靶向egfr的載鉑類藥物白蛋白納米粒及其制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種特異靶向人表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR)的載鉑類藥物白蛋白納米 粒、制備方法及其用途。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 宮頸癌是全球婦女惡性腫瘤中僅次于乳腺癌的第二位最常見(jiàn)的惡性腫瘤，在中國(guó) 女性中發(fā)病率居第一位。全世界每年有20多萬(wàn)婦女死于宮頸癌。據(jù)29個(gè)省、市、自治區(qū)的 調(diào)查表明，我國(guó)宮頸癌死亡率占總癌癥死亡率的第四位，占女性癌癥的第二位。發(fā)病年齡以 40歲到50歲為最多。卵巢癌是婦科腫瘤中惡性程度最高的疾病，居?jì)D科惡性腫瘤死亡率 首位，嚴(yán)重威脅著女性的生殖健康。卵巢癌發(fā)病隱匿，極易發(fā)生侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，約70%? 80%的卵巢癌患者診斷時(shí)即屬于III/IV期，其五年生存率僅為30%左右。宮頸癌和卵巢癌 的治療以徹底的腫瘤減滅術(shù)為主，但由于其轉(zhuǎn)移方式多表現(xiàn)為腹腔內(nèi)散在的廣泛種植，故 依靠手術(shù)徹底切除腫瘤尚不可能，殘存的散在腫瘤結(jié)節(jié)，必須依靠手術(shù)后的化療。最常用的 是以鉑類為主的一線聯(lián)合化療方案，但因化療藥物缺乏選擇性且具有毒性反應(yīng)，它在殺死 腫瘤細(xì)胞的同時(shí)往往也殺死了正常的細(xì)胞，導(dǎo)致患者出現(xiàn)骨髓抑制、腎功能不全、消化道反 應(yīng)、心臟傳導(dǎo)障礙等情況，生活質(zhì)量嚴(yán)重下降，一些患者甚至因化療引起的感染及出血等并 發(fā)癥而死亡，致使藥物利用度有限，使用劑量受限。此外，還有一些年老體弱或有心、肝、腎 功能不全的患者無(wú)法耐受化療的毒性反應(yīng)而不能進(jìn)行化療，導(dǎo)致卵巢癌迅速進(jìn)展而死亡。 因此，需要一種有效的靶向給藥系統(tǒng)使藥物到達(dá)腫瘤區(qū)。這種系統(tǒng)不僅可以提高藥物在腫 瘤區(qū)的濃度，更有效地殺傷腫瘤細(xì)胞，，而且可以減小對(duì)正常細(xì)胞、組織的損害。納米粒作為 靶向性制劑載體已成為國(guó)內(nèi)外研宄的熱點(diǎn)，通過(guò)載藥納米粒載體將治療藥物靶向地導(dǎo)向病 灶部位，可以達(dá)到靶向給藥的目的，而又對(duì)非靶組織、器官、細(xì)胞的影響很少。近年來(lái)的研宄 發(fā)現(xiàn)，將納米粒與具有特異腫瘤靶向的活性分子或特殊基團(tuán)相連，可使之具備腫瘤特異靶 向功能，從而在很大程度上提高了腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度。
[0003] 核酸適配體（Aptamer)是一段DNA (脫氧核糖核酸）或者RNA (核糖核酸）序列，是 利用體外篩選技術(shù)--指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，從核酸分子文庫(kù)中得到的寡核苷酸片段。具有高特 異性與親和性"靶向配基"的篩選，是制約主動(dòng)靶向給藥系統(tǒng)研宄的瓶頸。以往修飾腫瘤藥 物的"靶向配基"是抗體、多肽和葉酸等分子，但這些配基修飾的靶向藥物在實(shí)際應(yīng)用中均 存在著難以克服的缺陷。單克隆抗體潛在的免疫原性和制備的困難大大限制了其臨床的應(yīng) 用和產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程；葉酸等小分子雖然有諸多優(yōu)點(diǎn)，但要求病變組織細(xì)胞過(guò)多表達(dá)葉酸受 體，靶向作用才得以實(shí)現(xiàn)，而核酸適體卻具有以下優(yōu)點(diǎn)：高親和力、強(qiáng)特異性，靶標(biāo)普適性， 成本低廉、篩選制備計(jì)數(shù)成熟、無(wú)免疫原性、受體范圍廣泛。
[0004] 首個(gè)核酸適配體藥物"Macugen"由美國(guó)FDA在2005年批準(zhǔn)上市，成為核酸適配體 領(lǐng)域的一個(gè)里程碑。美國(guó)Achemix、SomaLogic，德國(guó)Noxxon AG等多個(gè)公司正在開(kāi)發(fā)核酸適 配體藥物和診斷試劑。腫瘤細(xì)胞靶向給藥是提高腫瘤治療效果減少毒副作用的有效途徑。 將藥物偶聯(lián)于腫瘤細(xì)胞特異性配體上是靶向給藥的主要方法。核酸能特異性結(jié)合細(xì)胞并且 隨之內(nèi)化，是理想的靶向細(xì)胞輸送劑。核酸適體"靶向配基"介導(dǎo)或修飾的藥物及藥物納米 制劑，為主動(dòng)靶向腫瘤細(xì)胞給藥系統(tǒng)構(gòu)建開(kāi)拓了新方向。
