一種靶向增強成骨細胞骨形成的藥物及其合成方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種靶向增強成骨細胞骨形成的藥物，該藥物的有效成分為多肽，多肽由絲氨酸和天門冬氨酸兩種氨基酸組成，多肽中含有2～50個氨基酸，絲氨酸和天門冬氨酸的個數(shù)比為(0.25～4)：1，藥物中有效成分的質(zhì)量含量為50～60％。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明以骨質(zhì)疏松治療為目標、以來源于體內(nèi)天然蛋白的小分子活性多肽為骨靶治療藥物，該靶向藥物兼具有成骨細胞靶向性、良好的促進成骨能力，低細胞毒性和副作用，較低的用藥量，將為未來骨質(zhì)疏松治療提供重要藥選擇。
【專利說明】
一種靶向増強成骨細胞骨形成的藥物及其合成方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物材料領(lǐng)域，具體涉及一種靶向增強成骨細胞骨形成的藥物及其合 成方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨是高等脊椎動物體內(nèi)一種高度特異的結(jié)締組織，它提供了對肌體的支持作用和 肌肉附著部位。它也是無機離子的主要來源，并積極參與體內(nèi)的鈣磷平衡。骨骼的正常發(fā)育 和維護需要骨不斷吸收和重建。生理狀態(tài)下，這種平衡是協(xié)調(diào)的，成骨細胞、破骨細胞以及 骨細胞的功能正常，骨量和微觀結(jié)構(gòu)的完整性保持在一個穩(wěn)定的狀態(tài)。然而，這種骨改建失 衡是眾多骨疾病包括骨質(zhì)疏松癥，佩吉特氏癥，骨質(zhì)疏松癥，骨轉(zhuǎn)移癌，類風濕性關(guān)節(jié)炎，骨 髓炎等的重要原因。
[0003] 作為一個復雜的活組織，骨主要由三種不同類型的細胞:成骨細胞，破骨細胞和骨 細胞。成骨細胞是骨形成細胞，來源于局部的成骨祖細胞，負責合成骨基質(zhì)。破骨細胞是骨 吸收細胞，核大，來源于多種造血組織。這兩種類型的細胞只存在于骨表面的礦化骨基質(zhì)， 而骨細胞位于骨基質(zhì)內(nèi)，并能吸收并形成骨基質(zhì)。由于其通過突觸相連的特性。骨細胞外基 質(zhì)是由有機質(zhì)以及高度礦化的羥基磷灰石組成的。隨著骨生物學研究的不斷深入，近幾年 骨代謝疾病的治療藥物不斷發(fā)展，骨形成表面、骨吸收表面、破骨細胞、骨基質(zhì)等已經(jīng)作為 新的治療靶點納入研究。雖然有些研究產(chǎn)物已應(yīng)用于藥物的開發(fā)，但具體到骨及細胞受體， 大多數(shù)新開發(fā)的治療藥物不具備骨特異性。
[0004] 骨質(zhì)疏松癥(0 Serteoporo Seri Ser)是一種由骨代謝失衡引起的骨量減少、骨 骼微細結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞所導致骨骼脆弱而易發(fā)生骨折的全身性疾病。骨質(zhì)疏松癥是一個世界 范圍內(nèi)重要的健康問題。隨著人口老齡化的加重，骨質(zhì)疏松癥的患病人數(shù)顯著增加。目前， 全世界約有2億人罹患骨質(zhì)疏松癥，其發(fā)病率已躍居常見病的第七位。其中絕經(jīng)后女性的患 病率更高。65歲以上的女性高發(fā)骨折，嚴重影響中老年的生活質(zhì)量、健康和壽命。
