移植瘤生長曲線； 圖10 HeLa細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤組織HE染色切片觀察（X 400); A:4xl07/ ml HeLa細(xì)胞組；B:lxl07/ ml HeLa細(xì)胞組；C:lxl06/ ml HeLa細(xì)胞組； 圖11正常裸鼠注射dy_ZHPV18 E7:228后生物近紅外信號分布圖 A:正常裸鼠注射dy-ZHPV18E7:228后各時(shí)間段的生物近紅外信號成像圖；B:正常裸鼠注 射dy-ZHPV18 E7:228后各時(shí)間段的腎臟與正常組織近紅外信號強(qiáng)度的比值圖。
[0025] 圖 12 HeLa荷瘤鼠注射dylight標(biāo)記的ZHPV18 E7:228，ZHPV18 E7:31Q，ZhPV18 E7:242，ZWT后生 物焚光分布圖； 圖13 HeLa荷瘤鼠注射dylight標(biāo)記的ZHPV18E7 affibody后腫瘤和腎臟的生物分布曲 線。A，B，C，D分別為HeLa荷瘤鼠注射Dy755-Z HPV18 E7： 228 ； Dy755~Z HPV18 E7： 310 ； Dy755~Z HPV18 E7:224;Dy755_Zwt后各時(shí)間段腫瘤、左腎和右腎與正常組織的焚光強(qiáng)度比值。E為各時(shí)間 段HeLa荷瘤鼠注射Dy755-z HPV18 E7：228 ；Dy755-Z HPV18 E7： 310 ； Dy755~Z HPV18 E7：224 ；Dy755-Zwt 后各時(shí)間段腫瘤與正常組織的熒光強(qiáng)度比值。
[0026] 圖 14 pET21a( + )/Z HPV18 E7/PE38KDEL的重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖； 圖15重組質(zhì)粒pET21a( + )/Z HPV18E7/PE38KDEL酶切鑒定圖； 圖 15中，Ml: DLlOOOOBp Marker; 1: pET21a( + ) / Z hpvi8E7:228/PE38KDEL質(zhì)粒2: pET21a( + )/228/PE38KDEL質(zhì)粒；3: pET21a( + )/ZHPvi8E7:228/PE38KDEL/NdeI+EcoRI;4: Z hpvi8E7:228 DNA片段；M2:DL2000 DNA marker; 圖 16 Zhpvis E7 affitoxin蛋白SDS-PAGE電泳和WB鑒定。
[0027] 圖 16A中，M: marker; 1. E.coli. BL21 (DE3)菌株；2?重組質(zhì)粒pET21a( + )/Z hpvi8E7:228/PE38KDEL誘導(dǎo)前；3?重組質(zhì)粒pET21a( + )/ Z hpvi8E7:228/PE38KDEL誘導(dǎo)后；4. pET21a( + )/Z hpvi8E7:3iq/PE38KDEL誘導(dǎo)后；圖 16B 重組蛋白ZHpvi8E7affitoxin的純化 M: marker; 1 ?純化后affitoxin 228蛋白；2.純化后affitoxin 310蛋白；圖 16C, -抗為his-tag鼠單克隆抗體：1?純化后affitoxin 228蛋白；2.純化后affitoxin 310蛋白； 圖 17 affitoxin 228, (A)和affitoxin 310 (B)對HeLa細(xì)胞的IC50分析； 圖18不同濃度affitoxin 228, (A)和affitoxin 310 (B)蛋白對HeLa細(xì)胞的生長抑 制作用； 圖19 Zhpvi8E7 affitoxin對HeLa細(xì)胞荷瘤裸鼠的抑瘤作用效應(yīng)； 圖19中，三組裸鼠在接種HeLa細(xì)胞后，待腫瘤長至100~200 mm3大小時(shí)，尾靜脈注射 5mg/kg affitoxin228蛋白或affitoxin 310蛋白及0.2 ml PBS，每隔3天注射一次，共6次， 圖中箭頭所示； 圖20 ZHPV18 E7 affitoxin對HeLa細(xì)胞荷瘤裸鼠的抑瘤作用； 圖20中，A為45天后處死各組裸鼠所剝離的腫瘤組織;B為各組所剝離腫瘤組織的平均 重量。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，只用于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不 能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定，該領(lǐng)域的技術(shù)工程師可根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容對本發(fā)明 作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。
[0029]如本文所用，所述的"對HPV18 E7具有結(jié)合親和力的多肽"是指以葡萄球菌A蛋白 Z段的氨基酸序列作為骨架，進(jìn)行12-20個(gè)氨基酸變異后獲得的多肽，且該多肽能夠特異 性結(jié)合HPV18 E7、具有極少或沒有非特異性結(jié)合。
[0030]如本文所用，所述的"本發(fā)明的多肽"、"對HPV18 E7具有結(jié)合親和力的多肽"、 "HPV18E7 結(jié)合多肽"、"Zhpvi8E7 affibody 多肽"、"Zhpvi8E7 afTibody"、"ZHPVi8E7''、"afTibody 蛋白"、"affibody重組蛋白"、"Zhpvis E7重組蛋白"可以互換使用；SPAZ與Zwt可以互換使 用。
[0031]如本文所用，所述的"靶向性分子"是指將本發(fā)明的對HPV18 E7具有結(jié)合親和力 的多肽與其它功能性偶聯(lián)物連接后獲得的、可以靶向HPV18E7的分子。所述的偶聯(lián)物可以 是半胱氨酸殘基，多肽標(biāo)簽，抑制人乳頭瘤病毒18型的藥物，酶或可檢測標(biāo)記物等。
[0032]如本文所用，所述的"融合多肽"是所述的"靶向性分子"的下位概念，是指本發(fā)明 的對HPV18 E7具有結(jié)合親和力的多肽與其它功能性肽(例如毒素蛋白或功能性蛋白片段） 連接后獲得的、可以靶向HPV18 E7的分子。
[0033]本發(fā)明人選擇HPV18 E7作為靶抗原。本發(fā)明人以葡萄球菌A蛋白的Z結(jié)構(gòu)域 (Zwt，SEQ ID NO: 1)作為支架，將其表面氨基酸殘基模擬抗體結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行隨機(jī)突變，通 過噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建突變文庫，以HPV18 E7作為靶抗原對該文庫進(jìn)行親和篩選，經(jīng)過大 量的篩選工作，最終獲得了對于HPV18 E7具有高度親和力的多肽。
[0034]本發(fā)明的多肽是以葡萄球菌A蛋白Z結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列作為骨架，進(jìn)行14-20個(gè) (較佳地為14個(gè))氨基酸變異后獲得的多肽。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，本發(fā)明的多肽相對于 葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列（SEQ ID N0: 1)，在第9-11，13-14，17-18,24-25,27_ 28,32,35,43位上發(fā)生氨基酸突變。更優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽具有SEQ ID NO: 1-4任一所 示的氨基酸序列，如表1所示。
