Flt3蛋白在制備肝癌對索拉菲尼療效評估試劑盒中的應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術領域，具體是Flt3蛋白在制備肝癌對索拉菲尼療效評估試劑盒中的應用。本發(fā)明的Flt3蛋白與肝癌相關性的發(fā)現(xiàn)為預測肝癌患者服用索拉菲尼提供全新的生物學標志物，對肝癌患者是否服用索拉菲尼具有重要指導作用。Flt3蛋白高表達的肝癌病人對索拉菲尼治療敏感，適于用索拉菲尼進行治療，且治療后預后較好，這對于肝癌病人服用索拉菲尼具有重要的指導意義。
【專利說明】
F113蛋白在制備肝癌對索拉菲尼療效評估試劑盒中的應用
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及生物技術領域，涉及一種Flt3蛋白的應用，具體地說，是Flt3蛋白在制備肝癌對索拉菲尼療效評估試劑盒中的應用。
【背景技術】
[0002]肝癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率長期居高不下。我國是世界上肝癌發(fā)病最多的國家，據“全球最新癌癥統(tǒng)計數據公布”數據顯示，肝癌全球每年有78.2萬新發(fā)病例，74.5萬死亡病例。其中，中國的新發(fā)病例數及死亡病例數均占了約50 %左右。
[0003]近年來，應用分子靶向藥物治療肝癌的研究逐漸受到重視，正在成為新的熱點。多靶點受體酪氨酸激酶抑制劑索拉非尼(多吉美)是唯一一個被FDA批準用于肝癌靶向治療的藥物，其對中晚期肝癌的治療效果已得到確認，也證明了分子靶向治療在肝癌治療中是可行的。但在臨床應用中發(fā)現(xiàn)，索拉菲尼只對小部分晚期肝癌患者效果明顯，多數肝癌患者服用索拉菲尼后療效不顯著，甚至出現(xiàn)強烈的副作用和藥物耐受情況。目前，發(fā)現(xiàn)可預測肝癌對索拉菲尼療效的生物標記物用于指導索拉菲尼臨床用藥是亟需解決的問題。
[0004]本領域迫切需要發(fā)現(xiàn)在肝癌中能預測索拉菲尼療效的生物標志物，這方面的研究對臨床治療肝癌及指導索拉菲尼臨床用藥有重要意義。
[0005]Flt3蛋白(FMS-like receptor tyrosine kinase-3,FMS樣的酪氨酸激酶3，簡稱Flt3，GeneID: 2322)是ΙΠ型受體型酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)家族成員之一，在正常造血及免疫系統(tǒng)發(fā)育中起著重要作用。Flt3基因突變與急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)的發(fā)生、預后密切相關。以Flt3作為革El分子已成為AML治療的一種新策略。(參見文獻:Rosnet O,Marchetto S，deLapeyriere 0，et al.MurineFlt3，a gene encoding a novel tyrosinekinase receptor of the PDGFR/CSFlRfamily[J].0ncogene,1991,6:1641-1650.；Matthews ff,Jordan CT,ffiegand Gff,et al.Areceptor tyrosine kinase specificto hematopoietic stem and progenitor cell-enriched populat1ns!! J].Cell，1991，65:1143-1152.)目前為止，F(xiàn)lt3在肝癌中的研究尚無文獻報道，其在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的分子機制仍不清楚。
[0006]目前還未見Flt3蛋白在制備肝癌術后索拉菲尼/療效評估試劑盒中的應的研究報道。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供Flt3蛋白的新應用，特別是在制備肝癌對索拉菲尼療效評估試劑盒中的應用。