[0005] 目前治療骨質(zhì)疏松癥的藥物分為三類：1)抑制骨吸收藥物，如雙磷酸鹽、雌激素 等;2)促進骨形成藥物，如甲狀旁腺素、氟化物等;3)雙向作用藥物:維生素 K、鍶鹽等。由于 骨組織有著硬度大、局部血供不豐富、滲透性差和生理生化過程特殊等特點，按一般的給藥 途徑很難使藥物轉(zhuǎn)運至病灶部位。這些藥物常通過全身給藥，增大使用劑量才能在骨組織 中達到有效的治療濃度。由于藥物缺乏骨特異性，不僅降低了藥物的治療指數(shù)，而且會對病 人的非骨組織或器官造成不必要的毒副作用，如激素替代療法的長期副作用的最近的報告 顯示，以代表藥物甲狀旁腺素為例，應(yīng)用超過兩年療效降低，骨量丟失，甚至嚴重副作用可 有神經(jīng)癥狀，腎衰竭等。因此尋求一種靶向性能好的治療骨質(zhì)疏松的藥物已經(jīng)十分必要了。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種靶向性能好、毒 性和副作用小的靶向增強成骨細胞骨形成的藥物及其合成方法。
[0007] 本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):一種靶向增強成骨細胞骨形成的藥 物，該藥物的有效成分為多肽，所述的多肽由絲氨酸和天門冬氨酸兩種氨基酸組成，所述多 肽中含有2~50個氨基酸，所述絲氨酸和天門冬氨酸的個數(shù)比為(0.25~4): 1，所述藥物中 有效成分的質(zhì)量含量為50~60%。
[0008] 所述的多肽包括3個絲氨酸和2個天門冬氨酸，所述多肽的序列為Ser Asp Ser Ser Asp，其中，Ser代表絲氨酸，Asp代表天門冬氨酸。
[0009] 牙和骨組織作為人體中礦化程度最高的器官，其中的促進礦化蛋白具有增加骨 量，治療骨質(zhì)疏松的潛力。Ser Asp Ser Ser Asp選自牙本質(zhì)磷蛋白（DPP)-級結(jié)構(gòu)，該蛋白 氨基酸排列順序有特征性的Ser Asp以及Ser Ser Asp重復序列。選擇該序列有以下原因： (I )DPP來源于人體礦化程度最高的硬組織，牙齒，其表達位置為礦化的牙本質(zhì)，骨組織中也 有表達；（2)DPP是牙本質(zhì)中表達量最高的細胞外基質(zhì)蛋白，在牙槽骨中也有顯著表達；（3) DPP缺乏的小鼠其牙本質(zhì)和骨組織礦化受到明顯抑制，牙齒變薄，牙槽骨吸收明顯；（4)蛋白 質(zhì)化學，細胞學及組織學實驗證實，DPP中氨基酸Asp是高度酸性的氨基酸，導致Ser Asp Ser Ser Asp酸性較高，能夠特異性結(jié)合骨組織表面的羥基磷灰石，明顯促進成牙細胞和成 骨細胞的成熟和分泌礦化基質(zhì)。作為較特異的礦化調(diào)節(jié)蛋白，在牙本質(zhì)的發(fā)育與礦化過程 中起重要作用。（5)體內(nèi)體外研究發(fā)現(xiàn)Ser Asp Ser Ser Asp多肽，能夠通過與成骨細胞表 面特異性蛋白骨膜蛋白（perio Sertin)結(jié)合，并胞吞進入細胞，從而特異性靶向作用于成 骨細胞。
[0010]作為牙和骨中重要的促礦化蛋白的重復氨基酸序列，所述多肽Ser Asp Ser Ser Asp具有DPP促進成骨基質(zhì)蛋白表達，促進骨基質(zhì)礦化的功能。
[0011] 所述的藥物還包括生理鹽水，作為溶劑，使得藥物可以直接靜脈注射。
[0012] 所述的多肽表面修飾有PEG，即聚乙二醇。
[0013] -種如上所述靶向增強成骨細胞骨形成的藥物的合成方法，包括以下幾個步驟：
[0014] (1)多肽的制備:通過十二通道半自動多肽合成儀按比例將氨基酸縮合成多肽，待 用；
[0015] (2)多肽的活化:將步驟（1)所得多肽溶于去離子水中，然后加入與多肽等質(zhì)量的 EDC和NHS進行多肽的活化;其中，EDC為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，NHS 為N-羥基琥珀酰亞胺；
[0016] (3)多肽的修飾:將PEG與多肽以（0.5~2): 1的質(zhì)量比進行混合，靜置過濾后即得 所述靶向增強成骨細胞骨形成的藥物。
[0017] 步驟⑵所述活化的溫度為2~10°C，活化時間為5~20min。
[0018] 步驟(3)所述靜置的溫度為2~10°C，靜置的時間為10~20h。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在以下幾方面：
