一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的多肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于提供一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的多肽，即一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的，從法氏囊中分離的十一肽，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1。本發(fā)明從法氏囊提取物中，分離法氏囊十一肽結(jié)構(gòu)簡單，無毒副作用，免疫原性極弱。即可從法氏囊中分離提取，也可化學(xué)合成，成本低，可大量生產(chǎn)。對抗體產(chǎn)生具有誘導(dǎo)作用，同時可調(diào)節(jié)細胞因子的產(chǎn)生，淋巴細胞的增殖，促進細胞免疫反應(yīng)。此外，還以劑量依賴性方式調(diào)節(jié)B細胞的分化。具有廣泛的應(yīng)用前景，如在免疫調(diào)節(jié)和治療等方面等應(yīng)用。
【專利說明】一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的多肽

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于功能蛋白/多肽篩選【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的多 肽。

【背景技術(shù)】
[0002] 法氏囊（bursa of Fabricius，BF)是貼附于禽類泄殖腔背側(cè)肛道區(qū)的一個不 太明顯的囊狀結(jié)構(gòu)。法氏囊（Bursa of Fabricus, BF)最早于1621年由意大利解剖學(xué)家 Hieronymus Fabricius發(fā)現(xiàn)，由此而得名。最初，法布里修斯推測，空心結(jié)構(gòu)的法氏囊很有 可能是作為貯存精液的容器。然而事實并非如此，數(shù)百年里，法氏囊的功能一直困擾著眾多 科研人員。由于法氏囊隨著性成熟而退化，其大小與精巢和腎上腺之間呈負相關(guān)關(guān)系，因而 有研究人員推測，BF -定是與生長和性發(fā)育有關(guān)的某種內(nèi)分泌腺或淋巴腺。早在1956年， Glick等意外發(fā)現(xiàn)去除法氏囊能減少雛禽沙門氏菌0型抗原的抗體產(chǎn)生，卻一度沒有引起 眾人的注意。多年后這項工作的重要意義才被正確的對待，并且主流免疫學(xué)家也對雞的免 疫系統(tǒng)產(chǎn)生了極大的興趣。人們最終達成共識法氏囊是抗體（介導(dǎo)）免疫所必需的器官， 而同樣隨著性發(fā)育不斷退化的胸腺則是細胞（介導(dǎo)）免疫所必需的器官?，F(xiàn)在，法氏囊被 確認為體液中樞免疫器官，它由一根導(dǎo)管連接并貼附于禽類肛道，是B淋巴細胞發(fā)育分化 和成熟的場所，分化完全的B淋巴細胞由BF轉(zhuǎn)移至外周淋巴器官生活、繁衍，并主導(dǎo)著免疫 功能，因而是B淋巴細胞（囊來源淋巴細胞）和禽類抗體譜發(fā)生所必需的。
[0003] BF是B細胞誘導(dǎo)分化和成熟的場所。淋巴干細胞（B淋巴細胞前體）從骨髓到BF， 成熟的B細胞在此處誘導(dǎo)分化，參與免疫反應(yīng)通過血液循環(huán)和淋巴循環(huán)轉(zhuǎn)移到各個外周淋 巴器官。免疫球蛋白（Ig)基因重排是B細胞系發(fā)育過程中的早期事件，BF原基在胚胎期 第三天開始發(fā)育，胚胎發(fā)育到8-14日齡，由前囊干細胞形成BF原基。在進入BF濾泡前，干 細胞的免疫球蛋白L鏈和H鏈已發(fā)生重排。12日齡，BF中可以檢測到IgM +細胞，出雛后絕 大部分（90%以上）囊細胞是IgM+細胞。胚胎后期，B細胞開始進入外周免疫組織，出雛后 6月齡BF退化，此時B細胞已全部進入外周免疫組織。Moriya等用睪酮處理10日齡的雞 胚，檢測胚胎期和雛雞血清中J鏈和μ鏈水平，發(fā)現(xiàn)J鏈水平下降，而μ鏈在胚胎期和孵 出后水平無明顯變化。Mansikka等在雞胚發(fā)育60h手術(shù)切除BF，仍能產(chǎn)生免疫球蛋白形成 B細胞，然而卻無法產(chǎn)生特異抗體反應(yīng)，DNA序列分析表明只有少數(shù)B細胞前體分化為成熟 的免疫球蛋白形成B細胞。Jankovic等在胚胎發(fā)育52-64h切除BF原基后，不能消除體液 免疫，也不能阻止帶有特異來源于BF的Bu淋巴細胞的分化。童立騏等報道北京鴨胚胎外 科切除BF抑制了脾臟的發(fā)育，外周淋巴細胞、器官發(fā)生的影響差別不顯著當胚胎中晚期和 晚期的時候。剛孵出切除BF的不能為完全消除抗體的產(chǎn)生，能抑制特異性抗體的產(chǎn)生伴有 IgM和IgG的分泌。