[0035]本發(fā)明還涵蓋了在所述HPV18 E7結(jié)合多肽的氨基酸序列任一末端或兩端加入額 外的氨基酸殘基而形成的多肽。這些額外的氨基酸殘基可以在多肽結(jié)合HPV18 E7時(shí)起作 用，但是也可同樣用于其它目的，如涉及該多肽的生產(chǎn)、純化、穩(wěn)定、偶聯(lián)或檢測的一種或幾 種。這些額外的氨基酸殘基可以包括一或多種為了化學(xué)偶聯(lián)目的而添加的氨基酸殘基。如 在多肽鏈的第一位或最后一位添加，即在N或C末端添加一個(gè)半胱氨酸殘基等。這種額外 的氨基酸殘基也可以包括用于多肽純化或檢測的一個(gè)"標(biāo)記"，如與標(biāo)記抗體相互作用的六 組氨酸肽(His6)標(biāo)記，或"myc"標(biāo)記或"flag"標(biāo)記。此外，其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的替代 方式也包含在本發(fā)明中。
[0036]所述"額外的氨基酸殘基"也可構(gòu)成具有預(yù)期功能的一個(gè)或多個(gè)多肽結(jié)構(gòu)域，如與 第一個(gè)、HPV18E7結(jié)合結(jié)構(gòu)域相同的結(jié)合功能，或者其它結(jié)合功能，或是一種酶促功能，或 是一種熒光功能，或是其組合。
[0037]本發(fā)明也包含在所述的HPV18 E7結(jié)合多肽基礎(chǔ)上，經(jīng)修飾進(jìn)而增加其在堿性條 件下的穩(wěn)定性的多肽。這種穩(wěn)定性包括用對于堿性條件較不敏感的氨基酸殘基定點(diǎn)取代在 沒有修飾的序列中出現(xiàn)的任何天冬酞胺殘基。由于在不同的反應(yīng)之間親和層析柱要經(jīng)受頻 繁的強(qiáng)堿處理以進(jìn)行洗脫，這種對堿降低敏感性的特性，有利于使用本發(fā)明的多肽作為親 和層析中的親和配體，能夠延長親和層析基質(zhì)的使用壽命。
[0038]本發(fā)明也包含在本發(fā)明的HPV18 E7結(jié)合多肽基礎(chǔ)上，進(jìn)行其它修飾后獲得的多 肽。這些修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu)）形式包括:體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰 化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行 糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物 的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基（如磷酸酪氨 酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸）的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化 了溶解性能的多肽。
[0039]本發(fā)明的HPV18 E7結(jié)合多肽可以與偶聯(lián)物連接，從而構(gòu)成功能性的靶向性分子， 這種連接可通過化學(xué)鍵(包括肽鍵)相連或吸附;所述的化學(xué)鍵是共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵。作為 一種優(yōu)選方式，通過肽鍵連接，從而形成融合多肽。所述的HPV18 E7結(jié)合多肽與偶聯(lián)物之 間可以直接相連接，或者通過多肽連接子(連接肽)連接。所述的連接子例如包括1-30個(gè)氨 基酸;較佳地為1-20個(gè)氨基酸。連接肽的設(shè)置基本上不影響融合蛋白中各多肽的活性。較 佳地，可以利用柔性肽(Gly4Ser)3進(jìn)行連接。其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的連接肽也可應(yīng)用 于本發(fā)明。
[0040] 在"異源"融合多肽中，所述HPV18 E7結(jié)合多肽構(gòu)成了第一個(gè)結(jié)構(gòu)域或第一個(gè)部 分，第二和其它部分具有除了結(jié)合HPV18 E7外的其它功能，這些可預(yù)期的結(jié)果也在本發(fā)明 的范圍內(nèi)。該融合多肽的第二和其它部分可能包含對除了HPV18 E7外的其它靶分子具有 親和力的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這種結(jié)合結(jié)構(gòu)域也可能與SPA結(jié)構(gòu)域相關(guān)，但在1到大約20個(gè)位置 具有取代突變。結(jié)果是融合多肽有至少一個(gè)HPV18 E7結(jié)合結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)與所述其它 靶分子具有親和力的結(jié)構(gòu)域。這擴(kuò)展了本發(fā)明的多肽的應(yīng)用，如作為治療制劑或作為捕獲、 檢測或分離試劑。
[0041] 本發(fā)明融合多肽第二和其它部分的其它選擇包括用于治療性應(yīng)用的一或多種部 分。在治療性應(yīng)用中，其它分子也可以通過其它方法共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)到本發(fā)明的多肽上。 作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，將改造的銅綠假單胞菌外毒素PE38KDEL通過柔性肽連接于 HPV18 E7結(jié)合多肽的C-末端，構(gòu)成融合蛋白。非限制性例子包括用本發(fā)明多肽引導(dǎo)效應(yīng)酶 (例如羧肽酶）而進(jìn)行"ADEPT〃（抗體介導(dǎo)的酶前藥治療，anti body-directed enzyme prodrug therapy)的酶;包括用以募集免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞和其它組分的蛋白質(zhì)；包括細(xì) 胞因子，如11^-2、1?1^、11-12、了陬€[、1?10 ;包括促凝血因子，如組織因子、￥011啊11613抑11(1 因子；包括毒素，如蓖麻毒蛋白A、calcheamicin、美登木素生物堿；包括毒性小分子，如 auristatin類似物、阿霉素等。同時(shí)，為了更方便摻入放射性核素(如68Ga、76Br、 mIn、99Tc 、124I、125I)用于診斷或放射性核素(如9()Y、131I、 211At)用于治療，可以考慮上述列舉的額外的 氨基酸(特別是六組胺酸標(biāo)記和半胱氨酸），其目的是將放射性同位素的鰲合劑偶聯(lián)到多肽 序列。
[0042]本發(fā)明還涵蓋了在所述的HPV18 E7結(jié)合多肽上連接一個(gè)可檢測標(biāo)記物（如熒光 標(biāo)記，生物素或放射性同位素），從而可基于本發(fā)明的多肽的特異性，實(shí)現(xiàn)檢測HPV18感染或 HPV18感染相關(guān)疾病的目的。
[0043] "HPV18 E7結(jié)合親和力"是指可以例如通過利用表面等離子共振 (surfaceplasmon resonance)技術(shù)如Biocore?裝置進(jìn)行檢測的一種多肽特性。HPV18 E7 結(jié)合親和力可以通過一個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測，其中將HPV18 E7固定在該裝置的感應(yīng)芯片上，然 后將含有待測多肽的樣品通過該芯片?；蛘?，也可以將待檢測的多肽固定在該裝置的感應(yīng) 芯片上，然后將含有HPV18 E7的樣品通過該芯片。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用所獲得的感應(yīng) 圖像建立多肽的HPV18 E7結(jié)合親和力的至少一種定性測量方法。如果需要定量測量方法， 例如為了建立相互作用間的某個(gè)KD值，也可以使用表面等離子共振方法。例如，結(jié)合值可 以利用Biocore?2000裝置(Biocore AB)進(jìn)行測定。HPV18 E7固定于該裝置的感應(yīng)芯片 上，而親和力待檢測的多肽樣品通過連續(xù)稀釋制備并以隨機(jī)順序進(jìn)行注射。然后可從結(jié)果 中計(jì)算KD值。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述的多肽的KD值達(dá)到1X1(T 6M至3X1(T7M。
[0044] 本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的HPV18 E7結(jié)合多肽或靶向性分子或融合多肽的分 離的核酸，也可以是其互補(bǔ)鏈。所述核酸可以全序列人工合成，也可用PCR擴(kuò)增的方法分別 獲得。
