本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，具體涉及化合物FPTHQ（4-(4-fluorophenyl)-2-phenyl-5,6,7,8-tetrahydroquinoline，4-（4-氟苯基）-2-苯基-5,6,7,8-四氫喹啉，簡稱FPTHQ）在制備治療卵巢癌的藥物中的應用。

背景技術：

卵巢惡性腫瘤是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，是僅次于宮頸癌和子宮內膜癌列居第三位的惡性疾病。卵巢癌主要分為上皮性、粘液型、子宮內膜型、透明細胞型和未分化型卵巢癌。其中上皮性腫瘤占原發(fā)性卵巢腫瘤的70%左右，其惡性類型占卵巢惡性腫瘤的85%-90%。由于卵巢癌病灶深居盆骨，早期臨床癥狀極不明顯，很難被發(fā)現(xiàn)，患者往往一經發(fā)現(xiàn)就已經屬于晚期，這極大的威脅著婦女的生命。目前，治療卵巢癌的藥物主要有紫杉醇、鉑類、貝伐單抗、曲貝替定等，這些藥物的單獨用藥和聯(lián)合用藥并沒有有效的改善患者的生存期和總生存期，同時具有較強的副作用。目前的標準治療方案為手術配以化療，這種治療方案對早期患者比較受益，但對于晚期患者而言，并沒有多大的幫助盡管很多病人都對手術和由鉑劑及紫杉醇組成的標準化療有響應，但大多數(shù)病人都會經歷復發(fā)并最終對多種化療試劑產生抗性而無藥可治。到目前為止卵巢癌仍缺乏有效的治療方法和手段。

細胞衰老是一個不可逆的細胞周期停滯的生理過程，在抑制腫瘤進程以及治療腫瘤方面具有重要作用。正常細胞在某種致瘤因素的刺激下，失去自身生長的限制，從而具有無限增殖的能力而喪失了衰老的功能，形成腫瘤。因此，通過誘導癌細胞衰老來穩(wěn)定的抑制癌細胞的生長，也許能夠作為一種治療腫瘤的方式。傳統(tǒng)腫瘤的治療方式如放療、化療等，主要是通過使腫瘤細胞死亡而實現(xiàn)治療目標，其優(yōu)勢在于具有較好的近期療效，即腫瘤包塊的迅速縮小，但由于轉移與復發(fā)等不良情況的發(fā)生，使得傳統(tǒng)腫瘤治療模式的療效并不盡如人意。與此相應，衰老的腫瘤細胞并不立即死亡，甚至可以在較長的時間內仍具有存活力，但卻失去了增殖與轉移的能力，這樣的特性使得以細胞衰老為靶標的治療在縮小腫瘤方面的作用并不是很強，但卻可以帶瘤生存的方式顯著延長腫瘤患者的生存時間，而且不良反應沒有傳統(tǒng)化療與放療那么大。因此，恢復腫瘤細胞的衰老通路，誘導腫瘤細胞的衰老是一個很有研究前景的新的腫瘤終極治療靶標，尋找能夠特異性誘導癌細胞衰老的藥物來治療癌癥也是眾多研究者努力的方向。

本發(fā)明所涉及的化合物FPTHQ是一種吡啶類衍生物，已于2016年報道于Tetrahedron雜志上。吡啶類衍生物的研究應用范圍十分廣泛，主要運用于醫(yī)藥、農藥、飼料、染料等領域，其中在醫(yī)藥領域內的應用十分重要，如結核病藥異煙肼，中樞興奮藥尼可剎米等。本發(fā)明所涉及的化合物FPTHQ為白色固體，熔點為131-132 ℃，呈弱堿性。本發(fā)明所述化合物FPTHQ在抗卵巢癌活性方面的相關生物學效應研究，在國內外尚未見相關報道。經研究表明，F(xiàn)PTHQ能夠顯著的抑制卵巢癌細胞系A2780和SKOV3的生長。細胞周期檢測的結果表明，F(xiàn)PTHQ能夠影響卵巢癌細胞的細胞周期，使其阻滯在G1期，發(fā)生細胞周期停滯。衰老相關的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色結果表明，F(xiàn)PTHQ處理后的細胞β-半乳糖苷酶的活性明顯增強，而正常的人成纖維細胞無明顯變化。這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)PTHQ能夠特異性的誘導卵巢癌細胞衰老，而對正常的人成纖維細胞沒有作用。因此，本發(fā)明涉及的吡啶衍生物在抗卵巢癌活性方面具有非常大的作用，并且在今后卵巢癌的治療方面具有很大的潛在價值。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的缺陷，為更好的治愈或為治療卵巢癌提供一種可行的選擇，本發(fā)明的發(fā)明人經過大量創(chuàng)造性的勞動，篩選出一種化合物FPTHQ，在抗卵巢癌活性方面具有很好的抑制作用，進而為治療卵巢癌或誘導卵巢癌細胞的凋亡提供了新的療法或手段。