[0008]本發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)，采用免疫組化方法檢測Flt3蛋白在肝癌術后服用索拉菲尼病人肝癌組織中的表達量，能夠判斷術后肝癌患者對于索拉菲尼藥物的敏感性?；贔lt3蛋白的表達量與肝癌的這種相關性，以該蛋白作為分子標志物，對其表達量進行檢測可以用于肝癌病人服用索拉菲尼的判斷指標。
[0009]本發(fā)明的第一方面，提供Flt3蛋白在制備肝癌索拉菲尼療效評估試劑或試劑盒中的應用。
[0010]所述的試劑或試劑盒檢測Flt3蛋白在術后肝癌組織或者原發(fā)灶穿刺組織中的表達量。
[0011]優(yōu)選的，所述的試劑或試劑盒采用免疫組化方法檢測Flt3蛋白在術后肝癌組織或者原發(fā)灶穿刺組織中的表達量。
[0012]更優(yōu)選的，所述的試劑或試劑盒是將Flt3蛋白作為分子標記，利用Flt3單克隆抗體或多克隆抗體，以及免疫組化試劑，分析Flt3蛋白在術后肝癌組織或者原發(fā)灶穿刺組織中的表達量，預測肝癌患者服用索拉菲尼的療效。
[0013]所述的Flt3單克隆抗體，為商品化抗體，如兔Flt3單克隆抗體(ABclonalA7897)
[0014]優(yōu)選的，所述的免疫組化試劑包括二甲苯，乙醇，3%H202溶液，I %BSA封閉液，DAB顯色試劑，蘇木素和辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG。
[0015]本發(fā)明的第二方面，提供Flt3蛋白在制備判斷肝癌患者對于索拉菲尼敏感性的試劑或試劑盒中的應用。肝癌組織中Flt3高表達的肝癌病人對索拉菲尼治療敏感。
[0016]本發(fā)明的第三方面，提供Flt3蛋白在制備指導肝癌患者索拉菲尼用藥的試劑或試劑盒中的應用。肝癌組織中Flt3高表達的肝癌病人適于用索拉菲尼進行治療。
[0017]本發(fā)明的第四方面，提供Flt3蛋白在制備判斷服用索拉菲尼肝癌患者的預后的試劑或試劑盒中的應用。肝癌組織中Flt3高表達的肝癌病人用索拉菲尼治療其預后更好，F(xiàn)lt3低表達的是否服用索拉菲尼并不影響患者預后。
[0018]本發(fā)明的第五方面，提供一種判斷服用索拉菲尼肝癌患者的預后的方法，所述的方法為檢測Flt3蛋白在肝癌組織中的表達量。高表達的肝癌病人用索拉菲尼治療其預后更好，F(xiàn)lt3低表達的是否服用索拉菲尼并不影響患者預后。
[0019]所述的檢測Flt3蛋白在肝癌組織中的表達量的方法，包括以下步驟:
[0020](a)利用免疫組化試劑二甲苯，乙醇，3 % H2O2溶液，I % BSA封閉液，DAB顯色試劑，蘇木素和辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG將肝癌組織切片進行免疫組化染色；
[0021](b)利用顯微鏡和成像裝置拍攝為數碼照片；
[0022](c)根據免疫組化染色結果人工評分原則，給出評分。
[0023]優(yōu)選的，所述的方法具體步驟如下:
[0024](I)制備肝癌組織石蠟切片，60°C烤箱過夜；
[0025](2)切片脫臘至水；
[0026](二甲苯I①1miη—二甲苯 Π ②1miη—二甲苯ΙΠ③1min—100 % 乙醇5min—95% 乙醇 5min—85% 乙醇 5min—75% 乙醇 5min—雙蒸水 5min)
[0027](3)3% H2O2 溶液，室溫放置 20min ；
[0028](4)雙蒸水洗 5minX3;
[0029](5)抗原修復:切片放入0.0lM檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中煮沸301^11;
[°03°] (6)自然冷卻至室溫，雙蒸水洗5minX3;
[0031](7)1%85厶封閉3011^11，37。(:；