[0045] 本發(fā)明還提供了包含編碼所述核酸分子的載體。所述的載體還可包含與所述核酸 分子的序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列，以便于所述融合蛋白的表達(dá)。如本文所用，"操作 性相連"或"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線 性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動(dòng)子控制以編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作 地連于編碼序列。
[0046] 在本發(fā)明中，任何合適的載體都可以使用，比如一些用于細(xì)菌、真菌、酵母和哺乳 動(dòng)物細(xì)胞的克隆和表達(dá)的載體，如Pouwels等，克隆載體:實(shí)驗(yàn)室手冊中所描述的。
[0047] 此外，含有所述核酸序列的重組細(xì)胞也包括在本發(fā)明中。術(shù)語"宿主細(xì)胞"包括原 核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞包括大腸桿菌、枯草桿菌等;例如可為大腸桿菌細(xì) 胞(E. co 1 i)，如大腸桿菌HMS174 (DE3)、或BL21 (DE3)。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、 昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0048]生產(chǎn)本發(fā)明的HPV18 E7結(jié)合多肽或靶向性分子或融合多肽的方法也已包括在本 發(fā)明中。所述方法包括培養(yǎng)含有相應(yīng)多肽的編碼核酸的重組細(xì)胞，獲得產(chǎn)物多肽?？蓪⑸鲜?制備獲得的多肽純化為基本均一的性質(zhì)，例如在SDS-PAGE電泳上呈單一條帶。
[0049] 基于要表達(dá)多肽的信息和目前重組表達(dá)蛋白質(zhì)的技術(shù)水平，結(jié)合本發(fā)明揭示的內(nèi) 容，本領(lǐng)域技術(shù)人員易于制備本發(fā)明的多肽。例如，表達(dá)未被修飾的Z結(jié)構(gòu)域的質(zhì)?？梢杂?作起始材料。使用已知技術(shù)，所需的取代突變可以被引入這個(gè)質(zhì)粒中以獲得本發(fā)明的表達(dá) 載體。
[0050] 當(dāng)使用化學(xué)多肽合成方法制備本發(fā)明的多肽或靶向性分子或融合蛋白時(shí)，上述多 肽中的任何天然產(chǎn)生的氨基酸殘基都可以被任何相應(yīng)的、非天然產(chǎn)生的氨基酸殘基或其衍 生物所取代，只要產(chǎn)物多肽的功能基本不被損害。
[0051]本發(fā)明還涉及所述的HPV18 E7結(jié)合多肽或靶向性分子或融合多肽在不同方面的 應(yīng)用，包括應(yīng)用于治療、診斷和/或檢測。
[0052]本發(fā)明的HPV18 E7結(jié)合多肽可作為HPV18 E7抗體在不同應(yīng)用中的一種替代物。 [0053]作為非限制性的實(shí)例，其可用于治療特征以HPV18 E7表達(dá)或HPV18感染為特征 的疾病，例如腫瘤(如宮頸癌，頭頸部腫瘤)等。通過結(jié)合胞內(nèi)HPV18 E7以抑制細(xì)胞信號傳 導(dǎo)，用于相關(guān)疾病的體內(nèi)和體外診斷。本發(fā)明的多肽可作為一種檢測試劑、一種捕獲試劑或 者分離試劑，而且還可直接用作為一種治療制劑或者將其它治療制劑靶向HPV18 E7蛋白 的手段。體外使用本發(fā)明的多肽的方法可以不同方式進(jìn)行，如微量滴定板、蛋白陣列、生物 傳感器表面和組織切片等等。為了使本發(fā)明多肽適用于特異的用途，在不偏離本發(fā)明的范 圍的情況下，可以對本發(fā)明的多肽進(jìn)行修飾和/或添加。
[0054]在下面詳細(xì)描述了這些修飾和添加，其可能包括在同一多肽鏈中包含的額外的氨 基酸，或者標(biāo)記和/或治療制劑，其化學(xué)修飾或以其它方式結(jié)合本發(fā)明的多肽。另外，本發(fā)明 還涵蓋了保留了結(jié)合HPV18 E7能力的該多肽的片段。
[0055]本發(fā)明的HPV18 E7結(jié)合多肽可以作為治療制劑，其治療作用基于至少一種以下 機(jī)制：（i)加強(qiáng)化療作用，施用本發(fā)明的多肽與目前和將來的化療治療協(xié)同作用。阻斷胞內(nèi) 的HPV18 E7蛋白對抑癌基因pRb的破壞作用；（ii)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖?？赡茉诩?xì)胞內(nèi) 存在以下機(jī)制：當(dāng)結(jié)合多肽進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部與HPV18 E7蛋白結(jié)合時(shí)，阻斷了HPV18 E7與pRb 的結(jié)合，從而阻斷了細(xì)胞生長增殖信號。
[0056]本發(fā)明多肽的HPV18 E7結(jié)合特性以及用該多肽生產(chǎn)靶向性分子(包括融合蛋白） 和/或標(biāo)記的結(jié)合分子的穩(wěn)定性意味著該多肽也可以用于將其它活性物質(zhì)靶向腫瘤部位， 這些腫瘤包括表達(dá)HPV18 E7的細(xì)胞。因此，本發(fā)明的另一方面是提供了本文所述的HPV18 E7結(jié)合多肽與一種具有抗癌活性的物質(zhì)偶聯(lián)的應(yīng)用，以將所述物質(zhì)運(yùn)送到表達(dá)HPV18 E7 的細(xì)胞，產(chǎn)生靶細(xì)胞的損傷或凋亡。
[0057]這種抗癌活性的物質(zhì)可能是通過融合或通過化學(xué)鍵偶聯(lián)到HPV18 E7結(jié)合多肽上 的蛋白質(zhì)，如選自用于"ADEPT"（antibody_directed enzyme prodrug therapy)應(yīng)用的效 應(yīng)酶；用于募集免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞和其它組分的蛋白；細(xì)胞因子，如IL_2、IFNy、IL-12、 TNFaa、IP 10等;促凝血因子，如組織因子、von Willebrand因子等;毒素，如蓖麻毒蛋白 A、假單胞菌外毒素、calcheamicin、美登木素生物堿等。或者，所述活性物質(zhì)也可能是細(xì)胞 毒性藥物，如auristatin類似物或阿霉素或放射性同位素(如 9()Y、131I、211At等），這種同位 素可與HPV18 E7結(jié)合多肽直接結(jié)合，或通過一種鰲合劑，如熟知的鰲合劑D0TA或DTPA而 與HPV18 E7結(jié)合多肽結(jié)合。
[0058]在相關(guān)方面，本發(fā)明還提供了一種在體內(nèi)將具有抗癌活性的物質(zhì)導(dǎo)向表達(dá) HPV18E7細(xì)胞的方法，包括施用給患者本文所述的所述活性物質(zhì)與與HPV18 E7結(jié)合多肽 的偶聯(lián)物。這種偶聯(lián)物在前文已被適當(dāng)描述。
[0059]本發(fā)明還包括使用所述的與HPV18 E7結(jié)合的多肽檢測樣品中的HPV18 E7蛋白。 [0060] 例如，這種檢測可以用來診斷特征為表達(dá)HPV18 E7的疾病情況。檢測HPV18 E7 的存在可以在體內(nèi)也可以在體外進(jìn)行。體內(nèi)診斷的優(yōu)選選擇是使用正電子放射X線斷層攝 影術(shù)，PET。被檢測的樣品可以例如是生物學(xué)液體樣品或組織樣品?，F(xiàn)在的普遍方法是用針 對與HPV18 E7的抗體，這種方法可以適用于本發(fā)明的與HPV18 E7結(jié)合多肽，這種方法是 組織化學(xué)方法檢測與HPV18 E7的存在，用來鑒定新鮮、冷凍或福爾馬林固定、石蠟包埋的 組織樣品中與HPV18 E7蛋白的表達(dá)。為了檢測HPV18 E7， 本發(fā)明的多肽也能用作融合蛋白的一部分，其中其它結(jié)構(gòu)域是報(bào)告酶或熒光酶?；蛘撸?其也可以是被一個(gè)或多個(gè)熒光制劑和/或放射性同位素標(biāo)記的，任選通過鰲合劑標(biāo)記。合適 的放射性同位素包括68Ga、 76 Br、mIn、99Tc、124I和1251等。