本發(fā)明首先提供一種吡啶類衍生物在制備治療癌癥藥物中的應用，其中所述的吡啶類衍生物為4-(4-fluorophenyl)-2-phenyl-5,6,7,8-tetrahydroquinoline，4-（4-氟苯基）-2-苯基-5,6,7,8-四氫喹啉，簡稱FPTHQ，其化學結構式如下：

。

其中，上面所述的癌癥為卵巢癌；

所述應用為抑制癌細胞生長或促進癌細胞衰老；具體的，所述的應用為阻滯癌細胞周期。

本發(fā)明還提供一種治療癌癥的藥物，所述藥物中的有效成分為吡啶類衍生物為4-(4-fluorophenyl)-2-phenyl-5,6,7,8-tetrahydroquinoline，4-（4-氟苯基）-2-苯基-5,6,7,8-四氫喹啉，簡稱FPTHQ。

其中所述的藥物還包括藥學上可接受的載體或輔料，所述載體和/或輔料為本領域技術人員所知曉，在此不做贅述。

所述的藥物為抑制癌細胞生長或促進癌細胞衰老的藥物；具體的，所述的藥物為阻滯癌細胞周期的藥物。

本發(fā)明通過對一類已報道的吡啶類化合物進行生物學活性篩選，篩選出候選化合物，并研究其在抗卵巢癌活性方面的相關作用,實驗所用細胞為卵巢癌SKOV3、A2780細胞和人正常成纖維IMR90細胞。通過篩選，得到化合物FPTHQ。進一步通過檢測細胞生長，細胞周期以及衰老相關的β-半乳糖苷酶活性來測定其誘導衰老的能力，從而確定該化合物在抗卵巢癌方面活性非常顯著。

結果表明：細胞增殖實驗驗證了該化合物對卵巢癌細胞A2780和SKOV3的生長抑制，這種作用呈濃度依賴性；細胞周期檢測結果表明，該化合物可使大量細胞停留在G1期，使其細胞周期停滯。體外SA-β-gal染色實驗證實該化合物能夠誘導卵巢癌A2780和SKOV3細胞衰老，但在同等實驗條件下，不能誘導正常人成纖維IMR90細胞衰老；以上研究得出化合物FPTHQ具有明顯的誘導卵巢癌細胞衰老的活性，在對抗卵巢癌的研究和治療方面具有非常大的潛質，可以進一步對其進行治療卵巢癌藥物的制備。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明所涉及的化合物可以選擇性促進卵巢癌細胞的衰老，并且對正常細胞影響較小或沒有影響。這相較于傳統(tǒng)的抗卵巢癌藥物所引起的極大的毒副作用，具有十分明顯的優(yōu)勢。本發(fā)明所涉及的化合物可以對卵巢癌細胞的細胞周期進行阻滯，使細胞周期S期受阻，細胞停滯于G1期，從而誘導卵巢癌細胞進入細胞衰老狀態(tài)。本發(fā)明所涉及的化合物具有明顯抗卵巢癌活性，在制備抗卵巢癌藥物和治療卵巢癌方面有很大的潛力，為今后的研究應用提供新的選擇。