[0032](8)用去封閉液，不洗，直接加一抗(兔F113單克隆抗體，購自ABc 1naI公司，稀釋比例1:50)。置入濕盒中4 °C冰箱過夜16小時；
[0033](9)4。(:取出，室溫復溫1511^11，然后0.0謹 PBS洗5minX4;
[0034](10)滴加二抗(辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG，購自丹麥DAKO公司，即用型，無需稀釋)45min，37°C ；
[0035](11)0.0lM PBS洗5minX4，DAB顯色2-10min，鏡下觀察；
[0036](12)雙蒸水終止顯色，蘇木素復染10秒；
[0037](13)分化后自來水返藍，蒸餾水浸泡；
[0038](14)脫水透明，蓋玻片覆蓋；
[0039](15)顯微鏡下觀察陽性染色，于肝癌組織隨機選取3個視野并拍照；
[0040](16)采用高倍鏡下綜合染色強度和陽性細胞所占比例進行半定量測定。具體評分如下:
[0041 ] I，染色強度評分標準:不著色O分，黃色I分，棕黃色2分;黃褐色3分。
[0042]2，陽性細胞所占比例評分標準:陽性細胞數彡5 %為O分;5 %?25 %為I分;25 %?50 %為2分;50 %?75 %為3分;75 %以上為4分。
[0043]3，兩種評分相乘，0-4分為陰性;4-8為弱陽性;8分以上為強陽性。
[0044]根據上述方法檢測病人肝癌組織中Flt3表達情況，進行評分，陰性和弱陽性組為低表達，強陽性為高表達，肝癌組織中Flt3高表達的肝癌病人術后索拉菲尼療效較好。
[0045]本發(fā)明的Flt3蛋白與肝癌相關性的發(fā)現(xiàn)，為預測肝癌患者服用索拉菲尼的療效提供了全新的生物標志物，對肝癌患者是否服用索拉菲尼具有重要指導作用。Flt3蛋白高表達的肝癌病人對索拉菲尼治療敏感，適于用索拉菲尼進行治療，且治療后預后較好。
[0046]本發(fā)明利用免疫組化技術、顯微鏡拍照和人工半定量測定腫瘤組織中Flt3蛋白的表達量，并結合術后隨訪信息，確定Flt3蛋白表達量與肝癌術后服用索拉菲尼病人的生存期存在相關性，F(xiàn)lt3蛋白能用于判斷肝癌患者是否應當服用索拉菲尼的生物標志物，對于肝癌病人術后服用索拉菲尼具有重要的指導意義。對于失去手術時機的肝癌患者，可以利用穿刺獲得肝癌組織進行Flt3表達水平的檢測，或者通過收集患者血液中的循環(huán)腫瘤細胞進行Flt3基因擴增的檢測，從而評估其對索拉菲尼的敏感性。
【附圖說明】
[0047]圖1為182例經手術治療的肝癌患者(93例術后服用索拉菲尼，89例術后未服用索拉菲尼)肝癌組織中Flt3的免疫組化染色的代表性圖，可見腫瘤組織中Flt3表達高低情況。
[0048]圖2為索拉菲尼未用藥組和用藥組中Flt3低表達組患者的生存分析圖，可見Flt3低表達組中是否服用索拉菲尼并不影響患者預后。
[0049]圖3為索拉菲尼未用藥組和用藥組中Flt3低表達組患者的生存分析圖，可見Flt3高表達組中用藥的患者預后更好。
[0050]圖4為Flt3在病例I的肝癌組織中免疫組化染色結果圖，可見腫瘤組織中Flt3著色很弱。
[0051]圖5為Flt3在病例2的肝癌組織中免疫組化染色結果圖，可見腫瘤組織中Flt3沒有著色。
[0052]圖6為Flt3在病例3的肝癌組織中免疫組化染色結果圖，可見腫瘤組織中Flt3著色較強。
[0053]圖7為Flt3在病例4的肝癌組織中免疫組化染色結果圖，可見腫瘤組織中Flt3著色較強。
【具體實施方式】
[0054]下面結合實施例對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0055]實施例1:
[0056]隨機選取89例肝癌患者術后未服用索拉菲尼的肝癌組織石蠟切片(肝癌組織切片均來自東方肝膽外科醫(yī)院，由2名病理科醫(yī)生確診為肝細胞癌)，采用免疫組化方法檢測Flt3蛋白在肝癌組織中的表達量并計算免疫組化評分，具體步驟如下:
[0057](I)制備肝癌組織石蠟切片，60 °C烤箱過夜；
[0058](2)切片脫臘至水；