[0004] 1976年Baba等發(fā)現(xiàn)BF粗提物物可以讓胚胎期去除BF的雛雞BF復(fù)生，也能恢 復(fù)誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫球蛋白特異性抗體。1977年Baba等又報道了法氏囊提取液可恢復(fù)丙酸睪 酮（TP)對法氏囊的發(fā)育抑制，促使雞的抗體水平提高并使抗體由IgM向IgG轉(zhuǎn)化。1976 年，Brand等發(fā)現(xiàn)雛雞骨髓細胞被BF提取液誘導(dǎo)表達抗原，促進早期細胞表達抗原的因子， 而且囊提取液濃度與誘導(dǎo)細胞分化的能力成負相關(guān)。1982年，Eerol等報道了體外培養(yǎng)的 BF上皮細胞和其不含血清培養(yǎng)上清具備增強淋巴細胞分化的能力。此外，繆德年等分析 BF提取物采用薄層層析法，發(fā)現(xiàn)BF提取物中有囊素和另外不少于8種不同肽類或著氨基酸 成分。近年來，隨著對法氏囊活性肽的不斷研究，一些結(jié)構(gòu)和功能明確的活性肽被不斷地發(fā) 現(xiàn)。
[0005] 法氏囊抗類固醇膚（Bursal anti-steroidogenic peptide，BASP)是另一個研究 眾多的法氏囊活性肽。體液免疫系統(tǒng)可能反饋調(diào)節(jié)新生兒的丘腦-垂體-性腺軸。Byrd等 研究了來源于青春期前的雞的法氏囊提取物的酸性溶液在體外對分離于最大的雞卵巢排 卵前卵泡的顆粒細胞basal和LH-刺激的孕激素生物合成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3?5kDa的 粗提物顯著抑制LH-刺激的孕激素分泌（P〈0. 05)。采用反向高效液相技術(shù)，部分純化得到 了一個法氏囊活性組分，在體外具有抑制類固醇肽的能力。該組分抑制LH-刺激的孕激素 的生物合成，最大程度可抑制約79%。去掉該肽后，顆粒細胞具有LH-刺激的孕激素生物合 成的能力與對照細胞類似；而且法氏囊提取物明顯抑制cAMP類似物刺激的孕激素的生物 合成。這些數(shù)據(jù)意味著來源于雞法氏囊的抗類固醇多肽是一種單一的熱不穩(wěn)定的、N端封 閉的肽，具有顆粒細胞的生物活性（顆粒細胞不依賴促性腺激素受體）。
[0006] 研究法氏囊活性肽已經(jīng)取得一定的進展，但目前而言對法氏囊活性肽的認知還是 較為膚淺，關(guān)于它們的生物學(xué)特性及功能等方面還有很多待解決的方面，尤其是對已知的 法氏囊活性肽的應(yīng)用幾乎是空白，還需深一步的研究。法氏囊是目前世界上唯一一個公認 的中樞體液免疫器官。由于法氏囊重要的免疫調(diào)節(jié)活性以及法氏囊提取物具有廣泛的生物 學(xué)活性。因此，研究法氏囊的活性物質(zhì)擁有相當寬闊的領(lǐng)域和廣泛的實際應(yīng)用意義。在疾 病診斷和治療中，胸腺活性物已經(jīng)起到舉足輕重的地位了，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于肝炎（乙肝、丙 肝等）、腫瘤（癌癥）的臨床治療和免疫缺陷等的研究中。不過，隨著對法氏囊活性肽的功 能及作用機理的深入研究和不斷的臨床和實際應(yīng)用方面的試驗，不久的將來，一些法氏囊 活性肽會同胸腺素一樣廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)和生產(chǎn)實踐。因此法氏囊活性肽具有廣泛的應(yīng) 用前景，如免疫調(diào)節(jié)、免疫治療等領(lǐng)域。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的多肽，即一種具有免疫調(diào)節(jié)作用 的，從法氏囊中分離的i^一肽，及其在提高動物的免疫能力，提高疫苗的免疫效果及調(diào)節(jié)B 細胞分化中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明首先提供一種多肽，包括有：
[0009] 1)氨基酸序列為 DVAGKLPDNRT(SEQ ID NO :1)的多肽；
[0010] 2)在1)中的氨基酸中取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸，由1)衍生的，且具有 1)中多肽功能的多肽。
[0011] 上述的多肽用于制備提高動物免疫力的疫苗或輔助劑；
