本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術領域，具體涉及化合物4-BPT（4-(2-bromophenyl)-2-phenyl-5,6,7,8-tetrahydroquinoline，7-甲基-2,4-二苯基-5,6,7,8-四氫喹啉，簡稱4-BPT）在制備治療卵巢癌藥物中的應用。

背景技術：

卵巢惡性腫瘤（卵巢癌）在女性常見惡性腫瘤中占2.4%～6.5%，在女性生殖系統(tǒng)癌瘤中占第3位，次于宮頸癌和宮體癌。近幾年來，由于對宮頸癌及宮體癌的防治，取得了一定的成效，而有關卵巢癌的防治方面收效相對較小。所以在婦女生殖系統(tǒng)癌瘤中，卵巢癌是造成死亡原因最高的一種腫瘤。造成其病死率居高不下的原因是由于卵巢惡性腫瘤生長部位隱蔽，無法直接看到，早期卵巢惡性腫瘤癥狀不明顯，仍缺乏簡便實用的診斷方法。

臨床上治療卵巢癌采用的是手術切除并輔助化療的綜合治療方法,紫杉醇與鉑類藥物(順鉑或卡鉑)聯(lián)合化療是卵巢癌治療的標本化療方案，拓撲替康、阿霉素、依托泊普以及吉西他濱等作為二線治療藥物被用于卵巢癌患者的治療。鉑類藥物(順鉑或卡鉑)清除卵巢癌細胞的作用機制主要是通過P53及JNK等分子發(fā)揮作用，臨床資料顯示，約60%一80%的卵巢癌患者含有P53基因的突變或缺失，該基因的突變或缺失直接削弱了以鉑類為基礎的化療療效；另外，還有約30%的卵巢癌患者對鉑類藥物與紫杉醇類藥物結合的治療方法不敏感；同時，常規(guī)治療方法在有效劑量范圍內(nèi)對機體能造成較大的傷害,耐藥復發(fā)問題是卵巢癌治療中常發(fā)生的問題，基于當前化療藥物對卵巢癌治療存在非特異性和耐藥性，因此，尋找無毒副作用且高效的新型抗癌藥物是是醫(yī)藥衛(wèi)生領域急需解決的問題。

近十年，出現(xiàn)了另一種治療腫瘤重要途徑----細胞衰老。細胞衰老是指細胞從一個活性的生長狀態(tài)轉變?yōu)椴豢赡孓D的生長停滯狀態(tài)，是正常細胞的必然歸宿，在惡性轉化過程中缺失。細胞衰老被認為是抑制腫瘤細胞生長的重要機制。最近研究表明不同類型的抗癌藥物在低劑量時可以誘導腫瘤細胞產(chǎn)生衰老樣表型，進入永久生殖停滯。細胞衰老能在藥物濃度明顯低于傳統(tǒng)治療濃度的情況下被誘導，為降低藥物毒性提供了可能性。因此，在腫瘤治療中誘導腫瘤細胞衰老是一種非常有希望的治療方法。

本發(fā)明涉及的化合物 4-BPT 是在2016年在Tetrahedron雜志上已報道的一種吡啶類化合物，吡啶及其衍生物是性能優(yōu)良的溶劑，能溶解多種無機物和有機物；廣泛應用于合成橡膠、染料，飼料工業(yè)添加劑；由于吡啶環(huán)對生物體的活性高，又可應用于醫(yī)藥、農(nóng)藥等。本發(fā)明所涉及的化合物為白色固體，熔點為87-88 ℃，呈弱堿性。本發(fā)明所涉及的化合物的生物學活性還未見報道，本發(fā)明研究了其在抗卵巢癌活性方面的生物學效應。經(jīng)研究表明，β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色實驗證明該化合物可誘導卵巢癌細胞衰老，但對正常的人成纖維細胞無影響或影響很小。細胞增殖曲線表明，該化合物夠顯著的抑制卵巢癌細胞系A2780的增殖。細胞周期檢測的結果表明，4-BPT夠影響卵巢癌細胞的細胞周期，使其阻滯在S期，發(fā)生細胞周期停滯；因此，本發(fā)明涉及的雜環(huán)化合物4-BPT在抗卵巢癌活性方面具有非常大的作用，并且在日后卵巢癌的治療方面具有很大的潛在價值。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的缺陷，為更好的治愈或為治療卵巢癌提供一種可行的選擇，本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量創(chuàng)造性的勞動，篩選出一種化合物4-BPT，在抗卵巢癌活性方面具有很好的抑制作用，進而為治療卵巢癌或誘導卵巢癌細胞的凋亡提供了新的療法或手段。