[0059](二甲苯I①1miη—二甲苯 Π ②1miη—二甲苯ΙΠ③1min—100 % 乙醇5min—95% 乙醇 5min—85% 乙醇 5min—75% 乙醇 5min—雙蒸水 5min)
[0060](3)3% H2O2 溶液，室溫放置 20min ；
[0061](4)雙蒸水洗 5minX3;
[0062](5)抗原修復:切片放入0.0lM檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中煮沸301^11;
[0063](6)自然冷卻至室溫，雙蒸水洗5minX3;
[0064](7)1%85厶封閉3011^11，37。(:；
[0065](8)用去封閉液，不洗，直接加一抗(兔F113單克隆抗體，購自ABc1nal公司，稀釋比例1:50)。置入濕盒中，4 °C冰箱過夜16小時；
[0066](9)4°(:取出，室溫復溫1511^11，然后0.0謹 PBS洗5minX4;
[0067](10)滴加二抗，45min，37°C;
[0068](11)0.0lM PBS洗5minX4，DAB顯色2-10min，鏡下觀察；
[0069](12)雙蒸水終止顯色，蘇木素復染10秒；
[0070](13)分化后自來水返藍，蒸餾水浸泡；
[0071 ] (14)脫水透明，蓋玻片覆蓋；
[0072](15)顯微鏡下觀察陽性染色，于肝癌組織隨機選取3個視野并拍照；
[0073](16)采用病理科經典的免疫組化染色判讀方法，即高倍鏡下綜合染色強度和陽性細胞比例進行半定量分析，具體評分標準如下:
[0074]I，染色強度評分標準:不著色O分，黃色I分，棕黃色2分，黃褐色3分。
[0075]2，陽性細胞所占比例評分標準:陽性細胞數彡5 %為O分;5 %?25 %為I分;25 %?50 %為2分;50 % -75 %為3分;75 %以上為4分。
[0076]3，兩種評分相乘，0-4分為陰性;4-8為弱陽性;8分以上為強陽性。
[0077]采用以上免疫組化方法的試驗步驟檢測Flt3蛋白在89例術后未服用索拉菲尼患者的肝癌組織中表達情況，并依據評分標準進行評分。結果表明:根據評分將患者分為陰性13例、弱陽性42例、強陽性34例;將陰性和弱陽性定義為低表達組，強陽性定義為高表達組，其中低表達組55例，高表達組34例(見圖1)。
[0078]實施例2:
[0079]結合預后信息，對實施例1的182例病人中Flt3蛋白低表達的肝癌患者(用藥組64和未用藥組55例)進行生存分析，數據分析采用SPSS軟件18.0，生存曲線分析使用Kaplan-Meier法，兩組之間比較用log-rank檢驗。結果發(fā)現(xiàn)在用藥組中Flt3低表達患者生存和未用藥組中Flt3低表達患者之間并沒有統(tǒng)計學差異(P = 0.187)(見圖2)。結果提示:Flt3低表達組中是否服用索拉菲尼并不影響患者預后。
[0080]實施例3:
[0081]結合預后信息，對實施例1的182例病人中Flt3蛋白高表達的肝癌患者(用藥組29和未用藥組34例)進行生存分析，數據分析采用SPSS軟件18.0，生存曲線分析使用Kaplan-Me i er法，兩組之間比較用I og-rank檢驗。結果發(fā)現(xiàn)在用藥組中Flt3高表達患者生存明顯比未用藥組中Flt3高表達好，兩組生存分析有統(tǒng)計學差異(P = 0.038)(圖3)。結果提示:Flt3蛋白高表達組術后服用索拉菲尼預后更好。
[0082]實施例4:
[0083]病例1:某肝癌患者腫瘤的組織切片，采用以上免疫組化方法的試驗步驟檢測Flt3蛋白的表達量，結果發(fā)現(xiàn)Flt3低表達(肝癌組織染色結果的顯微圖片如圖4所示)。
[0084]經術后隨訪知，該患者術后服用索拉菲尼藥物預后較差，其總生存時間為7個月，并且術后3個月出現(xiàn)復發(fā)轉移。
[0085]實施例5:
[0086]病例2:某肝癌患者腫瘤的組織切片，采用以上免疫組化方法的試驗步驟檢測Flt3蛋白的表達量，結果發(fā)現(xiàn)Flt3低表達(肝癌組織染色結果的顯微圖片如圖5所示)。