[0005] 白蛋白是一類在血漿中大量存在的蛋白。藥物載體研宄中常見(jiàn)的白蛋白包括人血 清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清白蛋白，分別可以從人血清、牛血清、蛋清中獲取。人血清白 蛋白是人體內(nèi)最豐富的血漿蛋白，人血清白蛋白在體內(nèi)具有多種作用，如：1)增加長(zhǎng)鏈脂 肪酸的溶解度；2)結(jié)合膽紅素；3)與多種藥物結(jié)合，如青霉素類、磺胺類、吲哚類、苯二氮卓 類等藥物。白蛋白分子中存在多種藥物結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)不同種類的藥物均能有效負(fù)載；同時(shí) 其具有水溶性高、穩(wěn)定性好、可降解等特點(diǎn)，其生物相容性高，已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理 局（FDA)批準(zhǔn)用于人體，因此白蛋白是藥物輸送的理想載體?；诎椎鞍椎募{米粒子用于 藥物輸送，可提高疏水性藥物的溶解度，并改善藥物的代謝動(dòng)力學(xué)。通過(guò)控制納米粒子的粒 徑，可提高被動(dòng)靶向作用，提高藥物在腫瘤處的攝取。同時(shí)，白蛋白上存在的氨基、巰基等， 可以進(jìn)一步修飾主動(dòng)革巴向基團(tuán)以提高革巴向性。紫杉醇 -白蛋白納米粒（nab-paclitaxel， Abraxaiie? )是第一個(gè)應(yīng)用白蛋白納米粒技術(shù)的上市藥物，F(xiàn)DA于2005年1月批準(zhǔn)其用 于乳腺癌的治療，SFDA于2008年批準(zhǔn)其在中國(guó)上市。該制劑利用了腫瘤細(xì)胞攝取營(yíng)養(yǎng)物 質(zhì)的途徑，將白蛋白傳送的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)替換為抗腫瘤藥紫杉醇，不僅避免了表面活性劑（如 聚氧乙烯蓖麻油）的使用，減少了由此帶來(lái)的過(guò)敏反應(yīng)，同時(shí)使藥物富集于腫瘤病灶部位。
[0006] 已知腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是由細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的多基因參與的極其復(fù)雜的過(guò)程， 表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR)信號(hào)通路在正常組織中多呈關(guān)閉狀態(tài)，而在腫瘤組織中被激活 開(kāi)放，而且其活躍程度與腫瘤病情進(jìn)展呈正相關(guān)。本發(fā)明人和國(guó)內(nèi)外的許多研宄均提示人 宮頸癌、卵巢癌組織和細(xì)胞株中均高表達(dá)EGFR。本發(fā)明人利用EGFR的核酸適配體修飾載藥 的白蛋白納米粒，靶向結(jié)合細(xì)胞表面EGFR高表達(dá)的宮頸癌和卵巢癌細(xì)胞，提高細(xì)胞內(nèi)藥物 攝取量，從而使藥物特異性作用于宮頸癌和卵巢癌細(xì)胞，發(fā)揮藥效，實(shí)現(xiàn)靶向治療。 (三）
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有臨床中的問(wèn)題，提供一種EGFR核酸適配體修飾的載鉑 類藥物白蛋白納米粒，具有特異性靶向和主動(dòng)靶向性、EGFR高表達(dá)的宮頸癌、卵巢癌腫瘤細(xì) 胞的載鉑類藥物白蛋白納米粒，使包裹的鉑類藥物在血液中能長(zhǎng)效循環(huán)、對(duì)癌組織具有雙 重靶向性、釋藥速率可調(diào)，以期最大限度的提高療效、降低其毒副作用。本發(fā)明的目的還提 供一種上述EGFR核酸適配體修飾的載鉑類藥物白蛋白納米粒的制備方法及其應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0009] 一種特異靶向人表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR的載鉑類藥物白蛋白納米粒，由白蛋白 與鉑類藥物制成白蛋白載鉑納米粒后，再通過(guò)PEG在其表面化學(xué)交聯(lián)EGFR核酸適配體 (EGFR apt)制得，粒徑為20?500nm，多分散指數(shù)在0. 1?1之間；所述白蛋白載鉬納米粒、 EGFR核酸適配體、PEG摩爾用量之比為0. 01?0,1 :0. 1?10 :0. 1?10,上述為制備載鉑 類藥物白蛋白納米粒的主要原料，并未包括制備過(guò)程中所用的輔料和溶劑等；
[0010] 所述鉑類藥物為下列之一：順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、奈達(dá)鉑、絡(luò)鉑；
[0011] 所述EGFR核酸適配體長(zhǎng)度為30?IOOnt，且包含如下部分連續(xù)堿基（>10nt)或 者全部堿基序列：5 ' -NH2-C6-UGCCGCUAUAAUGCACGGAUUUAAUCGCCGUAGAAAAGCAUGUCAAAGCCG UU-3'。
[0012] 優(yōu)選的，所述PEG為氨基化水溶性PEG分子，分子量在200?5000之間。