本發(fā)明首先提供一種吡啶類衍生物在制備治療癌癥藥物中的應用，其中所述的吡啶類衍生物為4-(2-bromophenyl)-2-phenyl-5,6,7,8-tetrahydroquinoline，7-甲基-2,4-二苯基-5,6,7,8-四氫喹啉，簡稱4-BPT，其化學結構式如下：

。

其中，上面所述的癌癥為卵巢癌；

所述應用為抑制癌細胞增殖或誘導衰老；具體的，所述的應用為阻滯細胞周期。

本發(fā)明還提供一種治療癌癥的藥物，所述藥物中的有效成分為吡啶類衍生物為4-(2-bromophenyl)-2-phenyl-5,6,7,8-tetrahydroquinoline，7-甲基-2,4-二苯基-5,6,7,8-四氫喹啉，簡稱4-BPT。

其中所述的藥物還包括藥學上可接受的載體或輔料，所述載體和/或輔料為本領域技術人員所知曉，在此不做贅述。

所述的藥物為抑制細胞增殖或誘導衰老的藥物；具體的，所述的藥物為阻滯細胞周期的藥物。

本發(fā)明通過體外β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色實驗，表明4-BPT對人卵巢癌細胞A2780和SKOV3具有顯著誘導衰老的作用，而對正常人成纖維細胞IMR90幾乎無影響。且通過測定不同濃度下細胞生長曲線、細胞周期及凋亡檢測，確定該化合物對細胞的增殖有抑制作用，并通過調(diào)控細胞周期的方式抑制卵巢癌細胞的增殖，在抗卵巢癌方面活性非常顯著，在抗卵巢癌藥物制備方面有良好的開發(fā)應用前景。

本發(fā)明通過試驗表明：體外SA-β-gal染色實驗證實該化合物對誘導卵巢癌A2780和SKOV3細胞的衰老作用十分明顯，但在同等實驗條件下，對正常人成纖維IMR90細胞幾乎沒有影響；細胞增殖實驗驗證了該化合物對卵巢癌A2780細胞具有抑制作用，這種作用呈濃度依賴性；細胞周期檢測結果表明，該化合物使大量卵巢癌A2780細胞周期的S期受阻，細胞堆積在G0/G1期，使其細胞周期改變。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明所涉及的化合物可以選擇性促進卵巢癌細胞的衰老，并且對正常細胞影響較小或沒有影響。這相較于傳統(tǒng)的抗卵巢癌藥物所引起的極大的毒副作用，具有十分明顯的優(yōu)勢。本發(fā)明所涉及的化合物可以對卵巢癌細胞的細胞周期進行阻滯，使細胞周期S期受阻，G0/G1期細胞大量堆積，從而誘導卵巢癌細胞進入細胞衰老狀態(tài)。本發(fā)明所涉及的化合物具有明顯抗卵巢癌活性，在制備抗卵巢癌藥物和治療卵巢癌方面有很大的潛力，為今后的研究應用提供新的選擇。