[0061]本發(fā)明還包括將所述的HPV18 E7結(jié)合多肽應(yīng)用于檢測生物學(xué)液體樣品中 HPV18E7。這個(gè)方法包括以下步驟：（1)提供被檢測患者的生物學(xué)液體樣品，（2)將本文所述 的HPV18 E7結(jié)合多肽在能使所述多肽與樣品中存在的任何HPV18 E7結(jié)合的條件下加入 樣品中，（3)除去非結(jié)合的多肽，及(4)檢測結(jié)合的多肽。被檢測到的結(jié)合的多肽的量與樣品 中存在的HPV18 E7量相關(guān)。在步驟(2)中，HPV18 E7結(jié)合多肽可以以任何適宜的形式加入 到樣品中，包括例如這樣的情況，當(dāng)HPV18 E7結(jié)合多肽被固定在一種固體支持物上，通過 其使樣品接觸，或HPV18 E7結(jié)合多肽存在于溶液中。
[0062]所述的HPV18 E7結(jié)合多肽的其它應(yīng)用還包括:檢測樣品中HPV18 E7的方法，包 括如下步驟：（1)提供一種懷疑含有HPV18 E7的組織樣品，例如冷凍切片或用福爾馬林包 埋的組織切片，（2)在適宜條件下加入本發(fā)明的HPV18 E7結(jié)合多肽到所述樣品中，所述條 件為益于所述多肽與樣品中存在的任何HPV18 E7結(jié)合，（3)除去未結(jié)合的多肽，及(4)檢測 結(jié)合的多肽。檢測到的結(jié)合的多肽的量與樣品中存在的HPV18 E7的量相關(guān)。
[0063]本發(fā)明還提供了一個(gè)診斷組織樣品中HPV18 E7表達(dá)的試劑盒，包括與報(bào)告酶(如 堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶)融合的、本發(fā)明的HPV18 E7結(jié)合多肽、檢測酶活性的試劑、 和陽性和陰性對照組織切片。
[0064]本發(fā)明還提供了一個(gè)診斷組織樣品中HPV18 E7表達(dá)的試劑盒，包括通過抗體檢 測的與標(biāo)記(如flag標(biāo)記或myc標(biāo)記)融合的本發(fā)明的HPV18 E7結(jié)合多肽、一個(gè)特異于標(biāo) 記的一抗、特異于一抗并與報(bào)告酶偶聯(lián)的二抗、檢測酶活性的試劑，和陽性和陰性對照組織 切片。
[0065]診斷應(yīng)用的一個(gè)領(lǐng)域就是在體內(nèi)檢測癌細(xì)胞或其聚集物。本發(fā)明提供了一個(gè)進(jìn)行 這種診斷的試劑盒，該試劑盒包括標(biāo)記有一個(gè)鰲合物的、本發(fā)明的HPV18 E7結(jié)合多肽、一 種診斷用放射性同位素(非限制性的例子是6心、7如、11111!、 991'(3、1241和1251等），以及用于 分析摻入效率的試劑。
[0066]如上所述，本發(fā)明涵蓋了本發(fā)明的HPV18 E7結(jié)合多肽將活性物質(zhì)靶向表達(dá)HPV18 E7的細(xì)胞如某些類型的癌癥細(xì)胞的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一個(gè)用于此目的的試劑盒，該試 劑盒包括用一個(gè)鰲合物標(biāo)記的本發(fā)明的HPV18 E7結(jié)合多肽、一個(gè)治療性放射性同位素(非 限制性的例子是，、1311、21^)，以及用于分析摻入效率的試劑。
[0067] 本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包含:有效量的本發(fā)明所述的對人乳頭瘤病毒 18型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽或靶向人乳頭瘤病毒18型的靶向性分子，和藥學(xué)上 可接受的載體。
[0068] 如本文所用，"藥學(xué)上可接受的"的成分是適用于人和/或哺乳動(dòng)物而無過度不良 副反應(yīng)(如毒性)的，即具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"指用于 治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體:它們本身并不 是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知 的。在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co.，N.J. 1991)中可找到關(guān)于 藥學(xué)上可接受的載體的充分說明。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽 水、甘油和山梨醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤滑劑、助流劑、潤濕劑 或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)和穩(wěn)定劑，如白蛋白等。
[0069] 可將所述的組合物制成各種適合于哺乳動(dòng)物給藥的劑型，所述劑型包括但不限 于:注射劑、膠囊劑、片劑、乳劑、栓劑。
[0070] 在使用時(shí)，是將安全有效量的本發(fā)明所述的對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白具有 結(jié)合親和力的多肽或靶向性分子施用于哺乳動(dòng)物(如人），其中該安全有效量通常至少約1 微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約1微 克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因 素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
[0071] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0072] (1) HPV18 E7蛋白的制備：以實(shí)驗(yàn)室保存的pET32a( + )/HPV18 E7重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 E. co 1 i BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE電泳，一明顯蛋白條帶出現(xiàn)在相對分子質(zhì) 量(Mr)約20kDa的位置，與預(yù)期蛋白Mr大小相符（圖5A)。經(jīng)用親和層析柱析純化后，經(jīng)SDS-PAGE分析在Mr20kDa的位置處出現(xiàn)1條較為單一的的蛋白條帶（圖2A)。以小鼠抗6XHis mAb為一抗進(jìn)行Western blot分析，可見在Mr 20kDa處出現(xiàn)信號反應(yīng)帶（圖2 B)，說明此條 帶為HPV18 E7蛋白，其純化后條帶較單一。
[0073] (2)利用制備的HPV18 E7蛋白對實(shí)驗(yàn)室保存的噬菌體隨機(jī)affibody文庫進(jìn)行淘 洗：以HPV18 E7蛋白為靶蛋白，用噬菌體隨機(jī)affibody文庫進(jìn)行四輪淘洗;將純化的HPV18 E7蛋白包被96孔酶標(biāo)板，經(jīng)封閉、加噬菌體文庫（初級庫）孵育、再加入E. coli TG1 37 °C，輕搖溫育；取100yl，用2*YT培養(yǎng)基做梯度倍比稀釋，取稀釋液100yl涂布S0B-AG平 板，30°C過夜，計(jì)數(shù)結(jié)合噬菌體感染菌落數(shù)，計(jì)算HPV18E7結(jié)合噬菌體滴度;結(jié)果平板可見 菌落，滴度是1X10 2;此時(shí)完成第一輪淘洗，另部分菌液加101()輔助噬菌體M13K07(購自北京 寶科維食安生物公司）和卡那霉素培養(yǎng)過夜，離心后取上清經(jīng)〇. 22mi濾膜過濾，獲得HPV18 E7分子親和篩選后的噬菌體文庫，為一級affibody庫。重復(fù)上述3輪富集篩選，分別獲得 HPV18 E7分子親和篩選后的噬菌體文庫，為二級，滴度為IX 106;在二級庫的基礎(chǔ)上再重復(fù) 上述2輪富集篩選，為三級文庫，滴度為1 X 108，同法獲得四級文庫，滴度為2 X 108。同時(shí)設(shè)置 不加噬菌體的空白對照作同步篩選。