[0013] 所述載鉑類藥物白蛋白納米粒中還可添加藥學(xué)上可接受的輔料，所述輔料為下列 之一或其中兩種以上的混合物：維生素E、維生素C、反丁烯二酸、蘋(píng)果酸、沒(méi)食子酸丙酯、亞 硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、L-半胱氨酸或L-異亮氨酸。
[0014] -種制備所述特異靶向人表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR的載鉑類藥物白蛋白納米粒的 方法，所述方法包括：
[0015] (1)將濃度10?30% (w/w)的人血清白蛋白與0· 5?10mg/ml的鉑類藥物溶液 按照其中人血清白蛋白與鉑類藥物比例為Img :2?SOmg比例充分混合，室溫?cái)嚢?. 5?1 小時(shí)，攪拌過(guò)程中加入等體積無(wú)水乙醇，再加入終濃度〇. 1% (w/w)的戊二醛，攪拌12?24 小時(shí)后，4°C下12000rpm離心30min，棄上清，離心后產(chǎn)物重新分散于分散介質(zhì)中，制得白蛋 白載鉑納米粒溶液；所述分散介質(zhì)為下列之一：水、磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、碳酸鹽緩 沖液、5% (w/w)葡萄糖溶液或生理鹽水；
[0016] (2)取步驟⑴制得白蛋白載鉑納米粒溶液，加入碳二亞胺鹽酸鹽（EDC)和N-羥 基琥?白酰亞胺（NHS)，磁力攪拌下充分活化反應(yīng)10?30min，再加入0. 1?10mg/ml的氨基 化EGFR適配體分子和0. 1?10mg/ml的氨基化PEG分子，室溫反應(yīng)2小時(shí)后，取反應(yīng)液，加 入到超濾管中，4000?IOOOOrpm下離心5?15min，除去碳二亞胺鹽酸鹽和N-輕基琥?白 酰亞胺和未包裹游離的鉑類藥物，制得所述特異靶向人表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR的載鉑類 藥物白蛋白納米粒；所述白蛋白載鉑納米粒（以鉑類藥物含量摩爾量計(jì)算）、EGFR核酸適 配體、PEG、碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺摩爾用量之比為0. 01?0,1 :0. 1?10 : 0. 1 ?10 :0. 5 ?1 :0. 5 ?10。
[0017] 優(yōu)選的，所述鉑類藥物為順鉑，步驟（1)中分散介質(zhì)為生理鹽水。
[0018] 所述分散介質(zhì)中還可添加藥學(xué)上可接受的輔料，所述輔料為下列之一或其中兩種 以上的混合物：維生素E、維生素C、反丁烯二酸、蘋(píng)果酸、沒(méi)食子酸丙酯、亞硫酸氫鈉、偏亞 硫酸氫鈉、L-半胱氨酸或L-異亮氨酸。
[0019] 所述載鉑類藥物白蛋白納米粒是氨基化EGFR apt與白蛋白納米粒表面的羧基進(jìn) 行連接，在納米粒中包裹鉑類藥物。白蛋白載體具有良好的生物相容性及降解性，安全無(wú) 毒。本發(fā)明提供的EGFR apt修飾的載鉬類藥物白蛋白納米粒，粒徑在20?500nm;優(yōu)選 20?200nm之間；所述的納米粒粒徑為多數(shù)分散指數(shù)PDI在0. 25?1之間；再加上EGFR 靶向和PEG化，可以有效減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES)吞噬，延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間，提高藥物制劑的靶 向性。所述的PEG化表示在白蛋白分子上化學(xué)交聯(lián)氨基化PEG分子。
[0020] 本發(fā)明還涉及所述的載鉑類藥物白蛋白納米粒在制備治療EGFR蛋白高表達(dá)的腫 瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0021] 具體的，所述載鉑類藥物白蛋白納米粒可用于制備治療宮頸癌或卵巢癌的藥物。
[0022] 優(yōu)選的，所述鉑類藥物的給藥劑量（以鉑類藥物含量計(jì)）為0. 01?20mg/kg/每 次，給藥方案為每天給藥或間隔給藥，每一療程給藥劑量為0. 3?600mg/kg。
[0023] 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明提供的靶向EGFR載鉑類藥物白蛋白納米 粒制備工藝簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，能夠特異識(shí)別EGFR高表達(dá)腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤增值，促進(jìn)腫瘤 細(xì)胞凋亡，在抗腫瘤尤其是宮頸癌和卵巢癌臨床治療中具有重要應(yīng)用前景。 (四）
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1為靶向EGFR鉑類藥物白蛋白納米制劑理化性質(zhì)表征圖；
[0025] 圖2為靶向EGFR鉑類藥物白蛋白納米制劑藥物釋放曲線；