附圖說明

圖1. 化合物4-BPT的化學結構式。

圖2. A2780細胞系SA-β-gal染色結果（上圖）及陽性細胞統(tǒng)計結果圖（下圖）。

圖3. SKOV3細胞系SA-β-gal染色結果（上圖）及陽性細胞統(tǒng)計結果圖（下圖）。

圖4. IMR90細胞系SA-β-gal染色結果（上圖）及陽性細胞統(tǒng)計結果圖（下圖）。

圖5. A2780細胞增殖曲線圖。

圖6. 不同作用濃度的4-BPT處理卵巢癌A2780細胞96 h后的流式細胞儀檢測圖（上圖）及平行3次后的細胞周期統(tǒng)計圖（下圖）。

圖7. 不同作用濃度的4-BPT處理卵巢癌A2780細胞96 h后的流式細胞儀檢測圖（上圖）及平行3次后的細胞凋亡統(tǒng)計圖（下圖）。

具體實施方式

以下通過實施例對本發(fā)明做進一步詳細的說明，下述非限制性實施例不以任何方式限制本發(fā)明。下述實施例中，如無特殊說明，所使用的實驗方法均為常規(guī)方法，所用材料、試劑等均可從化學試劑公司購買。

本發(fā)明所涉及的具體化合物4-BPT的制備方法請參見：Chunyin Zhu*, Benwei Bi, Ya Ding, Te Zhang, Qiu-Yun Chen. Iodine-catalyzed aerobic oxidative formal [4+2] annulation for the construction of polyfunctionalized pyridines. Tetrahedron.2016, 72(5), 779.本發(fā)明涉及的化合物由該論文作者提供。

實施例1. 細胞的培養(yǎng)和傳代

卵巢癌A2780和SKOV3細胞 (購于American type culture collection)體外分別培養(yǎng)于含10% 胎牛血清及青霉素（100U/mL）-鏈霉素(100 μg/mL）的DMEM(Life Technologies公司，美國)培養(yǎng)基和含10% 胎牛血清及青霉素-鏈霉素的RMPI-1640培養(yǎng)基中；人成纖維IMR90細胞(購于American type culture collection) 培養(yǎng)于含10% 胎牛血清及青霉素-鏈霉素的專用DMEM培養(yǎng)基中。每天定期觀察細胞生長狀態(tài)，待長滿培養(yǎng)皿時及時傳代（一般在貼壁細胞表面積占80% 及以上時傳代）。當細胞培養(yǎng)和傳代效果良好時進行下一步實驗。

其中所述的專用DMEM培養(yǎng)基500 mL =1 mL維生素( 100 × ，購于Life Technologies，美國 ) + 5 mL丙酮酸酯(100 nM ，購于Life Technologies，美國) + 2mL氨基酸( 50 × ，購于Life Technologies，美國 ) + 1 mL非必需氨基酸(100 × ，購于Life Technologies，美國 )+491 mL DMEM培養(yǎng)基。

實施例2. SA-β-gal實驗檢測細胞衰老

第一步：取圓形玻片浸泡于95 % 的乙醇中，點燃酒精燈灼燒玻片，將玻片放入24孔板中，靜置放涼備用。底面直徑6 cm培養(yǎng)皿的卵巢癌A2780和SKOV3細胞及人成纖維IMR90細胞培養(yǎng)和傳代良好后，棄原培養(yǎng)液，用2 mLPBS清洗，0.5 mL胰酶消化，加2 ml含10% 胎牛血清及青霉素-鏈霉素的DMEM(或RMPI-1640,IMR90專用DMEM)培養(yǎng)基吹打混勻，200 g離心5 min，棄上清，加含10 % 胎牛血清及青霉素-鏈霉素的DMEM(或RMPI-1640，IMR90專用DMEM)培養(yǎng)基吹打混勻，取0.5 mL到EP管，用槍吸取10 μl于細胞計數(shù)板上計數(shù)或稀釋相應倍數(shù)后計數(shù)。A2780 、SKOV3和IMR90每孔種4×10⁴個細胞，分別將細胞種到24孔板中，吹打混勻。放入CO₂恒溫培養(yǎng)箱（Thermo scientific，37℃）靜止培養(yǎng)24 h，使其貼壁。

第二步：將4-BPT按不同比例稀釋于無菌干凈的DMSO溶液中，分別加作用濃度為0 μM（即為對照組）、10 μM、20 μM、40 μM 的4-BPT溶液到24孔板中，保持每孔所加的化合物稀釋液的體積保持不變，放入CO₂恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃）靜止培養(yǎng)48 h。

