專利名稱：一種腎靶向藥物載體及與其形成的前藥、制法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬制藥領(lǐng)域，特別涉及低分子量殼聚糖或其衍生物這一具有良好腎靶向效率的藥物載體，及其作為藥物載體形成的新型腎靶向前體藥物和制備方法與應用。
背景技術(shù)：
腎臟是人體的重要器官之一。如果腎臟生理功能發(fā)生偏差，常導致嚴重疾病，腎臟有關(guān)的疾病主要有各種感染炎癥、糖尿病、高血壓、腫瘤等，例如急、慢性腎炎，急、慢性腎功能衰竭，尿路感染，腎癌，腎母細胞瘤，腎盂腫瘤等。近年來，晚期腎疾病的發(fā)生和流行正在逐年遞增，據(jù)統(tǒng)計，1989年美國患有腎臟晚期疾病的患者有18.7萬人，而到了1998年又有將近40萬人患病。這些患者不得不依靠透析或腎臟移植來維持生命，但是平均每年的死亡率還是高達20％，與某些惡性腫瘤的死亡率相當。另外又有大約10倍此數(shù)目的人群由于心血管系統(tǒng)的疾病而患有慢性腎功能衰竭。其中，糖尿病和高血壓是導致腎臟疾病的主要原因，大約30％的糖尿病晚期患者都會出現(xiàn)腎功能衰竭。因為糖尿病可導致腎小球硬化、腎動脈硬化及腎盂腎炎等病變，晚期則可致腎功能衰竭。
腎臟疾病需要長期服藥。然而所用藥物均存在不同程度的腎外效應，靶向性不強。另外，很多藥物在到達腎臟前會被其他器官(如肝等)降解；即使藥物能夠到達腎臟，也不一定能作用于靶細胞；當腎小球濾過和腎小管排泄等功能異常時，藥物的傳遞亦會受到影響。因此，藥物的腎臟靶向很有必要，用以增加藥物的安全性和有效性。為了實現(xiàn)給藥的腎臟靶向性，至今，人們已經(jīng)對腎靶向給藥系統(tǒng)進行了深入地研究，采用了低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)(LMWP)、微粒、糖基復合物等藥物轉(zhuǎn)運載體，前體藥物和抗體以及基因治療等多種手段，以最終實現(xiàn)腎臟靶向給藥的目的。
在現(xiàn)已研究的各種腎靶向載體中，LMWP較為理想。分子量低于30,000道爾頓的LMWP可被腎小球自由濾過并通過近端小管迅速吸收。LMWP被近端小管細胞內(nèi)吞后，經(jīng)內(nèi)吞體遷移至溶酶體。在溶酶體內(nèi)，LMWP被分解成小肽和單個氨基酸。研究表明約占注射劑量80％的LMWP(如溶菌酶、細胞色素c、抑肽酶等)最終被腎攝取。圍繞這方面的專利較多，如US6562371，US2003211142，JP2001055343。Suzuki等人研究了烷基糖苷作為腎靶向載體的潛力。他們采用不同糖分子作探針，通過不同長度的烷基間隔基將不同的糖分子和模型藥物(精氨酸抗利尿激素，AVP)結(jié)合，研究了大鼠靜注AVP-糖基復合物后的組織攝取情況，發(fā)現(xiàn)組織分布特性很大程度上取決于結(jié)合物中的糖分子葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)和2d-Glc-C8-AVP都顯示出良好的腎臟特異性分布。Glc-S-C8-衍生物具有明顯的腎靶向性，提示Glc-S-C8-是腎靶向的合適載體。相關(guān)專利是EP0953357。據(jù)Journal of Controlled Release.95(2004)229-237報道Yamamoto Y等人采用自由基聚合反應制備乙烯基吡咯烷酮/二甲基馬來酸共聚物(PVD)，并考察分子量和電荷對PVD在小鼠體內(nèi)分布的影響。分子量為6000-8000道爾頓的PVD有很好的腎靶向性，給藥劑量80％左右的PVD被腎攝取。還有研究表明，由于大量的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶能夠特異性濃集于腎近曲小管的刷狀緣，這種酶可以將氨基酸多肽的谷氨?；苌镛D(zhuǎn)化為γ-谷氨酰氨基酸，然后水解為谷氨酸，因此腎臟在氨基酸和肽的谷氨?；苌锏臄z取和代謝中具有很高的活性，因此可以將γ-谷氨酰氨基酸衍生物作為腎靶向前藥。