[0074] (3)篩選與HPV18 E7蛋白特異性結(jié)合的高親和性的親和體affibody，標(biāo)為ZHm8E7: 隨機(jī)挑取四輪淘洗后的affibody單克隆，用ELISA、測序等方法選取affibody分子，即 ZHPV18E7;挑取第四輪淘洗后的HPV18E7親和體四級庫的235株單克隆進(jìn)一步進(jìn)行Elisa驗(yàn)證， 根據(jù)0D450值讀數(shù)，選取0D450值讀數(shù)較高的80株克隆，即讀數(shù)高于0.6(0D450>0.6)，送往 測序(如圖3)。經(jīng)過測序鑒定，10個(gè)克隆序列完全正確，且翻譯后沒有終止子。從中選取3個(gè) 親和力較高的單克隆，它們是228、242、310克隆，進(jìn)行后續(xù)的研究，這三個(gè)單克隆分別標(biāo)記 為Z HPV18 E7:228、Z HPV18 E7:242、Z HPV18 E7:31Q(氨基酸序列如表1，亦可參見附圖4,核苷酸序列參 見附圖4)。
(4)制備ZHPV18E7蛋白，并鑒定其與HPV18 E7蛋白的親和性： 將篩選得到的affibody陽性克隆ZHPV18E7克隆入載體pET21a( + )，構(gòu)建成重組質(zhì)粒 pET2 la ( + )/ZHPV18E7，表達(dá)、純化ZHPV18E7蛋白；培養(yǎng)宮頸癌HeLa細(xì)胞株，利用細(xì)胞免疫熒光和表 面等離子體諧振(SPR)技術(shù)鑒定Z HPV18E7蛋白與HPV18 E7蛋白的親和性和特異性;具體為： ①pET21a( + )/Z HPV18 E7的重組質(zhì)粒構(gòu)建 以篩選得到的Z HPV18E7:228、Z HPV18E7:242、Z HPV18E7:31Q克隆為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，利用Ndel 和EcoRI酶切位點(diǎn)作為插入載體位點(diǎn)，克隆入pET21a( + )載體構(gòu)建重組質(zhì)粒（圖5A);構(gòu)建的 pET21a( + )/Z HPV18 E7重組質(zhì)粒經(jīng)Ndel和EcoRI酶切后，酶切產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中約5400 bp和174 bp處各出現(xiàn)一條單一條帶（圖5B)，和pET21a( + )/Z HPV18 E7的理論大小相符。經(jīng)測 序，用NTI軟件匹配重組質(zhì)粒序列和理論序列，兩者吻合，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖6)。 [0076] ②pET21a( + )/Z HPV18 E7重組蛋白表達(dá)、鑒定及純化 pET21a( + )/Z HPV18 E7重組質(zhì)粒在E.coli BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE 電泳鑒定，在相對分子質(zhì)量(Mr)約7kDa的位置，Z HPV18 E7：228>Z HPV18 E7： 242 > Z HPV18 E7： 310§|5 lH 現(xiàn)明顯的蛋白條帶，與本實(shí)驗(yàn)室原先構(gòu)建的野生型affibody蛋白，SPAZ(Zwt)蛋白，相吻合 (圖7A)。由于重組質(zhì)粒pET21a( + )/Z HPV18 E7的C端含有pET21a( + )上的His標(biāo)簽，所以用親和 層析柱析純化后，經(jīng) SDS-PAGE 分析，Z HPV18E7:228、Z HPV18E7:242、Z HPV18E7:31Q 蛋白在約 7kDa 的 位置處出現(xiàn)1條較為單一的蛋白條帶，與對照蛋白SPAZ蛋白相一致（圖7B)，說明Z HPV18 E7：228>Z HPV18 E7：242>Z HPV18 E7: 310蛋白成功表達(dá)并制備了純化蛋白。
[0077] 本實(shí)施例中，本發(fā)明選擇pET21a( + )載體，在設(shè)計(jì)上利用其多克隆位點(diǎn)的起始酶位 點(diǎn)為Ndel ( CATATG)，其密碼子ATG即為目的蛋白翻譯的氨基酸(M)起始密碼子，這樣利用 原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白即為全長的目的蛋白Affibody而不帶載體蛋白片段，避免了載體 蛋白對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，為后續(xù)試驗(yàn)打下了良好的基礎(chǔ)。將篩選出的親和體分子Z HPV18E7構(gòu) 建在pET21a(+)載體上，在原核中表達(dá)相應(yīng)蛋白，利用載體自身的His標(biāo)簽可以將重組蛋白 通過N i親和層系柱純化方法純化得出較高純度的重組蛋白，經(jīng)S D S - P A G E電泳鑒定， ZhPV18E7:228、Z HPV18E7:242、Z HPV18E7:310表達(dá)蛋白大小在約7.8 kDa的位置。由于affibody分 子量小，可以穿透0.2WI1的PVDF膜，故無法對其進(jìn)行Western Blot進(jìn)一步分析。本實(shí)施例采 用下列表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR)和免疫焚光等方法對其在蛋 白水平和細(xì)胞水平與靶蛋白的親和特性進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。
[0078] ③表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR)技術(shù)分析和鑒定 將所用的革巴蛋白HPV 18E7和未和體Z HPV18E7:228、Z HPV18E7:242、Z HPV18E7:31Q蛋白以及用 作對照的野生型SPAZ(Zwt)蛋白表達(dá)、純化、濃縮和復(fù)性后備用，調(diào)節(jié)蛋白濃度至500ug/ml。 根據(jù)操作手冊，在不同的流動(dòng)池上通過偶聯(lián)于GLH芯片將HPV18E7重組蛋白固定，進(jìn)行與篩 選多肽之間的親和力測定。第6個(gè)流動(dòng)池表面被激活和失活以作為注射時(shí)的空白對照。將Z HPV18 E7：228>Z HPV18 E7：242>Z HPV18 E7：310> SPAZ蛋白稀釋成不同濃度，依次通過芯片表面。所有的 分析在25°C進(jìn)行，流速為30yl /min，注射標(biāo)本的容量為200yl，并以流速30yl /min隨機(jī)順 序注射，隨后用HC1(BI0-RAD 貨號:#176-2250 100 mM HC1)洗滌6min(解離），利用ProteOn Manager?軟件(BI0-RAD)的1: 1朗繆爾結(jié)合模型分析結(jié)合曲線(感應(yīng)圖）。
[0079] 從圖9可知，Z HPV18 E7:228濃度范圍從0到20nM，最低0.625nM，Z HPV18 E7: 242濃度范圍 從0到40nM，最低1.25nM，Z HPV18 E7:31Q濃度范圍從0到20nM，最低0.625nM。從這些結(jié)果可知， 這三個(gè)親和體分子均與靶蛋白有結(jié)合，然而，Z HPV18 E7：228>Z HPV18 E7： 310 的最低濃度更低，說 明它們和靶蛋白的結(jié)合更強(qiáng)。將不同親和體蛋白用解離平衡常數(shù)(KD)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，發(fā) 現(xiàn)在同一蛋白濃度水平時(shí)，Z HPV18 E7:228的解離平衡常數(shù)最高，Z HPV18 E7:31Q的解離平衡常數(shù) 次之，Z Hm8E7:242的解離平衡常數(shù)最低，而對照蛋白SPAZ的數(shù)值低于0,說明SPA Z與靶蛋白 HPV 18E7沒有結(jié)合。