第三步：將培養(yǎng)48 h后的細胞取出，吸去培養(yǎng)基，加入0.5 mL 的PBS清洗玻片，輕輕晃動，吸去PBS，重復三次。加入0.5 mL的固定液（1 mL =54 μL甲醛+80 μL 2.5 %戊二醛+866 μL PBS），室溫下固定5 min。吸去固定液，再用PBS清洗3次。每孔加入0.5 mL染色液（1 mL=798 μLH₂O+30 μL5 M NaCl+2 μL1 M MgCl+10 μL 0.5 M K₃Fe(CN)₆+10 μL 0.5 M K₄Fe(CN)₆+100 μL0.4 M Na₂HPO₄+50 μL 20 mg/mL X-gal）,置于37℃的CO₂培養(yǎng)箱中孵育10 h左右。取出，蒸餾水洗2遍，棄去。無水乙醇洗2遍，水洗三遍。取載玻片，滴5 μL水于載玻片上，取出玻片，將其倒扣于水上，切勿產(chǎn)生氣泡，用指甲油將四周固封好。待指甲油干掉后，在玻片上加一滴水，用真空泵洗掉。在400倍倒置顯微鏡下拍照。

實驗結果顯示：使用SA-β-gal方法檢測化合物4-BPT在細胞培養(yǎng)液中，誘導卵巢癌A2780和SKOV3細胞及人正常成纖維IMR90細胞誘導衰老的能力。如圖2-4所示，不同作用濃度的4-BPT處理卵巢癌細胞后，進行SA-β-gal染色，SA-β-gal染色的陽性細胞呈綠色，綠色程度和面積表明細胞衰老的程度。

圖2中體外SA-β-gal染色實驗結果顯示，相對于對照組，實驗組細胞具有明顯的衰老特征，并且這一特征呈濃度依賴性。

圖3中的體外SA-β-gal染色實驗結果顯示，隨著濃度的升高，綠色的程度和面積都有所增加。說明4-BPT能夠誘導卵巢癌SKOV3細胞衰老，并且隨4-BPT濃度增加而顯著。

圖4中的體外SA-β-gal染色實驗結果顯示，人成纖維細胞IMR90對4-BPT不敏感，細胞呈綠色的程度及面積都較低，無明顯的細胞衰老特征。

結果表明，化合物4-BPT能夠?qū)z測的A2780和SKOV3細胞具有較明顯的誘導衰老作用，而對人正常成纖維IMR90細胞則無明顯作用。SA-β-gal實驗在細胞水平上證明，化合物4-BPT可以特異性針對卵巢癌細胞發(fā)揮誘導卵巢癌衰老作用。

實施例3. 細胞增殖曲線檢測細胞生長抑制。

第一步：在底面直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)卵巢癌A2780、SKOV3細胞，傳代良好后，棄原培養(yǎng)液，用2 mLPBS清洗，0.5 mL胰酶消化，加2 mL含10%胎牛血清，青霉素及鏈霉素DMEM培養(yǎng)基吹打混勻，取200 g溶液離心5 min，棄上清，加含10%胎牛血清，青霉素及鏈霉素DMEM培養(yǎng)基吹打混勻，取0.5 mL到EP管，用槍吸取10 μL于細胞計數(shù)板上計數(shù)或稀釋相應倍數(shù)后計數(shù)。每孔種2×10⁴個細胞，一共3組孔，將細胞種到6孔板中,每孔吹打混勻。放入二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（Thermo scientific，37 ℃）靜止培養(yǎng)24 h，使其貼壁。

第二步：將4-BPT按不同比例稀釋于DMSO（國際集團化學試劑有限公司)中，分別加作用濃度為0 μM（即為對照組）、40 μM、80 μM的4-BPT溶液到6孔板中，保持每孔所加體積等量，放入二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃）靜止培養(yǎng)48 h。