附圖說明

圖1. 4-FPTHQ的合成示意圖。

圖2. A2780細胞增殖曲線圖，圖中**代表p值小于0.01，具有統(tǒng)計學意義。

圖3. SKOV3細胞增殖曲線圖，圖中**代表p值小于0.01， ***代表p值小于0.001，具有統(tǒng)計學意義。

圖4. 不同作用濃度的FPTHQ處理卵巢癌細胞細胞系A2780 48h后的細胞周期統(tǒng)計圖（上圖）和流式細胞儀檢測圖（下圖，作用濃度從左至右依次為0μM、20μM、60μM）。圖中*代表p值小于0.05， **代表p值小于0.01，具有統(tǒng)計學意義。

圖5.不同作用濃度的FPTHQ處理卵巢癌細胞系SKOV3 48h后的細胞凋亡統(tǒng)計圖（上圖）及流式細胞儀檢測圖（下圖，作用濃度從左至右依次為0μM、20μM、60μM）。圖中#代表p值大于0.05，無統(tǒng)計學意義， *代表p值小于0.05，具有統(tǒng)計學意義。

圖6. A2780細胞系SA-β-gal染色圖。

圖7. A2780細胞系 SA-β-gal染色陽性細胞統(tǒng)計圖，圖中**代表p值小于0.05， ***代表p值小于0.01，具有統(tǒng)計學意義。

圖8. SKOV3細胞系 SA-β-gal染色圖，SA-β-gal染色的陽性細胞呈綠色，綠色程度和面積表明細胞衰老的程度。

圖9. SKOV3 SA-β-gal染色陽性細胞統(tǒng)計圖，圖中**代表p值小于0.05， ***代表p值小于0.01，具有統(tǒng)計學意義。

圖10. IMR90細胞系 SA-β-gal染色圖。

圖11. IMR90細胞系 SA-β-gal染色陽性細胞統(tǒng)計圖，圖中#代表p值大于0.05，無統(tǒng)計學意義， *代表p值小于0.05，具有統(tǒng)計學意義。

具體實施方式

以下通過實施例對本發(fā)明做進一步詳細的說明，下述非限制性實施例不以任何方式限制本發(fā)明。下述實施例中，如無特殊說明，所使用的實驗方法均為常規(guī)方法，所用材料、試劑等均可從化學試劑公司購買。

本發(fā)明所涉及的具體化合物4-FPTHQ的制備方法請參見Chunyin Zhu*, Benwei Bi, Ya Ding, Te Zhang and Qiu-Yun Chen.Iodine-catalyzed aerobic oxidative formal [4+ 2] annulation for the construction of polyfunctionalized pyridines[J]. Tetrahedron, 2015, 71(49): 9251-9257.

實施例1. 化合物4-FPTHQ的制備方法

在10 mL單口燒瓶中，將4-氟查爾酮（0.5mM）溶于甲醇中（1.5mL），再加入環(huán)己酮（0.6mM）、碘（0.1mM）、吡咯烷（0.1mM）和乙酸銨（0.6mM），反應在30 ℃條件下，氧氣的氛圍中攪拌，經過TLC板監(jiān)測反應，8 h反應完全，再用乙酸乙酯和水萃取三次，合并有機相，再用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓旋轉蒸出溶劑，得到混合物，再用硅膠柱層析，得到純的吡啶衍生物FPTHQ。

實施例2. 細胞的培養(yǎng)和傳代

卵巢癌A2780、SKOV3細胞(購于American type culture collection)體外分別培養(yǎng)于含10% 胎牛血清，100U/mL青霉素及100μg/mL鏈霉素的DMEM(購于Life Technologies公司，美國)培養(yǎng)基和含10% 胎牛血清及100U/mL青霉素及100μg/mL鏈霉素的RMPI-1640(購于Life Technologies公司，美國)培養(yǎng)基中；人成纖維IMR90細胞(購于American type culture collection)培養(yǎng)于含10% 胎牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素的DMEM(購于Life Technologies公司，美國)培養(yǎng)基中。每天定期觀察細胞生長狀態(tài)，待長滿培養(yǎng)皿時及時傳代（一般在貼壁細胞表面積占80% 及以上時傳代）。當細胞培養(yǎng)和傳代效果良好時進行下一步實驗。