[0012] 作為實施例的一種優(yōu)選，上述的多肽用于制備抗體；
[0013] 作為實施例的一種優(yōu)選，上述的多肽還用于制備促進B細胞增殖和/或分化的制 品。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點及意義如下：
[0015] 1、從法氏囊中發(fā)現(xiàn)一種新的十一肽，分子量為1185. 547(m/z)，氨基酸序列為 DVAGKLPDNRT，該i^一肽是第一次從禽類的中樞體液免疫器官法氏囊中分離出來，從而說明 法氏囊中存在多種活性分子，且可能發(fā)揮不同的免疫調(diào)節(jié)作用。
[0016] 2、在實驗動物體內(nèi)具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用。利用上述的法氏囊十一肽，可驗證 其對抗體的免疫調(diào)節(jié)作用。按照動物體重，每只使用4-100 μ g，與AIV疫苗混勻，注射免疫 動物。其特征在于：活性肽在4 μ g/只時，按疫苗推薦劑量用于動物，活性肽效果更好。法 氏囊十一肽不僅對體液免疫具有誘導(dǎo)效應(yīng)（如調(diào)節(jié)抗體的產(chǎn)生和淋巴細胞增殖），這與以 往報道的法氏囊提取物作用類似，而且對細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)具有強烈的調(diào)節(jié)作用，這在 以往的報道中很少提到，從而說明，法氏囊是一個有機組合器官，具有多種生物調(diào)節(jié)分子， 協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。本發(fā)明補充了這方面的缺陷，豐富了這方面的內(nèi)容。
[0017] 3、在體外，法氏囊十一肽能影響B(tài)細胞的生長分化情況。法氏囊十一肽具有調(diào)節(jié) B細胞分化的作用，從而為免疫缺陷疾病的治療和防控提供了新的藥劑和方法，有望在臨床 應(yīng)用中發(fā)揮重要作用。
[0018] 本發(fā)明從法氏囊提取物中，分離法氏囊十一肽結(jié)構(gòu)簡單，無毒副作用，免疫原性極 弱。即可從法氏囊中分離提取，也可化學(xué)合成，成本低，可大量生產(chǎn)。對抗體產(chǎn)生具有誘導(dǎo) 作用，同時可調(diào)節(jié)細胞因子的產(chǎn)生，淋巴細胞的增殖，促進細胞免疫反應(yīng)。此外，還以劑量依 賴性方式調(diào)節(jié)B細胞的分化，，具有廣泛的應(yīng)用前景，如在免疫調(diào)節(jié)和治療等方面等應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1 :法氏囊十一肽的分離和純化。分子篩譜圖。
[0020] 圖2 :法氏囊十一肽的分離和純化。高效液相色譜圖，箭頭所指，BPll的洗脫峰。
[0021] 圖 3 :MALDI-T0F-MS 分析。
[0022] 圖4 :HI抗體的測定。與AIV免疫組比較，差異顯著P < 0. 05 ;差異極顯著P < 0· 01。
[0023] 圖5 :雞體實驗中細胞因子分析圖。與空白對照組比較，差異顯著P < 0. 05 ;差異 極顯著P < 0. 01。
[0024] 圖6 :雞體實驗淋巴細胞增殖分析圖。與空白對照組比較，差異顯著P < 0. 05 ;差 異極顯著P < 0. 01。
[0025] 圖7 :CFU-pre-B形成實驗。與空白對照組比較，差異顯著P < 0. 05 ;差異極顯著 P < 0· 01。
[0026] 圖8 :B細胞分化實驗。與空白對照組比較，差異顯著P < 0.05 ;差異極顯著P < 0· 01。
[0027] 圖9 :AIV抗體IgG測定。與AIV免疫組比較，差異顯著P < 0. 05 ;差異極顯著P < 0· 01。
[0028] 圖10 :細胞因子分析圖。與空白對照組比較，差異顯著P < 0.05 ;差異極顯著P < 0· 01。

【具體實施方式】：
[0029] 本發(fā)明通過超濾分子截流、分子篩、反相高壓液相色譜（HPLC)柱層析、質(zhì)譜和氨 基酸分析等技術(shù)從法氏囊組織液中分離到一個全新的十一肽并鑒定其氨基酸的結(jié)構(gòu)組成。 對法氏囊十一肽的在動物體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)機制進行深入系統(tǒng)研究，從而為法氏囊活性肽的 臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，并有望推進禽類免疫學(xué)理論的發(fā)展。