可見，目前在研究腎靶向藥物載體這一領(lǐng)域中，國內(nèi)仍處于研究較少的階段，相關(guān)的專利未見；國際上的研究也主要是放在主動靶向這一方面，也希望能尋找更多的效果優(yōu)良的腎靶向藥物載體，能更好地治療人類的腎臟疾病，服務于人類。
目前，關(guān)于殼聚糖這種聚合物的相關(guān)專利很多專利CN1698899A中公開的殼聚糖藥物載體，是將高分子殼聚糖作為藥物載體，使藥物到達控制釋放的作用；專利CN1554267A中公開了一種制備水溶性殼聚糖的制備方法；專利CN1743008A中公開了用殼聚糖來包裹藥物，形成納米粒，被動靶向到肝臟，等等。但是，都沒有提出低分子量的殼聚糖可以作為一種良好的腎靶向藥物載體以及前體藥物的制備方法和應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是在以上這些研究的基礎(chǔ)上，通過篩選大量的藥物載體后，所得低分子量的殼聚糖或其衍生物，都具有良好的腎靶向性。殼聚糖來源于蝦蟹的外殼，其結(jié)構(gòu)和纖維素相似，是自然界含量極其豐富的一種多糖。殼聚糖價廉、易得，具有優(yōu)異的生物可降解性，生物相容性，因而其制備的低分子量的殼聚糖可以作為一種理想的腎靶向藥物載體。通過使用低分子量的殼聚糖作為抗腫瘤藥物，或糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑的藥物載體，可以特異性的將這些藥物運送至腎臟，在其他組織的分布很少，在腎臟酶的作用下，釋放出藥物，起到局部抗腫瘤或局部免疫抑制的作用，降低抗腫瘤藥物，或糖皮質(zhì)激素所引起的毒副作用，增強療效。
本發(fā)明的目的在于公開一種新的具有良好腎靶向效率的藥物載體，并通過化學鍵與抗腫瘤藥物，或糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑相連，形成前體藥物及其制劑，使藥物能夠被靶向到腎，降低藥物在全身其它部位的濃度和副作用，減低藥物劑量，增加療效和產(chǎn)生局部免疫抑制效果。
分子量在1,000-100,000道爾頓的低分子量殼聚糖(LMWC)就有良好的腎靶向性，將其靜脈注射入小鼠體內(nèi)后，15分鐘內(nèi)就快速累積到腎臟，其他組織只有少量的LMWC，注射后，LMWC逐步被體內(nèi)的酶所降解，從體內(nèi)排出。
LMWC是一種適宜的腎靶向載體①載體有可供藥物連接的功能基團；②LMWC在腎臟中特異性蓄積；③LMWC的理化性質(zhì)決定被連接藥物的理化性質(zhì)；④藥物-LMWC結(jié)合物在循環(huán)中穩(wěn)定，但當?shù)竭_腎臟后，在酶的作用下，活性藥物被釋放出來。⑤LMWC價廉、易得，具有優(yōu)異的生物相容性，生物可降解性，不會造成藥物載體在體內(nèi)的蓄積。LMWC是腎靶向藥物載體之一。
LMWC可通過多種方式與藥物連接。藥物可通過載體的糖單元上的氨基和羥基形成化學鍵與LMWC直接相連。通過酶水解和化學水解，母體藥物從藥物-間隔基-LMWC或藥物-LMWC結(jié)合物中釋放。
本發(fā)明的技術(shù)方案為按照本發(fā)明的一個方面，公開一種腎靶向藥物載體低分子量殼聚糖或其衍生物，其作為藥物載體，可以將與其共價結(jié)合的藥物靶向到腎臟，是一種新的腎靶向藥物載體；圖1給出了其結(jié)構(gòu)式。