實施例3. 細胞生長曲線檢測細胞生長抑制

第一步：在底面直徑為6cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)卵巢癌A2780、SKOV3細胞，傳代良好后，棄原培養(yǎng)液，用2 mL PBS清洗，0.5 mL胰酶消化，加2 mL含10%胎牛血清，100U/mL 青霉素及100 μg/mL鏈霉素DMEM(或RMPI-1640)培養(yǎng)基吹打混勻，取200 g溶液離心5 min，棄上清，加含10%胎牛血清，100U/mL 青霉素及100 μg/mL鏈霉素DMEM(或RMPI-1640)培養(yǎng)基吹打混勻，取0.5 mL到EP管，用槍吸取10 μL于細胞計數(shù)板上計數(shù)或稀釋相應倍數(shù)后計數(shù)。每孔種5×10⁴個細胞，一共3組孔，每組3個復孔，將細胞種到6孔板中,每孔吹打混勻。放入二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（Thermo scientific，37℃）靜止培養(yǎng)12h，使其貼壁。

第二步：將FPTHQ按不同比例稀釋于DMSO（國際集團化學試劑有限公司)中，將稀釋后的作用濃度為0μM、40μM、60μM或者0μM、60μM 、120μM的FPTHQ溶液加入6孔板中，保持每孔所加體積等量，放入二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（37℃）靜止培養(yǎng)36h，以不加FPTHQ為對照組。

第三步：將6孔板中的細胞重新消化下來，用血球計數(shù)器計數(shù)后，將其全部種回6孔板，重復第一、二兩步操作3次，繪出不同化合物作用濃度下的細胞生長曲線。

如圖2和圖3，隨著時間的延長，F(xiàn)PTHQ處理組與對照組的細胞數(shù)的差距明顯增大，說明處理組的細胞生長受到抑制，并且隨著FPTHQ濃度的增加，這種趨勢就越明顯。實驗結果表明FPTHQ能夠有效的抑制卵巢癌細胞A2780以及SKOV3的生長。

實施例4.流式細胞儀檢測細胞周期

第一步：取培養(yǎng)和傳代良好得底面直徑6cm培養(yǎng)皿的卵巢癌A2780和SKOV3細胞后，棄原培養(yǎng)液，用2 mLPBS清洗，0.5 mL胰酶消化，加2 mL含10% 胎牛血清，100U/mL青霉素及100μg/mL鏈霉素的DMEM(或RMPI-1640)培養(yǎng)基吹打混勻，200 g離心5 min，棄上清，加含10% 胎牛血清100U/mL青霉素及100μg/mL鏈霉素的DMEM(或RMPI-1640)培養(yǎng)基吹打混勻，取0.5 mL到EP管，用槍吸取10 μL于細胞計數(shù)板上計數(shù)或稀釋相應倍數(shù)后計數(shù)。取底面直徑6cm的培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿種4×10⁵細胞，放入二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（37℃）靜止培養(yǎng)24h，使其貼壁。

第二步：將FPTHQ按不同比例稀釋于DMSO中，分別加作用濃度為0μM、20μM、60μM的FPTHQ溶液，加到上面所述的培養(yǎng)皿中，放入二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（37℃）靜止培養(yǎng)48h。

第三步：將培養(yǎng)48h后的細胞取出，吸去培養(yǎng)基，分別取2mL的PBS清洗，吸去PBS，加0.5mL胰酶消化，加0.5mL相應培養(yǎng)基終止消化，延孔壁吹洗，轉至EP管，重復用0.5mL培養(yǎng)基洗一次，減少細胞殘余。轉至4℃冰盒，并在4℃冷凍離心機中300g離心5min，吸去上清，刮勻。每管加300μL 4℃預冷的PBS，混勻，4℃冷凍離心機中300g離心5min，吸去上清，刮勻。每管加0.5mL-20℃預冷的70%的乙醇，混勻，放入4℃冰箱保存至少24h。