[0030] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。
[0031] 實施例1、法氏囊素 i^一肽的分離與鑒定：
[0032] 取健康4?6周齡雞的法氏囊（AA肉雞，上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院附屬養(yǎng)殖場）4000克， 用6000ml生理鹽水碾碎、混勻，反復(fù)凍融三次。在4°C，12000g離心60分鐘，上清轉(zhuǎn)入另 一個管中，再次離心一次。然后經(jīng)IOOODa超濾膜，超濾，并凍干濾液。凍干樣品用PBS稀 釋，12000g離心10分鐘，然后用0· 22um濾膜過。取濾液經(jīng)分子篩（S印hadex G-50)純化 分析，收獲活性峰I (見圖1)，并凍干。凍干樣品用B液（2%乙腈，0.065%三氟乙酸）稀 釋，12000g離心10分鐘，然后用0. 22um濾膜過濾。取濾液經(jīng)反向高效液相純化分析，收獲 滯留時間為20. 25分鐘的活性峰（見圖2)。收獲的洗脫液經(jīng)MALDI-T0F-MS分析，分子量 為1185. 547(見圖3)，氨基酸序列DVAGKLPDNRT(SEQ ID NO: 1)，這是第一次從法氏囊中分 離發(fā)現(xiàn)。
[0033] 采用固相化學(xué)合成方法，合成氨基酸結(jié)構(gòu)相同的十一肽，純度在97%以上。
[0034] 實施例2、動物免疫及體液免疫反應(yīng)：
[0035] 天然的法氏囊提取物能促進B細胞的增殖、分化，從而導(dǎo)致抗體的產(chǎn)生。在此基礎(chǔ) 上，和21日齡來航雞為動物模型，以禽流感滅活疫苗（H9N2亞型F株，購自南京梅里亞動物 保健有限公司）與不同濃度的法氏囊十一肽聯(lián)合免疫兩次，分別在兩次次免疫后14天，采 血，分離血清，檢測HI抗體水平的變化情況，分析法氏囊^^一肽對體液免疫的調(diào)節(jié)功能（見 表1)。通過該實驗可以發(fā)現(xiàn)法氏囊十一肽能明顯調(diào)節(jié)體液免疫功能，且與劑量密切相關(guān)，并 且具有平衡Thl和Th2型免疫反應(yīng)的功能。
[0036] 1、HI抗體水平，采用血凝抑制試驗方法檢測，具體操作方法為：
[0037] 于微量血凝反應(yīng)板的每孔中滴加 PBS 25 μ 1，共滴四排。吸取病毒抗原（H9N2亞 型F株，購自中國獸醫(yī)藥品檢查所菌種保藏室）滴加于第一列孔，每孔25μ 1，然后由左至右 順序倍比稀釋至第11列孔，再從第11列孔各吸取25 μ 1棄之。然后于每孔中再加入PBS 25μ1。在于每孔中加入1%雞紅細胞懸液25μ1。置微型振蕩器上振蕩混勻，室溫（約 20°C )靜置40分鐘，或4°C 60分鐘，應(yīng)在對照孔的RBC顯著呈鈕扣狀時判定結(jié)果。
[0038] 以紅細胞完全凝集（++++)的抗原最大稀釋度為該抗原的血凝效價，表示一個HA 單位（HAU)。每次四排重復(fù)，以幾何均值表示結(jié)果。
[0039] 計算出含4個血凝單位的抗原濃度，按如下公式進行計算：
[0040] 抗原應(yīng)稀釋倍數(shù)=血凝滴度/4
[0041] 表1 :雞免疫程序
[0042]

【權(quán)利要求】
1. 一種多肽，其特征在于，所述的多肽包含有： 1) 氣基酸序列為SEQ ID NO :1 ; 2) 在1)中的氨基酸中取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸，由1)衍生的，且具有1)中 多肽功能的多肽。
2. 如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽是從法氏囊中分離的。
3. 權(quán)利要求1所述的多肽在制備提高動物免疫力的疫苗或免疫增強劑中的應(yīng)用。
4. 一種疫苗，其特征在于，所述的疫苗是以權(quán)利要求1所述的多肽作為抗原制備的。
5. 權(quán)利要求1所述的多肽在制備抗體中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求1所述的多肽在制備促進B細胞增殖和/或分化的制品中的應(yīng)用。
7. -種促進B細胞增殖和/或分化的制品，其特征在于，所述的制品包含有藥理有效濃 度的權(quán)利要求1所述的多肽。
【文檔編號】C07K7/06GK104402971SQ201410374368
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】劉曉東, 單虎, 陳溥言, 王述柏, 楊海燕, 秦志華, 張傳美 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)