式中R可以是氫原子(-H)、也可以是烷基(-CH3、-C2H5等)、還可以是羧甲基(-CH2COOH)；m、n為正整數(shù)低分子量殼聚糖或其衍生物的分子量在1,000-100,000之間。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，低分子量殼聚糖或其衍生物是脫乙酰度在40％-60％之間的具有良好水溶性的殼聚糖。脫乙酰度是指殼聚糖分子中，糖單元上的自由-NH2的含量，通過脫乙?；奶菃卧獢?shù)占殼聚糖分子中總的糖單元數(shù)的百分數(shù)表示。其制備方法如下1)將殼聚糖溶于0.3-3％(w/v)的鹽酸水溶液中，過濾，配制成2-10％(w/v)的殼聚糖鹽酸溶液，完全溶解后，加入過氧化氫，使其濃度為0.1-1.5％(w/v)，在40-70℃攪拌反應2小時。用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為13-14，4000轉(zhuǎn)/分離心，得到低分子量殼聚糖沉淀，水洗至中性后，真空干燥。
2)將干燥產(chǎn)品溶于0.5-10％(v/v)的醋酸溶液中，配制成0.1-0.9％(w/v)的殼聚糖醋酸溶液，完全溶解后，加入醋酸酐，其摩爾數(shù)為殼聚糖中氨基摩爾數(shù)的8-12倍，常溫下反應3-8小時后，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為13-14，加入相當于反應液1.5-5倍體積的丙酮沉淀產(chǎn)物，4000轉(zhuǎn)/分離心后，得沉淀，沉淀用1mol/L的氫氧化鉀的甲醇液處理5小時以上，用甲醇洗滌沉淀到中性。
3)用水溶解上述沉淀，并用凝膠滲透色譜(GPC)進一步純化。純化產(chǎn)物經(jīng)冷凍干燥后即得脫乙酰度在40％-60％之間的水溶性的殼聚糖。
通式(I)(見圖1)的低分子量殼聚糖或其衍生物與抗腫瘤藥物或糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑結(jié)合形成的前體藥物 其中LMWC為低分子量殼聚糖或其衍生物，分子量在1,000-100,000之間。
n是一整數(shù)，最大不超過LMWC上的每個糖單元上的活性官能團數(shù)；L為連接基團，選自酯基、碳酸酯基、酰胺基、酰胺酯基、醚基、胺基、氨基酸酯基、氨基酸酰胺組成的組；D為抗腫瘤藥物，或糖皮質(zhì)激素，或免疫抑制劑；其特征在于藥物通過化學鍵與低分子量殼聚糖或其衍生物的糖單元中的氨基、羥基共價連接。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述的前體藥物中，與藥物載體形成結(jié)合的藥物有抗腫瘤藥物或糖皮質(zhì)激素，或免疫抑制劑組成。其中，抗腫瘤藥物選自氟尿嘧啶、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、美法侖、異溶肉瘤素以及它們衍生物組成的組，但不局限于這些所列藥物；糖皮質(zhì)激素選自氫化可的松、可的松、地塞米松、潑尼松、潑尼松龍、地塞米松、倍他米松，以及它們衍生物所組成的組，但不局限于這些所列藥物；免疫抑制劑選自雷公藤內(nèi)酯醇、環(huán)孢素A、他克莫司、雷帕霉素、嗎替麥考酚酯以及它們衍生物所組成的組，但不局限于這些所列藥物。前體藥物中與藥物載體結(jié)合的藥物優(yōu)選雷公藤內(nèi)酯醇或苯丁酸氮芥或潑尼松龍丁二酸單酯。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，得到的前體藥物為雷公藤內(nèi)酯醇丁二酸單酯-殼聚糖結(jié)構(gòu)式(II)或苯丁酸氮芥-殼聚糖結(jié)構(gòu)式(III)或潑尼松龍丁二酸單酯-殼聚糖結(jié)構(gòu)式(IV)(或稱潑尼松龍琥珀酸半酯-殼聚糖)結(jié)構(gòu)如下
其中L代表丁二酸連接基團LMWC代表低分子量殼聚糖或其衍生物，脫乙酰度在40％-60％，分子量在1,000-100,000之間。
n是一整數(shù)，最大不超過LMWC上的每個糖單元上的活性官能團數(shù)。