[0087]經術后隨訪知，該患者術后服用索拉菲尼藥物預后較差，其總生存時間為6.3個月，并且術后2個月出現(xiàn)復發(fā)轉移。
[0088]實施例6:
[0089]病例3:某肝癌患者腫瘤的組織切片，采用以上免疫組化方法的試驗步驟檢測Flt3蛋白的表達量，結果發(fā)現(xiàn)Flt3高表達(肝癌組織染色結果的顯微圖片如圖6所示)。
[0090]經術后隨訪知，該患者術后服用索拉菲尼藥物預后較好，總生存時間為26個月，并且術后未發(fā)現(xiàn)復發(fā)轉移。
[0091]實施例7:
[0092]病例4:某肝癌患者腫瘤的組織切片，采用以上免疫組化方法的試驗步驟檢測Flt3蛋白的表達量，結果發(fā)現(xiàn)Flt3高表達(肝癌組織染色結果的顯微圖片如圖7所示)。
[0093]經術后隨訪知，該患者術后服用索拉菲尼藥物預后較好，其總生存時間為32個月，并且術后未發(fā)現(xiàn)有復發(fā)轉移。
[0094]由以上試驗結果可知，通過采用免疫組化的方法檢測Flt3蛋白分子表達量能指導索拉菲尼術后用藥。當免疫組化染色為Flt3高表達的肝癌患者，其術后服用索拉菲尼效果更好。顯然，F(xiàn)lt3蛋白的表達量與術后服用索拉菲尼肝癌患者的預后具有相關性，因此，以Flt3蛋白作為分子標志物，對其表達量進行檢測能指導索拉菲尼術后用藥。相應的，特異性抗Flt3蛋白的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體，能用于制備判定肝癌術后是否服用索拉菲尼的試劑或試劑盒，這對于本領域技術人員來說是顯而易見的。
[0095]以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實施例，熟悉本領域的技術人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權利要求所限定的范圍內。
【主權項】
1.Flt3蛋白在制備肝癌對索拉菲尼療效評估試劑或試劑盒中的應用。2.根據權利要求1所述的Flt3蛋白在制備肝癌對索拉菲尼療效評估試劑或試劑盒中的應用，其特征在于，所述的試劑或試劑盒檢測Flt3蛋白在術后肝癌組織或者原發(fā)灶穿刺組織中的表達量。3.根據權利要求2所述的Flt3蛋白在制備肝癌對索拉菲尼療效評估試劑或試劑盒中的應用，其特征在于，所述的試劑或試劑盒采用免疫組化方法檢測Flt3蛋白在術后肝癌組織或者原發(fā)灶穿刺組織中的表達量。4.根據權利要求3所述的Flt3蛋白在制備肝癌對索拉菲尼療效評估試劑或試劑盒中的應用，其特征在于，所述的試劑或試劑盒是將Flt3蛋白作為分子標記，利用Flt3單克隆抗體或多克隆抗體，以及免疫組化試劑，分析Flt3蛋白在術后肝癌組織或者原發(fā)灶穿刺組織中的表達量，預測肝癌患者服用索拉菲尼的療效。5.根據權利要求4所述的Flt3蛋白在制備肝癌對索拉菲尼療效評估試劑或試劑盒中的應用，其特征在于，所述的免疫組化試劑包括二甲苯，乙醇，3^H2O2溶液，I %BSA封閉液，DAB顯色試劑，蘇木素和辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG。6.Flt3蛋白在制備判斷肝癌患者對于索拉菲尼敏感性的試劑或試劑盒中的應用。7.Flt3蛋白在制備指導肝癌患者索拉菲尼用藥的試劑或試劑盒中的應用。8.Flt3蛋白在制備判斷服用索拉菲尼肝癌患者的預后的試劑或試劑盒中的應用。9.一種判斷服用索拉菲尼肝癌患者的預后的方法，其特征在于，所述的方法為檢測Flt3蛋白在肝癌組織中的表達量。
【文檔編號】G01N33/574GK106093394SQ201610399149
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月7日
【發(fā)明人】丁勁, 王紅陽, 劉輝, 李曉峰, 程卓, 汪珍光
【申請人】中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學