[0020] (1)本發(fā)明的有效成分來源于具有高礦化調(diào)節(jié)能力的天然蛋白DPP，具有很高的靶 向性，可以將藥物準確送至骨細胞中，減少了藥物的副作用；
[0021] (2)本發(fā)明的有效成分來源于具有高礦化調(diào)節(jié)能力的天然蛋白DPP，具有促進成 骨，促進生物礦化的作用；
[0022] (3)本發(fā)明采用短肽，合成簡單，生產(chǎn)成本低。
【附圖說明】
[0023] 圖1為本發(fā)明的合成步驟示意圖；
[0024] 圖2為藥物的體內(nèi)器官分布實驗結(jié)果圖；
[0025] 圖3為實施例1藥物在成骨細胞表面的靶向?qū)嶒灲Y(jié)果圖；
[0026] 圖4為小鼠注射實施例1藥物1月后骨量變化示意圖；
[0027] 圖5為小鼠注射實施例1藥物3天后骨基質(zhì)蛋白表達結(jié)果圖；
[0028] 圖6為骨質(zhì)疏松癥模型小鼠注射實施例1藥物1月后骨量CT分析結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0029]下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施 例。
[0030] 實施例1
[0031] 一種靶向增強成骨細胞骨形成的藥物，其有效成分為多肽，該多肽由3個絲氨酸和 2個天門冬氨酸組成，其序列為Ser Asp Ser Ser Asp，其中，Ser代表絲氨酸，Asp代表天門 冬氨酸，其中多肽的表面修飾有PEG。
[0032]該藥物還包括生理鹽水，有效成分的含量為55%，在使用時，直接通過靜脈注射進 入人體。
[0033] 上述靶向增強成骨細胞骨形成的藥物，其合成方法如圖1所示，包括以下幾個步 驟：
[0034] (1)多肽的制備:通過十二通道半自動多肽合成儀按Ser: Asp = 2: 3比例將氨基酸 縮合成多肽，待用；
[0035] (2)多肽的活化:將步驟（1)所得多肽溶于去離子水中，然后加入與多肽等質(zhì)量的 EDC和NHS進行多肽的活化;活化的溫度為4°C，活化時間為IOmin;
[0036] (3)多肽的修飾:將PEG與多肽以1:1進行混合反應(yīng)，靜置過濾后即得所述骨質(zhì)疏松 癥靶向治療多肽藥物。靜置溫度為4°C，靜置時間為12h。
[0037] (4)多肽的保存:將修飾后多肽進行凍干，-80 °C冰箱保存。
[0038] 將上述靶向藥物帶上熒光標記，鼠尾靜脈注射FITC熒光標記所述藥物后，通過活 體成像儀觀察，其結(jié)果如圖2所示，結(jié)果顯示，熒光信號在軟組織器官中相近，在骨組織中實 驗組明顯高于對照組，說明該載體具有骨靶向作用。
[0039] 小鼠尾靜脈注射所述藥物遞送FITC熒光標記小核酸后，切片觀察，結(jié)果如圖3所 示，結(jié)果顯示，熒光蛋白在成骨細胞中特異性富集，說明該載體具有成骨細胞靶向作用。
[0040] 小鼠尾靜脈注射所述藥物1月后，將骨組織固定切片觀察，結(jié)果如圖4所示，該藥物 能夠使骨小梁增粗，骨量增加。
[0041] 小鼠尾靜脈注射所述藥物3天后，提取骨組織RNA，進行實時PCR檢測，結(jié)果如圖5所 示，該藥物能夠增加骨橋蛋白（0CN)、骨涎蛋白（B SerP)、堿性磷酸酶(ALP)等骨基質(zhì)蛋白的 表達。
[0042] 成骨細胞將上述所得的靶向藥物，體內(nèi)注射，靶向干預雌激素缺乏造成的骨質(zhì)疏 松，注射一月后，骨質(zhì)疏松癥小鼠骨量明顯增加，結(jié)果如圖6所示，說明該多肽藥物治療骨質(zhì) 疏松癥。
[0043] 實施例2
[0044] -種靶向增強成骨細胞骨形成的藥物，其有效成分為多肽，該多肽由1個絲氨酸和 1個天門冬氨酸組成，其序列為Ser Asp，其中，Ser代表絲氨酸，Asp代表天門冬氨酸，其中多 肽的表面修飾有PEG。