采用丁二酸為間隔基將藥物分子與低分子量殼聚糖載體連接。對于有羧基的藥物苯丁酸氮芥，可直接采用縮合劑脫水得到前體藥物；對于沒有羧基的藥物雷公藤內(nèi)酯醇，需衍生化生成具有羧基的衍生物；對于已有丁二酸單酯衍生物的藥物潑尼松龍丁二酸單酯，直接采用其丁二酸單酯衍生物。前體藥物制備方法簡述如下(1)將藥物通過選自酯鍵、碳酸酯鍵、酰胺鍵、酰胺酯鍵、醚鍵、胺鍵、氨基酸酯鍵、氨基酸酰胺鍵中的一種與連接基團連接；優(yōu)選藥物雷公藤內(nèi)酯醇需要與丁二酸反應，得到雷公藤內(nèi)酯醇丁二酸單酯；優(yōu)選藥物潑尼松龍丁二酸單酯和苯丁酸氮芥則可以直接與載體連接，無需衍生化。
(2)將藥物或制得的藥物衍生物、N-羥基琥珀酰亞胺溶于乙醇；將低分子量殼聚糖或衍生物溶于蒸餾水或pH值在6.0-8.0MOPS緩沖液(如果低分子量殼聚糖或衍生物不溶于水，就用0.5％-10％的HCl溶液溶液溶解，然后用MOPS緩沖液調(diào)節(jié)近中性)，待完全溶解后，于攪拌條件下將乙醇混合物緩慢滴加到水相，按水∶醇＝1∶9-9∶1(v/v)計算加入，最后加入水溶性碳二亞胺為縮合劑，4℃反應過夜，加入相當于反應液1.5-5倍體積的丙酮沉淀產(chǎn)物，并洗滌沉淀數(shù)次后，干燥得前體藥物。
(3)雷公藤內(nèi)酯醇丁二酸單酯的制備方法雷公藤內(nèi)酯醇和丁二酸酐按1∶1-1∶100的比例溶于有機溶劑二氯甲烷、三氯甲烷或吡啶中，加入催化劑二甲氨基吡啶和三乙胺，室溫反應完全，硅膠柱層析純化。得到雷公藤內(nèi)酯醇丁二酸單酯。
縮合劑可以包括N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)、N-環(huán)己基-N’-三甲胺丙基碳二亞胺碘化鹽(EDCI)、N-環(huán)己基-N’-嗎啡啉乙基碳二亞胺對甲苯磺酸甲酯。
按照本發(fā)明的一個方面，提供了上述前體藥物的藥學上可以接受的制劑。包括片劑、栓劑、軟或硬明膠膠囊劑、溶液劑、混懸劑或氣霧劑、凍干粉針，優(yōu)選凍干粉針劑。其中，所述的前體藥物制劑可以通過口、鼻內(nèi)、直腸、透皮或注射方式進行給藥，優(yōu)選注射方式進行給藥的制劑。其制備方法為本領(lǐng)域人員所共知。
本發(fā)明的另一個目的是提供低分子量殼聚糖和以其作為藥物載體的前體藥物能夠特異地積累腎臟，并能在腎臟特異釋放出原藥的藥學證據(jù)。采用FITC標記的低分子量殼聚糖以及潑尼松龍丁二酸單酯-殼聚糖前體藥物進行了體外和體內(nèi)試驗，以期實現(xiàn)如下目的1、確定低分子量殼聚糖具有良好的腎靶向效率；2、確保前體藥物在到達腎臟之前不會在體內(nèi)降解；3、前體藥物到達腎臟之后能夠被水解釋放出藥物。
1、熒光標記的低分子量殼聚糖的體內(nèi)分布取FITC標記的低分子量殼聚糖通過小鼠尾靜脈注射后，在15分鐘、30分鐘、60分鐘和120分鐘將小鼠處死，取心、肝、脾、肺、腎，稱重，制成勻漿，沉淀蛋白后，用熒光分光光度計測定含量，計算出平均每只小鼠每種組織中殼聚糖的量占總注射量的百分數(shù)，結(jié)果見圖2。說明低分子量殼聚糖具有良好的腎靶向效率。
2、潑尼松龍丁二酸單酯-殼聚糖前體藥物的體外釋藥體外穩(wěn)定性試驗證實，結(jié)合物與大鼠血漿37℃混合，振蕩，高效液相色譜法(HPLC)定時測定血漿中游離藥物的量。結(jié)果證實前體藥物相對穩(wěn)定，2小時釋放出游離藥物的量不及結(jié)合藥物的10％，考慮到前體藥物在血液中能夠迅速被腎臟攝取(＜15分鐘)，避免前體藥物在到達腎臟之前釋放出藥物。而前體藥物在大鼠腎組織勻漿中能迅速釋放藥物，結(jié)果見附圖3。圖中曲線(◆)代表前體藥物在大鼠血漿中的累積釋藥量；曲線(■)代表前體藥物在大鼠腎組織勻漿中的累積釋藥量；曲線(▲)代表前體藥物在空白對照溶液中的累積釋藥量。