[0080]由此可知，篩選出的Z HPV18 E7：228>Z HPV18 E7：242>Z HPV18 E7:31Q蛋白均能特異性識別 HPV 18E7蛋白，從蛋白水平驗(yàn)證了篩選出的三個(gè)重組Affibody蛋白與細(xì)胞表達(dá)的HPV 18E7 具有很強(qiáng)的親和力。
[0081 ]④細(xì)胞免疫熒光分析和鑒定 用純化的Z HPV18E7:228、Z HPV18E7:242、Z HPV18E7:31Q蛋白孵育HPV18E7蛋白表達(dá)陽性的宮頸 癌HeLa細(xì)胞，6小時(shí)后，分別用His單克隆抗體、SPA-Z兔血清以分析Z HPV18 E7蛋白與細(xì)胞株表 達(dá)的HPV 18E7蛋白的識別和結(jié)合能力，與此同時(shí)設(shè)置HPV 18E7蛋白表達(dá)陰性但HPV 16E7蛋白 表達(dá)陽性的Siha細(xì)胞株進(jìn)行對比。在共聚焦熒光顯微鏡下觀察到，HeLa細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)可 見多個(gè)綠色的點(diǎn)狀或團(tuán)塊狀焚光蛋白，而Siha細(xì)胞卻未見明顯的焚光，并且三個(gè)Z hpvi8 E7蛋 白在HeLa細(xì)胞的細(xì)胞核均可見綠色的點(diǎn)狀或團(tuán)塊狀熒光，如圖8所見。
[0082] 本實(shí)施例中HeLa細(xì)胞為HPV 18DNA陽性細(xì)胞，而Siha則為HPV 18DNA陰性但 HPV16DNA陽性的宮頸癌細(xì)胞，在本研究的細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，篩選出的三個(gè)ZHPV18 E7蛋白 在HeLa細(xì)胞中均能檢測出，而Siha細(xì)胞中均未檢測出，表明本研究篩選獲得的Z HPV18 E7:228、 Z HPV18 E7：242 >Z HPV18 E7： 31〇特異性識別能力強(qiáng)，均能與HPV18E7發(fā)生特異性結(jié)合，但不識別 HPV16E7蛋白。
[0083]由此可知，篩選出的Z HPV18 E7：228>Z HPV18 E7： 242 > Z HPV18 E7:31Q蛋白均能特異性識別細(xì) 胞中天然表達(dá)的HPV 18E7蛋白，從細(xì)胞水平驗(yàn)證了篩選出的三個(gè)重組Affibody蛋白與細(xì)胞 表達(dá)的HPV 18E7具有特異性結(jié)合的親和力。
[0084] [5]在宮頸癌細(xì)胞荷瘤裸鼠中的生物分布和腫瘤靶向特性 在本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)中，選擇篩選的Z HPV18 E7：228>Z HPV18 E7：242>Z HPV18 E7:31Q蛋白作為檢測 對象，用近紅外熒光染料DyLight755 NHS EsteKThermo Fisher公司，美國，貨號62278)標(biāo) 記上述蛋白，并將其注射到攜帶宮頸癌HeLa細(xì)胞移植腫瘤的小鼠體內(nèi)，進(jìn)行Z HPV18E7 af f ibody的生物分布研究，并對裸小鼠成像定位以研究標(biāo)記蛋白的祀向特性，同時(shí)用Zwt蛋 白作對照。
[0085] 具體為： ①宮頸癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立 分別將11106/1111，111〇71111，41107/1111三種不同濃度的宮頸癌拖1^細(xì)胞懸液和?83各 0.2ml皮下接種4-5周齡雌性裸鼠，接種后21天左右，實(shí)驗(yàn)組裸鼠接種部位開始出現(xiàn)粟粒大 小結(jié)節(jié)，瘤體增長速度與細(xì)胞量相關(guān)，4xl07/ ml組瘤體增長最快，lxl07/ml組瘤體增長次 之，兩組裸鼠均在接種后第30天結(jié)節(jié)直徑增至300mm 3以上，且隨時(shí)間推移瘤體逐漸增大，而 lxl06/ml組裸鼠在接種后第30天也出現(xiàn)300mm 3以上的瘤體，但隨著時(shí)間推移瘤體沒有顯著 增大，對照組PBS組全程沒有結(jié)節(jié)生長（見圖10)。全程觀察期間，裸鼠沒有死亡，精神狀態(tài) 可，反應(yīng)靈敏，飲食正常。接種HeLa細(xì)胞懸液60天后，處死荷瘤鼠，解剖觀察肝、脾、腎、大網(wǎng) 膜、子宮附件等臟器，未見明顯變化，無轉(zhuǎn)移。將腫瘤組織制成石蠟切片，進(jìn)行病理學(xué)觀察， 使用HE染色，結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組均見大小形狀不一的細(xì)胞、核仁肥大、深染細(xì)胞核、胞漿豐 富(見圖11)。
[0086] ② DyLight-755 NHS Ester標(biāo)記Z hpvi8 E7蛋白的鑒定 按DyLight-755試劑說明書進(jìn)行操作和鑒定。即將標(biāo)記后的重組蛋白Dy755- Z HPV18 E7:228用16%聚丙烯酰胺凝膠遮光電泳，切取合適大小的凝膠放于活體成像儀中，激發(fā)光 濾片為671-705nm，發(fā)射光濾片為7501ongpass，采用8bit和2X2模式，用730-950nm波長間 隔10nm每次曝光5000ms收集圖像信息，用Maesro自帶的軟件進(jìn)行圖像處理及分析。結(jié)果重 組蛋白Dy755- Z Hm8E7:228泳道有激發(fā)光，出現(xiàn)單一的熒光條帶，表明重組蛋白Dy755- Z HPV18 〇
[0087] ③Dy755_ Z hpvi8 E7在正常裸鼠體內(nèi)的生物分布 為分析Dy755- Z即^^在正常裸鼠體內(nèi)的代謝，用10%水合氯醛腹腔注射誘導(dǎo)麻醉， 待其進(jìn)入深度麻醉狀態(tài)后經(jīng)尾靜脈注射50yg Dy755- Z HPV18E7:228蛋白，置于小動(dòng)物活體成 像儀（CRi Maesro 2.10, in-vivo fluorescence imaging system)中成像，并用0.8-1 .On 1/g水合氯醛維持麻醉狀態(tài)，以保證小鼠在成像過程中處于深度麻醉，在5 min、30 min、lh、 2 h、4 h、6 h、8 h和24h連續(xù)成像觀察。結(jié)果可見雙側(cè)腎臟出現(xiàn)了最大的熒光信號，將其與 腿部肌肉處的熒光信號比值進(jìn)行分析，即腎臟/正常組織率(K/N ratio=[腎臟R0I的背景 信號/正常R0I的組織(肌肉）背景信號]X100%}。結(jié)果表明，Dy755- Z HPV18E7:228主要分 布于腎臟，在注射后腎臟的熒光信號逐漸增強(qiáng)，并于2-4小時(shí)達(dá)到高峰，此后逐漸減弱，并于 72小時(shí)焚光信號完全消失。表明，Dy755- Z hpvi8 E7的蛋白主要分布于正常裸鼠的腎臟，即經(jīng) 腎臟排泄，并于72小時(shí)內(nèi)完全排泄（圖13A，B)。
[0088] ④Dy755_ Z hpvi8 E7在HeLa細(xì)胞荷瘤裸鼠體內(nèi)的生物分布 待裸鼠的HeLa腫瘤長至300-500mm3時(shí)將裸鼠帶出SPF屏障系統(tǒng)，用10%水合氯醛腹腔注 射誘導(dǎo)麻醉，待其進(jìn)入深度麻醉狀態(tài)后經(jīng)尾靜脈注射50yg Dy755- ZHPV18E7:228、Dy755- Z HPV18E7:242、Dy755- Z HPV18E7:31Q及對照Dy755- Zwt蛋白，置于小動(dòng)物活體成像儀（CRi Maesro 2.10m)中成像，并用0.8-1.0iil/g水合氯醛維持麻醉狀態(tài)，以保證小鼠在成像過程 中處于深度麻醉，在5 min、30 min、lh、2 h、4 h、6 h、8 h和24h連續(xù)成像觀察。觀察發(fā)現(xiàn)， Dy755_ Z HPV18 E7:228、Dy755_ Z HPV18 E7:242、Dy755_ Z HPV18 E7:310蛋白尾靜脈注射5分鐘內(nèi)近 紅外信號分布全身，然后逐步向腫瘤和雙腎聚集，1小時(shí)左右，腫瘤部位和雙腎部位信號明 顯增強(qiáng)，腫瘤近紅外信號至4-6小時(shí)達(dá)到高峰，至24小時(shí)，雙腎和腫瘤部位信號明顯減弱；而 對照Dy755- Zwt，則腫瘤部位在觀察的各時(shí)間段均沒有顯著增強(qiáng)的信號出現(xiàn)。腫瘤與正常組 織的近紅外信號比值與上述觀察的結(jié)果相一致，也是以4-6小時(shí)比值達(dá)到高峰。荷瘤小鼠在 觀察期間狀態(tài)良好，未見明顯毒性反應(yīng)。