[0045] 該藥物還包括生理鹽水，有效成分的含量為50%，在使用時，直接通過靜脈注射進 入人體。
[0046] 上述靶向增強成骨細胞骨形成的藥物，包括以下幾個步驟：
[0047] (1)多肽的制備：通過十二通道半自動多肽合成儀按Ser:Asp = 1:1比例將氨基酸 縮合成多肽，待用；
[0048] (2)多肽的活化:將步驟（1)所得多肽溶于去離子水中，然后加入與多肽等質(zhì)量的 EDC和NHS進行多肽的活化;活化的溫度為2°C，活化時間為20min;
[0049] (3)多肽的修飾:將PEG與多肽以0.5:1進行混合反應(yīng)，靜置過濾后即得所述骨質(zhì)疏 松癥靶向治療多肽藥物。靜置溫度為2 °C，靜置時間為20h。
[0050] (4)多肽的保存:將修飾后多肽進行凍干，-80 °C冰箱保存。
[0051] 將所得多肽進行檢測，結(jié)果顯示，該多肽具有靶向治療骨質(zhì)疏松的作用。
[0052] 實施例3
[0053] 一種靶向增強成骨細胞骨形成的藥物，其有效成分為多肽，該多肽由10個絲氨酸 和40個天門冬氨酸組成，其序列為：
[0054] Ser Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp，其中，Ser代表絲氨酸， Asp代表天門冬氨酸，其中多肽的表面修飾有PEG。
[0055] 該藥物還包括生理鹽水，有效成分的含量為60%，在使用時，直接通過靜脈注射進 入人體。
[0056] 上述靶向增強成骨細胞骨形成的藥物，包括以下幾個步驟：
[0057] (1)多肽的制備:通過十二通道半自動多肽合成儀按Ser: Asp = 1:4比例將氨基酸 縮合成多肽，待用；
[0058] (2)多肽的活化:將步驟（1)所得多肽溶于去離子水中，然后加入與多肽等質(zhì)量的 EDC和NHS進行多肽的活化;活化的溫度為10°C，活化時間為5min;
[0059] (3)多肽的修飾:將PEG與多肽以2:1進行混合反應(yīng)，靜置過濾后即得所述骨質(zhì)疏松 癥靶向治療多肽藥物。靜置溫度為1 〇 °C，靜置時間為IOh。
[0060] (4)多肽的保存:將修飾后多肽進行凍干，-80 °C冰箱保存。
[0061] 將所得多肽進行檢測，結(jié)果顯示，該多肽具有靶向治療骨質(zhì)疏松的作用。
[0062] 實施例4
[0063] -種靶向增強成骨細胞骨形成的藥物，其有效成分為多肽，該多肽由8個絲氨酸和 2個天門冬氨酸組成，其序列為Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Ser Ser Asp，其中，Ser代 表絲氨酸，Asp代表天門冬氨酸，其中多肽的表面修飾有PEG。
[0064] 該藥物還包括生理鹽水，有效成分的含量為53%，在使用時，直接通過靜脈注射進 入人體。
[0065] 上述靶向增強成骨細胞骨形成的藥物，包括以下幾個步驟：
[0066] (1)多肽的制備：通過十二通道半自動多肽合成儀按Ser: Asp = 4:1比例將氨基酸 縮合成多肽，待用；
[0067] (2)多肽的活化:將步驟（1)所得多肽溶于去離子水中，然后加入與多肽等質(zhì)量的 EDC和NHS進行多肽的活化;活化的溫度為4°C，活化時間為17min;
[0068] (3)多肽的修飾:將PEG與多肽以1:1進行混合反應(yīng)，靜置過濾后即得所述骨質(zhì)疏松 癥靶向治療多肽藥物。靜置溫度為5 °C，靜置時間為16h。
[0069] (4)多肽的保存:將修飾后多肽進行凍干，_80°C冰箱保存。