3、潑尼松龍丁二酸單酯-殼聚糖前體藥物的體內(nèi)分布評價一種藥物或制劑靶向性的常用辦法是測定在某一時間點各個器官中藥物的相對濃度，即靶向效率。通過小鼠尾靜脈注射前體藥物以及潑尼松龍注射液，定時處死，HPLC法測定，計算出每克臟器中的藥物濃度，發(fā)現(xiàn)注射前體藥物一組中，腎臟中藥物濃度遠遠高于其它臟器；對照組中，潑尼松龍在各個臟器組織的分布比較均衡，腎臟組織的藥物濃度遠遠低于前體藥物組。結(jié)果見圖4。結(jié)果證明潑尼松龍丁二酸單酯-殼聚糖前體藥物具有良好的靶向效率。
綜上所述，低分子量殼聚糖是一種新的具有良好腎靶向效率的藥物載體，模型藥物與其形成的前體藥物，能夠?qū)⑺幬锾禺惖厮瓦_腎臟，活化并釋放出原藥，產(chǎn)生局部的免疫抑制作用，有效降低其毒副作用，增強其療效。


圖1.低分子殼聚糖或其衍生物結(jié)構(gòu)式圖2.熒光標記的殼聚糖在各個臟器組織的分布3.潑尼松龍丁二酸單酯-殼聚糖前體藥物在大鼠血漿，腎組織勻漿和空白對照溶液中的釋藥曲線圖4.潑尼松龍丁二酸單酯-殼聚糖前體藥物以及潑尼松龍對照品在小鼠各個臟器組織中的分布5.分子量為20000道爾頓的水溶性殼聚糖的400兆核磁共振氫譜6.潑尼松龍丁二酸單酯-殼聚糖前體藥物(Mw＝10000)在小鼠各個臟器組織中的分布7.潑尼松龍丁二酸單酯-殼聚糖前體藥物(Mw＝40000)在小鼠各個臟器組織中的分布圖具體實施例下面再結(jié)合實施進一步描述本發(fā)明的藥物載體、前體藥物及其制備方法，它不限制本發(fā)明，本發(fā)明的范圍要求由權(quán)利要求限定。
實施例1低分子量水溶性殼聚糖的制備將3g殼聚糖溶于150ml 0.45％(w/v)的鹽酸水溶液中，待完全溶解后，過濾，加入1.88ml過氧化氫，在40-70℃攪拌反應2小時。用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為13，沉淀析出，4000轉(zhuǎn)/分離心，得到低分子量殼聚糖沉淀，水洗至中性后，真空干燥。
取干燥產(chǎn)品1g溶于170ml 3％的醋酸溶液中，完全溶解后，加入6ml醋酸酐，常溫下攪拌反應4小時后，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為13，加入500ml丙酮，離心后，得沉淀，沉淀用1mol/L的氫氧化鉀的甲醇液處理5小時，用甲醇洗滌沉淀到中性，用水溶解沉淀，并用凝膠滲透色譜(GPC)進一步純化。冷凍干燥后，即得水溶性的殼聚糖。取5mg溶于0.5ml重水(D2O)，用400兆核磁共振測定，見附圖5，脫乙酰度為56％。
實施例2熒光標記殼聚糖的制備及體內(nèi)分布研究精密稱定殼聚糖(Mw＝20000，脫乙酰度為50％左右，水溶性)300mg溶于1mol/L HCl溶液10ml中，再用NaOH調(diào)節(jié)pH值到6.9。加入21mgFITC(異硫氰酸熒光素)，混勻后室溫下反應24小時，透析。將透析后的樣品冷凍干燥(殼聚糖本身就是很好的支架基，所以不必加入其他支架基)。測定熒光素含量為6.56％(w/w)。取昆明種小鼠20只，雄性，重量在25-30克之間，每5只為一組，一共4組。按注射劑量40mg/kg計算，尾靜脈注射FITC-殼聚糖，分別15min，30min，60min，120min處死小鼠，取心、肝、脾、肺、腎，稱重，并制備成組織勻漿，沉淀蛋白后，用熒光分光光度計測定含量，計算出平均每只小鼠每種組織中殼聚糖的量占總注射量的百分數(shù)。結(jié)果見附圖2。結(jié)果證明，低分子量殼聚糖是一種具有良好腎靶向性的藥物載體。
實施例3潑尼松龍丁二酸單酯-殼聚糖前體藥物的制備精密稱定潑尼松龍丁二酸單酯115mg，N-羥基琥珀酰亞胺28.8mg，溶于20ml乙醇；精密稱定殼聚糖100mg(Mw＝10000道爾頓，脫乙酰度為50％左右，水溶性)溶于30ml蒸餾水，待完全溶解后，在攪拌條件下將乙醇混合物緩慢滴加到水相，最后加入120mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽為縮合劑，4℃反應過夜，用150ml丙酮沉淀結(jié)合物并洗滌沉淀數(shù)次后，干燥得前體藥物。密封低溫保存。