[0089] 本實(shí)施例結(jié)果表明，Dylight755標(biāo)記的Dy755_ Z HPV18 E7: 228、Dy 755- Z HPV18 E7:242、Dy755- Z HPV18 E7:31Q均具有靶向結(jié)合HPV18E7表達(dá)陽性腫瘤的特性，且沒有嚴(yán)重 的毒副作用。為HPV18陽性的宮頸癌靶向治療和分子顯像提供可能。
[0090]
[6]Z hpvi8E7 affitoxin體外對宮頸癌細(xì)胞生長抑制作用： 在本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)中，利用Z HPV18E7的靶向作用，攜帶經(jīng)改構(gòu)具有細(xì)胞毒作用的綠膿桿 菌外毒素A(pseudomonas exotoxinA，PEA)的活性片段PE38KDEL作為細(xì)胞毒分子。構(gòu)建 affibody/PE38KDEL原核表達(dá)載體，并利用原核表達(dá)系統(tǒng)制備并純化了 affibody/PE38KDEL 蛋白，即affitoxiruaffitoxin對宮頸癌細(xì)胞的體外生長的抑制作用進(jìn)行驗(yàn)證。
[0091 ] 1)選擇Z HPV18E7:228和Z HPV18E7:31Q作為研究對象，利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建分別構(gòu)建 pET21a( + )/ZHPvi8E7:228/PE38KDEL 和 pET21a( + )/ZHPvi8E7:3io/PE38KDEL 重組質(zhì)粒；并測序鑒定。 [0092] 2)制備原核表達(dá)重組免疫毒素 Zhpvi8E7: 22 8/PE38KDEL和 Zhpvi8E7: 3io/PE38KDEL， affitoxin 228和affitoxin 310蛋白，BPaffitoxin 228和affitoxin 310蛋白，分別經(jīng) SDS-PAGE及Western blot分析鑒定； 3)為研究Z Hm8E7affitoxin228,310多肽體外細(xì)胞生長是否具有抑制作用，選擇HeLa 腫瘤細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)對象。利用CCK-8試劑檢測affitoxin 228和affitoxin 310蛋白對細(xì) 胞生長過程中各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞生存率進(jìn)行檢測，并利用Grahpad primer5.0軟件計(jì)算Z HPV16E7affibody 多肽的 IC50。
[0093] 具體為： ① pET21a( + ) / Z hpvi8 E7/PE38KDEL重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以pET21a( + ) / Z hpvi8E7:228和Zhpvi8E7:31q質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，利用Ndel和EcoRI進(jìn) 行雙酶切，同時(shí)對實(shí)驗(yàn)室原先構(gòu)建保存的pET21a( + )/Z HPV18 e7:228/PE38KDEL質(zhì)粒雙酶切，進(jìn) 而酶連，構(gòu)建成pET21a( + )/Z hpvi8 e7:22s/PE38KDEL重組質(zhì)粒（圖14);構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)Ndel 和Ecrol酶切后，酶切產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中6100 bp和174 bp處均出現(xiàn)單一條帶，與 pET21a( + ) /PE38KDEL和Z hpvi8 E7:228的理論序列大小相吻合（圖15)，說明本重組質(zhì)粒構(gòu)建 成功。
[0094] ②pET21a( + ) / Z hpvi8 E7/PE38KDEL重組質(zhì)粒的原核表達(dá)、鑒定及純化 pET21a( + ) / Z hpvi8E7:228/PE38KDEL及pET21a( + ) / Z hpvi8E7:3iq/PE38KDEL重組質(zhì)粒 在E.coli BL21 (DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，在相對分子質(zhì)量(Mr)約 46kDa的位置出現(xiàn)一明顯條帶，與預(yù)期理論值大小相符，（圖16A)。由于重組Z hpvi8 E7:3io/ PE38KDEL蛋白（即Z HPV18 E? affitoxin)的C端含有His標(biāo)簽，所以用親和層析柱析純化后，經(jīng) SDS-PAGE分析affitoxin228和310蛋白在約46kDa的位置處出現(xiàn)1條較為單一的蛋白條帶 (圖16B)。進(jìn)一步通過Western Blot分析鑒定，結(jié)果（圖16C)顯示，His-tag鼠單抗作為一 抗，在分子質(zhì)量約為46kDa均處出現(xiàn)單一條帶，提示ZHPvi8E7affitoxin228、310重組蛋白能 特異性識別His-tag血清抗體。表明，2[^18￡73€打1：(?;[11228、310重組純化蛋白制備成功。
[0095] ③為研究Z hpvi8E7 affitoxin體外細(xì)胞生長抑制作用，選擇affitoxin228,310蛋白 作為研究對象，并選擇HeLa腫瘤細(xì)胞株作為靶細(xì)胞。制備細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)接種于96孔細(xì)胞 培養(yǎng)板，0.5X 104 /孔。培養(yǎng)24h后，加入lμg/ml放線菌酮及5%胎牛血清，然后加入 affitoxin228，310蛋白，設(shè)置200iig/ml、100 μg/ml、50 iig/ml、25iig/ml、10iig/ml、lμg/ml 六個(gè)濃度組，同時(shí)設(shè)培養(yǎng)基對照，采用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞的生存率，在加樣后72h，加入 CCK-8試劑10yl/孔，在C02培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育30min后置于酶標(biāo)儀A450處讀數(shù)。每組均設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，并進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞存活(Cell viability)計(jì)算方法為:Cell viability (% ) = (affitoxin組的0D值-培養(yǎng)基組0D值)/(培養(yǎng)基組對照組0D值-空白0D值）X 100% ; 同時(shí)用GraphPad primer 5.0軟件來計(jì)算細(xì)胞生長存活的IC50值。
[0096] 結(jié)果如圖17,經(jīng)GraphPad primer 5.0軟件來計(jì)算HeLa細(xì)胞生長存活的IC50值， affitoxin228, 310蛋白的 IC50分別為0? llMm (圖 17A)和0.05福（圖 17B)。圖 18 顯示， affitoxin 228和310蛋白對表達(dá)HPV18 E7陽性的宮頸癌細(xì)胞HeLa具有較強(qiáng)的殺傷作用， 作用72h后，其細(xì)胞生存率隨著劑量濃度的升高而下降，具有劑量依賴性。afTit 〇xin228， 310蛋白的六個(gè)劑量組之間（200iig/ml、100 μg/ml、50 μg/ml、25iig/ml、10iig/ml、lμg/ml)， 200μg/ml與100 μg/ml劑量組之間對HeLa細(xì)胞生長率均有顯著性差異無顯著性差異(p> 0.05)，但200μg/ml及100 μg/ml與其他劑量組對HeLa細(xì)胞生長率均有顯著性差異（p〈 0.05)〇