第三步：將6孔板中的細胞重新消化下來，用血球計數(shù)器計數(shù)后，將其全部種回6孔板，重復第一、二兩步操作3次，繪出不同化合物作用濃度下的生長曲線。

實驗結果顯示：如圖5所示，圖中表明，對照組的細胞生長呈指數(shù)方式，處理組的生長則相對緩慢，隨著4-BPT濃度的增加，這種趨勢越明顯，說明4-BPT能夠有效的抑制卵巢癌細胞A2780的生長。

實施例4. 流式細胞儀檢測細胞周期

第一步：底面直徑6 cm培養(yǎng)皿的卵巢癌A2780細胞培養(yǎng)和傳代良好后，棄原培養(yǎng)液，用2 mLPBS清洗，0.5 mL胰酶消化，加2 mL含10 % 胎牛血清及青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基吹打混勻，200 g離心5 min，棄上清，加含10 % 胎牛血清及青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基吹打混勻，取0.5 mL到EP管，用槍吸取10 μL于細胞計數(shù)板上計數(shù)或稀釋相應倍數(shù)后計數(shù)。取底面直徑6 cm的細胞培養(yǎng)皿，每碟種1×10⁵個細胞,共2碟。放入 CO₂恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃）靜止培養(yǎng)24 h，使其貼壁。

第二步：分別取0 μM（即為對照組）、80 μM化合物4-BPT劑量加入實驗組細胞中，對照組加入等體積的DMSO和培養(yǎng)基。放入CO₂恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃）靜止培養(yǎng)96 h。

第三步：將培養(yǎng)96 h后的細胞取出，吸去培養(yǎng)基，分別取0.5 mL的PBS清洗，吸去PBS，加0.5 mL胰酶消化，加0.5 mL相應培養(yǎng)基終止消化，延孔壁吹洗，轉至EP管，重復用0.5 mL培養(yǎng)基洗一次，減少細胞殘余。轉至4 ℃冰盒，并在4 ℃冷凍離心機中300 g離心5 min，吸去上清，刮勻。每管加300 μL 4℃預冷的PBS，混勻，4 ℃冷凍離心機中300 g離心5 min，吸去上清，刮勻。每管滴加0.5 mL-20 ℃預冷的70%的乙醇，混勻，放入4 ℃冰箱保存至少24 h。

第四步：從4 ℃取出待處理的細胞，4 ℃冷凍離心機中500 g離心5 min，棄上清，刮勻。每管加300 μL 4 ℃預冷的PBS,混勻，4 ℃冷凍離心機中500 g離心5 min。棄上清，刮勻，每管加500 μL PI染色液（485 μL PBS+10 μL 1 mg/mL的PI+5 μL 1 mg/mL的RNASE），吹打4-5次混勻，轉至周期檢測管，避光中37 ℃水浴鍋中孵育1 h。流式細胞儀檢測細胞周期。

實驗結果顯示：如圖6所示，相對于對照組，卵巢癌細胞A2780在80 μM的化合物作用濃度下，處于G1期的數(shù)量明顯增多，S期明顯受阻，說明該細胞的細胞周期產(chǎn)生阻滯，細胞進入衰老狀態(tài)。

實施例5. 流式細胞檢測細胞凋亡檢測

第一步、第二步同實施例4。

第三步：將A2780細胞從6孔板消化離心，收集所有的上清液。轉至4 ℃冰盒，并在4 ℃冷凍離心機中300 g離心5 min，吸去上清，刮勻。將上清離心后的細胞和相應消化下來的細胞全部合并，用0.5 mL 預冷PBS洗滌，4 ℃冷凍離心機中300 g離心5 min，吸去上清，刮勻。每管加500 μL 4 ℃預冷的PBS，混勻，重復上述操作。加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI Staining Solution，輕輕搖勻(細胞凋亡試劑盒，上海翊圣生物科技有限公司)。避光，室溫反應10 min，加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻，1 h內(nèi)送流式細胞儀檢測。

實驗結果如圖7顯示，化合物4-BPT對卵巢癌A2780細胞無誘導凋亡作用。說明化合物引起細胞衰老的原因主要還是細胞周期的改變。