精密稱定潑尼松龍丁二酸單酯115mg，N-羥基琥珀酰亞胺28.8mg，溶于20ml乙醇；精密稱定殼聚糖100mg(Mw＝20000道爾頓，水不溶性)，加入10ml 0.5％HCl溶解后，再加入20mlpH＝7.2的MOPS緩沖液，將乙醇混合物緩慢滴加到水相，最后加入120mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽為催化劑，4℃反應過夜，用150ml丙酮沉淀結(jié)合物并洗滌沉淀數(shù)次后，干燥得前體藥物。密封低溫保存。
實施例4潑尼松龍丁二酸單酯-殼聚糖前體藥物體外釋藥理想的靶向前體藥物應能在到達腎臟之前保持穩(wěn)定，在到達靶器官或靶細胞之后又能釋放出活性母藥而發(fā)生作用。本發(fā)明詳細研究了前體藥物在大鼠血漿、大鼠腎組織勻漿和對照溶液中的釋藥行為。研究表明，前體藥物在大鼠血漿中相對穩(wěn)定，在15分鐘內(nèi)釋放的藥物不及總藥的10％，而在大鼠腎組織勻漿中的釋藥速度則相對比較快。這保證前體藥物能夠到達腎又能釋放出母藥。
取SD大鼠經(jīng)肝素抗凝的新鮮血漿5ml，37℃預熱，加入前體藥物使成濃度為200μg/mL，37℃水浴振搖，定時取樣0.2ml，加入甲醇沉淀蛋白質(zhì)，旋渦振搖5分鐘，離心(14000轉(zhuǎn)/分，15分鐘)，高效液相色譜測定上清液游離藥物濃度。
取SD大鼠33％的腎組織勻漿5ml，37℃預熱，加入前體藥物成濃度為200μg/mL，37℃水浴振搖，定時取樣0.2ml，加入甲醇沉淀蛋白質(zhì)，旋渦振搖5分鐘，離心(14000轉(zhuǎn)/分，15分鐘)，高效液相色譜測定上清液游離藥物濃度。發(fā)現(xiàn)前體藥物在大鼠血漿中相對穩(wěn)定，而在腎組織勻漿中能夠迅速釋放出母藥，結(jié)果見附圖3。圖中曲線(◆)代表前體藥物在大鼠血漿中的累積釋藥量；曲線(■)代表前體藥物在大鼠腎組織勻漿中的累積釋藥量；曲線(▲)代表前體藥物在空白對照溶液中的累積釋藥量。
實施例5三種不同分子量，50％左右脫乙酰度的潑尼松龍丁二酸單酯-殼聚糖前體藥物的小鼠體內(nèi)組織分布研究取昆明種小鼠20只，雄性，重量在25-30克之間，隨機每5只為一組，一共4組。按注射劑量28mg/kg計算，尾靜脈注射潑尼松龍藥物。分別15min，30min，60min，120min處死小鼠，取心、肝、脾、肺、腎、血漿，并制備成33％的組織勻漿和50％的血漿，加入甲醇和10％三氯乙酸沉淀蛋白，旋渦振搖5分鐘，離心(14000轉(zhuǎn)/分，15分鐘)，高效液相色譜測定上清液游離藥物濃度，計算出平均每克臟器組織(或每ml血漿)中，潑尼松龍的含量。結(jié)果見附圖4。
另取昆明種小鼠20只，雄性，重量在25-30克之間，隨機每5只為一組，一共4組。尾靜脈注射潑尼松龍丁二酸單酯-殼聚糖前體藥物，殼聚糖的Mw為20000道爾頓，注射劑量按前體藥物中潑尼松龍的量計算，相當于潑尼松龍28mg/kg。分別15min，30min，60min，120min處死小鼠，取心、肝、脾、肺、腎、血漿，并制備成33％的組織勻漿和50％的血漿，加入NaOH水解前體藥物，再加入甲醇和10％三氯乙酸沉淀蛋白，旋渦振搖5分鐘，離心(14000轉(zhuǎn)/分，15分鐘)，高效液相色譜測定上清液游離藥物濃度，計算出平均每克臟器組織(或每ml血漿)中，潑尼松龍的含量。結(jié)果見附圖4。
另取昆明種小鼠20只，雄性，重量在25-30克之間，隨機每5只為一組，一共4組。尾靜脈注射潑尼松龍丁二酸單酯-殼聚糖前體藥物，殼聚糖的Mw為10000道爾頓。注射劑量按前體藥物中潑尼松龍的量計算，相當于潑尼松龍28mg/kg。生物樣品處理方法同上，結(jié)果見附圖6。