[0097] 以上結(jié)果表明，affitoxin 228，310具有體外HPV18E7靶向抑制細(xì)胞生長的特異 性。
[0098] [7]研究ZHPV18E7 affitoxin 228，310對宮頸癌細(xì)胞荷瘤裸鼠模型的抑瘤作用： 為研究Z HPV18E7 affitoxin228,310蛋白體內(nèi)對荷瘤裸鼠的抑瘤作用，將宮頸癌細(xì)胞株 HeLa細(xì)胞數(shù)調(diào)整至lX107/ml，接種于4-5周齡的裸鼠背側(cè)近右前肢處，每只0.2ml，待腫瘤生 長100~200 mm3大小時(shí)，分成3個(gè)組別，SPaffitoxin 228蛋白，affitoxin 310蛋白及PBS對 照組，蛋白按照5mg/kg的劑量，每只裸鼠經(jīng)尾靜脈注射0.2ml對應(yīng)樣品。每3天注射1次，共6 次。同時(shí)每3天觀察小鼠生活和精神狀態(tài)等，測量腫瘤大小并拍照記錄，觀察至45天。之后處 死小鼠剝離腫瘤組織，稱重腫瘤大小。從圖19可知，各組裸鼠在注射蛋白后，隨著時(shí)間的推 移，PBS組瘤體逐漸加大，且增幅明顯，在第33天瘤體即大于1000mm 3，而注射aff i toxin 228 蛋白和affitoxin 310蛋白6次后，affitoxin 228蛋白和affitoxin 310蛋白組的瘤體增長 緩慢，觀察期間瘤體一直小于300mm3直至45天。45天全程觀察期間，裸鼠反應(yīng)可，飲食正常， 體重變化不明顯。之后處死裸鼠，剝離的腫瘤組織拍照（圖20A)并稱量，affitoxin 228蛋白 和aff itoxin 310組瘤體最小，平均重量分別為0.16 ±0.05g和0.29±0.04g，而PBS組腫瘤 重量達(dá)到0.92±0.08g，經(jīng)t檢驗(yàn)，aff itoxin 228蛋白和aff itoxin 310組瘤體與PBS組比 較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈〇.5)(如圖20B)，而aff itoxin 228蛋白和aff itoxin 310組比較 差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>〇. 5)。
[0099] 上述結(jié)果表明，affitoxin228和affitoxin310蛋白均具有HPV18 E7靶向抑瘤作 用。且毒副作用不明顯。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽，其特征在于:該多肽 是以葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列作為骨架，進(jìn)行12-20個(gè)氨基酸變異后獲得的多肽。2. 如權(quán)利要求1所述的對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽，其特 征在于:相對于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列，該多肽在第9-11，13-14，17-18,24-25， 27-28,32,35,43位上發(fā)生氨基酸突變。3. 如權(quán)利要求2所述的對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽，其特 征在于，相對于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列，該多肽的： 第9位氨基酸突變?yōu)镻、F或A; 第10位氨基酸突變?yōu)镕、L或V; 第11位氨基酸突變?yōu)镃、L或R; 第13位氨基酸突變?yōu)镽、M或S; 第14位氨基酸突變?yōu)镼、V或G; 第17位氨基酸突變?yōu)镾、F或A; 第18位氨基酸突變?yōu)镻、W或V; 第24位氨基酸突變?yōu)镠、E或P; 第25位氨基酸突變?yōu)棣Щ駿; 第27位氨基酸突變?yōu)棣?、Α或D; 第28位氨基酸突變?yōu)镻、E或L; 第32位氨基酸突變?yōu)镚、R或P; 第35位氨基酸突變?yōu)镻、H、Q或V; 第43位氨基酸突變?yōu)镋、D或K。4. 如權(quán)利要求1所述的對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽，其特 征在于:該多肽與人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白相互作用的KD值為1X10_ 6M至3X10_7M。5. -種靶向人乳頭瘤病毒18型的靶向性分子，其特征在于，所述的靶向性分子包括權(quán) 利要求1-4任一所述的多肽，以及與該多肽相連接(或偶聯(lián))的偶聯(lián)物，所述的偶聯(lián)物包括： 半胱氨酸殘基，多肽標(biāo)簽，抑制人乳頭瘤病毒18型的藥物，或可檢測標(biāo)記物。6. 如權(quán)利要求5所述的靶向人乳頭瘤病毒18型的靶向性分子，其特征在于，所述的抑 制人乳頭瘤病毒18型的藥物包括:毒素;所述毒素是具有抑制人乳頭瘤病毒18型病毒感 染或抑制腫瘤作用的毒素，如白喉毒素、蓖麻毒素、綠膿桿菌外毒素或所述毒素的功能性片 段;且所述的腫瘤是人乳頭瘤病毒18型陽性的腫瘤。7. -種分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1-4任一所述的對人乳頭瘤病毒18型的E7 蛋白具有結(jié)合親和力的多肽。8. -種多核苷酸，其編碼權(quán)利要求5或6所述的靶向人乳頭瘤病毒18型的靶向性分 子，且其中所述的偶聯(lián)物是肽。9. 一種重組載體，其特征在于，該載體包含權(quán)利要求7或8所述的多核苷酸。10. -種宿主細(xì)胞，其特征在于，該宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求9所述的重組載體，或其包 含有或基因組中整合有權(quán)利要求7或8所述的多核苷酸。11. 一種制備權(quán)利要求1-4任一所述的對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白具有結(jié)合 親和力的多肽的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 培養(yǎng)權(quán)利要求10所述的細(xì)胞，從而表達(dá)權(quán)利要求1-4任一所述的對人乳頭瘤病 毒18型的E7蛋白具有結(jié)合未和力的多妝； (2) 分離純化(1)獲得的多肽。12. -種如權(quán)利要求1-4任一所述的對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白具有結(jié)合親和力 的多肽或如權(quán)利要求5或6所述的靶向人乳頭瘤病毒18型的靶向性分子的用途，用于制 備治療人乳頭瘤病毒18型感染疾病或人乳頭瘤病毒18型表達(dá)陽性腫瘤的藥物;或用于制 備檢測人乳頭瘤病毒18型病毒感染的檢測試劑;或用于制備診斷人乳頭瘤病毒18型感染 疾病或人乳頭瘤病毒18型表達(dá)陽性腫瘤的診斷試劑。13. -種藥物組合物，其特征在于，其包含： 權(quán)利要求1-4所述的對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽或權(quán)利 要求5或6所述的靶向人乳頭瘤病毒18型的靶向性分子;和藥學(xué)上可接受的載體。14. 一種用于診斷或治療人乳頭瘤病毒18型感染疾病或人乳頭瘤病毒18型表達(dá)陽性 腫瘤的藥盒，其特征在于，所述的藥盒中包括:權(quán)利要求1-4任一所述的對人乳頭瘤病毒 18型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽，或權(quán)利要求5或6所述的靶向人乳頭瘤病毒18 型的靶向性分子，或權(quán)利要求13所述的藥物組合物。
【文檔編號】G01N33/574GK105820219SQ201610056286
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年1月27日
【發(fā)明人】張麗芳, 王樂丹, 薛向陽, 朱珊麗, 蔣朋飛, 李文姝, 陳俊
【申請人】溫州醫(yī)科大學(xué)