[0070]將所得多肽進行檢測，結(jié)果顯示，該多肽具有靶向治療骨質(zhì)疏松的作用。 <110>同濟大學 <]20> -種靶向增強成骨細胞骨形成的藥物及其合成方法 <160> 3 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>多肽 <400> 1 Ser Asp Ser Ser Asp I S <210>2 <211>50 <212> PRT <213>人工序列 [0071 ] <400> 2 Ser Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp I 5 10 Ser Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp II 15 20 Ser Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp 21 25 30 Ser Asp Asp Asp Ser \sp Asp A.sp Asp Asp 31 35 40 Ser Asp Asp Asp See Asp \sp Asp Asp Asp 41 45 50 <210>3 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <400> 3 Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Ser Scr Asp I 5 10
【主權(quán)項】
1. 一種靶向增強成骨細胞骨形成的藥物，其特征在于，該藥物的有效成分為多肽，所述 的多肽由絲氨酸和天門冬氨酸兩種氨基酸組成，所述多肽中含有2~50個氨基酸，所述絲氨 酸和天門冬氨酸的個數(shù)比為(0.25~4): 1，所述藥物中有效成分的質(zhì)量含量為50~60%。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向增強成骨細胞骨形成的藥物，其特征在于，所述的多肽包 括3個絲氨酸和2個天門冬氨酸，所述多肽的序列為Ser Asp Ser Ser Asp，其中，Ser代表絲 氨酸，Asp代表天門冬氨酸。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種靶向增強成骨細胞骨形成的藥物，其特征在于，所述的藥 物還包括生理鹽水。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種靶向增強成骨細胞骨形成的藥物，其特征在于，所述的多 肽表面修飾有PEG。5. -種如權(quán)利要求1~4任一所述靶向增強成骨細胞骨形成的藥物的合成方法，其特征 在于，該方法包括以下幾個步驟： (1) 多肽的制備:通過十二通道半自動多肽合成儀按比例將氨基酸縮合成多肽，待用； (2) 多肽的活化:將步驟（1)所得多肽溶于去離子水中，然后加入與多肽等質(zhì)量的EDC和 NHS進行多肽的活化； (3) 多肽的修飾:將PEG與多肽以（0.5~2): 1的質(zhì)量比進行混合，靜置過濾后即得所述 靶向增強成骨細胞骨形成的藥物。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種靶向增強成骨細胞骨形成的藥物的合成方法，其特征在 于，步驟(2)所述活化的溫度為2~10°C，活化時間為5~20min。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種靶向增強成骨細胞骨形成的藥物的合成方法，其特征在 于，步驟(3)所述靜置的溫度為2~10°C，靜置的時間為10~20h。
【文檔編號】A61K38/05GK106075389SQ201610596298
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月27日 公開號201610596298.6, CN 106075389 A, CN 106075389A, CN 201610596298, CN-A-106075389, CN106075389 A, CN106075389A, CN201610596298, CN201610596298.6
【發(fā)明人】孫瑤, 王曉剛, 蔡明詳
【申請人】同濟大學