另取昆明種小鼠20只，雄性，重量在25-30克之間，隨機每5只為一組，一共4組。尾靜脈注射潑尼松龍丁二酸單酯-殼聚糖前體藥物，殼聚糖的Mw為40000道爾頓。注射劑量按前體藥物中潑尼松龍的量計算，相當于潑尼松龍28mg/kg。生物樣品處理方法同上，結(jié)果見附圖7。
結(jié)果均證明，潑尼松龍丁二酸單酯-殼聚糖前體藥物具有良好的腎靶向效率。
本發(fā)明公開了一種新的具有良好腎靶向效率的藥物載體，并與藥物通過化學鍵制備得到前體藥物，使藥物能夠被靶向到腎，降低藥物在全身其它部位的濃度和副作用，減低藥物劑量，增加療效。
上述任何一種前體藥物及其在臨床可用的制劑形式均可應用在預防和控制腎臟疾病的急慢性腎炎，腎腫瘤，腎移植后的抗排斥反應及其他腎臟疾病中。
本發(fā)明制法簡單，工藝成熟，性能穩(wěn)定，適于大規(guī)模生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.一種腎靶向藥物載體及與其形成的前藥、制法和應用，其特征在于所述的靶向藥物載體，是將與其共價結(jié)合的藥物靶向到腎臟的低分子量殼聚糖或其衍生物，其分子量在1,000-100,000之間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物載體及與其形成的前藥、制法和應用，其特征在于所述的藥物載體是低分子量殼聚糖或其衍生物，優(yōu)選具有良好水溶性的、脫乙酰度在40％-60％之間的殼聚糖。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1的藥物載體及與其形成的前藥、制法和應用中所述的前體藥物以低分子量殼聚糖或其衍生物與抗腫瘤藥物或糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑結(jié)合形成，具有通式(I)所示結(jié)構(gòu) 其中LMWC為低分子量殼聚糖或其衍生物；n是一正整數(shù)，最大不超過LMWC上的每個糖單元上的活性官能團數(shù)；L為連接基團，選自酯基、碳酸酯基、酰胺基、酰胺酯基、醚基、胺基、氨基酸酯基、氨基酸酰胺組成的組；D為抗腫瘤藥物，或糖皮質(zhì)激素，或免疫抑制劑；其特征在于藥物通過化學鍵與低分子量殼聚糖或其衍生物的糖單元中的氨基、羥基共價連接。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的藥物載體及與其形成的前藥、制法和應用，其特征在于所述的前體藥物中，與藥物載體結(jié)合的藥物可以由抗腫瘤藥物或糖皮質(zhì)激素，或免疫抑制劑組成；其中，抗腫瘤藥物選氟尿嘧啶、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、美法侖、異溶肉瘤素以及它們衍生物組成的組；糖皮質(zhì)激素選自氫化可的松、可的松、地塞米松、潑尼松、潑尼松龍、地塞米松、倍他米松，以及它們衍生物所組成的組；免疫抑制劑選自雷公藤內(nèi)酯醇、環(huán)孢素A、他克莫司、雷帕霉素、嗎替麥考酚酯以及它們衍生物所組成的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的藥物載體及與其形成的前藥、制法和應用，其特征在于所述的前體藥物中，與藥物載體結(jié)合的藥物優(yōu)選雷公藤內(nèi)酯醇或苯丁酸氮芥或潑尼松龍丁二酸單酯。