第四步：從4℃取出待處理的細胞，4℃冷凍離心機中300g離心5min，棄上清，刮勻。每管加300μL4℃預冷的PBS，混勻，4℃冷凍離心機中300g離心5min。棄上清，刮勻，每管加500μL PI染色液（485Μlpbs+10μL1mg/mL的PI+5μL1mg/mL的RNASE），吹打4-5次混勻，轉至周期檢測管，避光中37℃水浴鍋中孵育1h。流式細胞儀檢測細胞周期。

如圖4和圖5所示，相對于未處理組組，實驗組S期的細胞比例明顯降低，而G1期的細胞比例在升高。60μM濃度條件下，A2780細胞的G1期比例增長了18.49%。SKOV3細胞的G1期比例增長了10.54%。實驗結果顯示：相比于對照組，實驗組的細胞周期明顯受到阻滯，并且細胞停滯于G1期。

實施例5. SA-β-gal檢測誘導細胞衰老

第一步：取圓形玻片浸泡于95%的乙醇中，點燃酒精燈灼燒玻片，將玻片放入24孔板中，靜置放涼備用。底面直徑6cm培養(yǎng)皿的卵巢癌A2780、SKOV3細胞和人成纖維IMR90細胞培養(yǎng)和傳代良好后，棄原培養(yǎng)液，用2 mL PBS清洗，0.5 mL胰酶消化，加2 mL含10% 胎牛血清00U/mL青霉素及100μg/mL鏈霉素的DMEM(或RMPI-1640)培養(yǎng)基吹打混勻，200 g離心5 min，棄上清，加含10% 胎牛血清及100U/mL青霉素及100μg/mL鏈霉素的DMEM(或RMPI-1640)培養(yǎng)基吹打混勻，取0.5 ml到EP管，用槍吸取10 μL于細胞計數(shù)板上計數(shù)或稀釋相應倍數(shù)后計數(shù)。A2780、SKOV3和IMR90每孔種4×10⁴個細胞，分別將細胞種到24孔板中，吹打混勻。放入二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（Thermo scientific，37℃）靜止培養(yǎng)24h，使其貼壁。

第二步：將FPTHQ按不同比例稀釋于DMSO中，分別加作用濃度為0μM、20μM、60μM、180μM的FPTHQ溶液到24孔板中，保持每孔所加體積等量，放入二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（37℃）靜止培養(yǎng)48h。

第三步：將培養(yǎng)48h后的細胞取出，吸去培養(yǎng)基，加入0.5 mL的PBS清洗玻片，輕輕晃動，吸去PBS，重復三次。加入0.5mL的固定液（1 mL =54μL甲醛+80μL 2.5%戊二醛+866μL PBS），室溫下固定5min。吸去固定液，再用PBS清洗3次。每孔加入0.5mL染色液（1mL =798μL H₂O+30μL 5M NaCl+2μL 1M MgCl+10μL 0.5M K₃Fe(CN)₆+10μL 0.5M K₄Fe(CN)₆+100μL 0.4M Na₂HPO₄+50μL 20mg/mL X-gal），置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育10h左右。取出，蒸餾水洗2遍，棄去。無水乙醇洗2遍，水洗三遍。取載玻片，滴5μL水于載玻片上，取出玻片，將其倒扣于水上，切勿產生氣泡，用指甲油將四周固封好。待指甲油干掉后，在玻片上加一滴水，用真空泵洗掉。在400倍倒置顯微鏡下拍照。

如圖6和圖8所示，利用SA-β-gal染色方法來檢測細胞衰老的情況。相對于未處理組，實驗組細胞明顯染成了綠色，而且綠色的程度隨著濃度的增加而增強，綠色程度和面積表明細胞衰老的程度。如圖7和圖9所示，隨著濃度的增加，SA-β-gal陽性細胞數(shù)顯著增加，陽性細胞數(shù)目越多，說明細胞衰老程度越高。如圖10和圖11所示，化合物FPTHQ處理，對人正常成纖維IMR90細胞則無明顯作用。實驗結果表明化合物FPTHQ可以特異性誘導卵巢癌細胞衰老，而對正常的人成纖維細胞沒有作用。