6.根據(jù)權(quán)利要求4-5的藥物載體及與其形成的前藥、制法和應用，其特征在于所述的前體藥物雷公藤內(nèi)酯醇丁二酸單酯-殼聚糖結(jié)構(gòu)式(II)或苯丁酸氮芥-殼聚糖結(jié)構(gòu)式(III)或潑尼松龍丁二酸單酯-殼聚糖結(jié)構(gòu)式(IV)分別具有以下結(jié)構(gòu) 其中L代表丁二酸連接基團LMWC代表低分子量殼聚糖或其衍生物，脫乙酰度在40％-60％，分子量在1,000-100,000之間。n是一正整數(shù)，最大不超過LMWC上的每個糖單元上的活性官能團數(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6的藥物載體及與其形成的前藥、制法和應用，其特征在于所述的前體藥物在藥物學可接受的制劑內(nèi)包括片劑、栓劑、軟或硬明膠膠囊劑、溶液劑、混懸劑或氣霧劑、凍干粉針，優(yōu)選凍干粉針劑；其中，所述的前體藥物制劑可以通過口、鼻內(nèi)、直腸、透皮或注射方式進行給藥，優(yōu)選注射方式進行給藥的制劑。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1、4、5、6的藥物載體及與其形成的前藥、制法和應用中所述的前體藥物的制備方法，其特征在于(1)將藥物通過選自酯基、碳酸酯基、酰胺基、酰胺酯基、醚基、胺基、氨基酸酯基、氨基酸酰胺基中的一種與連接基團連接；優(yōu)選藥物雷公藤內(nèi)酯醇需要與丁二酸反應，得到雷公藤內(nèi)酯醇丁二酸單酯；優(yōu)選藥物潑尼松龍丁二酸單酯和苯丁酸氮芥則可以直接與載體連接，無需衍生化；(2)將藥物或制得的藥物衍生物、N-羥基琥珀酰亞胺溶于乙醇；將低分子量殼聚糖或衍生物溶于蒸餾水或pH值在6.0-8.0MOPS緩沖液(如果低分子量殼聚糖或衍生物不溶于水，就用0.5％-10％的HCl溶液溶液溶解，然后用MOPS緩沖液調(diào)節(jié)近中性)，待完全溶解后，于攪拌條件下將乙醇混合物緩慢滴加到水相，按水∶醇＝1∶9-9∶1(v/v)計算加入，最后加入水溶性碳二亞胺為縮合劑，4℃反應過夜，加入相當于反應液1.5-5倍體積的丙酮沉淀產(chǎn)物，并洗滌沉淀數(shù)次后，干燥得前體藥物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的藥物載體及與其形成的前藥、制法和應用，其特征在于所述的前體藥物制備方法中的縮合劑可以包括N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)、N-環(huán)己基-N’-三甲胺丙基碳二亞胺碘化鹽(EDCI)、N-環(huán)己基-N’-嗎啡啉乙基碳二亞胺對甲苯磺酸甲酯。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求4-8的藥物載體及與其形成的前藥、制法和應用中所述的前體藥物，其特征在于任一種前體藥物及其臨床可用的制劑形式在預防和控制腎臟疾病的急慢性腎炎，腎腫瘤，腎移植后的抗排斥反應及其他腎臟疾病中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的腎靶向藥物載體，及其作為藥物載體所形成的前體藥物、制備方法和應用。通過將天然的殼聚糖進行降解和衍生化得到低分子量的殼聚糖或其衍生物，其具有良好的腎靶向性，該藥物載體通過化學鍵與抗腫瘤藥物或糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑相連，得到前體藥物。藥物分子與載體通過化學鍵相連，并涉及其制備方法和應用。體外和體內(nèi)實驗研究表明前體藥物能夠在體內(nèi)到達腎臟并釋放出活性藥物。本發(fā)明制法簡單，工藝成熟，性能穩(wěn)定，適于大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)。其應用包括作為治療腎臟疾病的免疫抑制劑，腎抑制的抗排斥反應藥物，腎炎并發(fā)腎臟感染的藥物及其制劑。
文檔編號A61K9/02GK1879889SQ20061002099
公開日2006年12月20日 申請日期2006年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月10日
發(fā)明者張志榮, 龔濤, 孫遜, 袁志翔 申請人:四川大學