專利名稱：：一種流行性乙型腦炎疫苗的制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及流行性乙腦疫苗的方法，其步驟如下選用10-14日齡、重量在12-15克的健康地鼠，使用乙醚處死，清洗并消毒鼠尸；無菌取腎，剪碎，經胰蛋白酶消化，用培養(yǎng)液分散細胞，制備細胞懸液，分裝培養(yǎng)瓶，置37°C士rC培養(yǎng)3-4天。細胞長滿單層后接入毒種和培養(yǎng)液，毒種使用量為每100cm2細胞接種lml毒種。病毒培養(yǎng)液主要包括MEM培養(yǎng)液90-95X，小牛血清3-5X，7.5%碳酸氫鈉溶液調節(jié)pH至7.2-7.6。經澄清過濾后加入終濃度為0.3%人血白蛋白制成。選擇細胞生長良好的細胞瓶，棄去培養(yǎng)液，用緩沖液沖洗去除小牛血清，緩沖液沖洗量800-1000ml/瓶，沖洗完畢后每瓶加入1000ml病毒感染液，立即置32-34t:溫室繼續(xù)培養(yǎng)。種毒16-18小時后進行換液，加入維持液1500-2500m1/瓶，置32-34。C溫室繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時。收獲前檢查細胞病變，選擇細胞瓶內細胞病變75%以上的細胞瓶進行收集，將細胞瓶進行超聲，使細胞從瓶壁上脫落下來收集到10-15萬不銹鋼罐內，搖勻即為病毒收獲液。病毒收獲后用14000r/min的連續(xù)流冷凍離心機進行離心，流速為1500-2000m1/min，然后用0.5um及0.22um的濾芯過濾。按1:4000的比例加入P-丙內酯置2_8°C7天滅活。將病毒收獲液濃縮60倍左右，通過凝膠柱層析，0.02MpH7.2的PBS洗脫，檢測波長為280nm，收集第一峰，即為純化后原液。用0.22um的膜除菌過濾，然后加入0.3-0.5%人血白蛋白作為保護劑，加入總濃度為60ug/ml的硫柳汞防腐。病毒蛋白含量31.1-74.22ug/ml，按抗原含量不少于收獲液的四倍配制半成品。各項檢驗項目經檢測后，結果顯示均符合國家藥典標準。三種方法制備乙腦疫苗的工藝異同點如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>以上對本發(fā)明的描述不具有限制性，如果本領域的普通技術人員受其啟示，在不脫離本發(fā)明權利要求的保護的情況，作出本發(fā)明的其它結構變形和實施方式，均屬于本發(fā)明的保護范圍。權利要求一種流行性乙型腦炎疫苗的制備方法，其特征在于步驟如下(1)、選用10-14日齡、重量在12-15克的健康地鼠，使用乙醚處死，清洗并消毒鼠尸；無菌取腎，剪碎，經胰蛋白酶消化，用培養(yǎng)液分散細胞，制備細胞懸液，分裝培養(yǎng)瓶，置37℃±1℃培養(yǎng)3-4天；(2)、選擇細胞生長良好的細胞瓶，棄去培養(yǎng)液，用緩沖液沖洗去除小牛血清，緩沖液沖洗量800-1000ml/瓶，沖洗完畢后每瓶加入1000ml病毒感染液，立即置32-34℃溫室繼續(xù)培養(yǎng)；(3)、種毒16-18小時后進行換液，加入維持液1500-2500ml/瓶，置32-34℃溫室繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時；收獲前檢查細胞病變，選擇細胞瓶內細胞病變75％以上的細胞瓶進行收集，將細胞瓶進行超聲，使細胞從瓶壁上脫落下來收集到10-15萬不銹鋼罐內，搖勻即為病毒收獲液；(4)、病毒收獲后用14000r/min的連續(xù)流冷凍離心機進行離心，流速為1500-2000ml/min，然后用0.5um及0.22um的濾芯過濾，按1∶4000的重量比例加入β-丙內酯置2-8℃7天滅活；(5)、將病毒收獲液濃縮60倍左右，通過凝膠柱層析，0.02MpH7.2的PBS洗脫，檢測波長為280nm，收集第一峰，即為純化后原液；用0.22um的膜除菌過濾，然后加入0.3-0.5％人血白蛋白作為保護劑，加入總濃度為60ug/ml的硫柳汞防腐，病毒蛋白含量31.1-74.22ug/ml，按抗原含量不少于收獲液的四倍配制半成品。2.根據權利要求1所述的流行性乙型腦炎疫苗的制備方法，其特征在于所述的病毒培養(yǎng)液包括MEM培養(yǎng)液90-95X，小牛血清3-5X，7.5%碳酸氫鈉溶液調節(jié)pH至7.2-7.6，經澄清過濾后加入終濃度為0.3%人血白蛋白制成。全文摘要本發(fā)明涉及一種流行性乙型腦炎疫苗的制備方法，包括細胞培養(yǎng)、病毒繁殖和疫苗制備工藝。細胞長滿單層后接入毒種和培養(yǎng)液，毒種使用量為每100cm2細胞接種1ml毒種。病毒培養(yǎng)液主要包括MEM培養(yǎng)液90-95％，小牛血清3-5％，7.5％碳酸氫鈉溶液調節(jié)pH至7.2-7.6。經澄清過濾后加入終濃度為0.3％人血白蛋白制成。本發(fā)明采用SA14-14-2減毒株生產乙腦純化疫苗，該減毒株比P3毒株生產的疫苗更加安全有效。本發(fā)明的優(yōu)點在于1、用減毒株制備純化疫苗安全性好。2、用β-丙內酯滅活病毒滅活效果好，滅活劑自然降解無殘留。3、柱層析純化性質溫和，對病毒損傷小。文檔編號A61K39/12GK101732708SQ20091015452公開日2010年6月16日申請日期2009年11月10日優(yōu)先權日2009年11月10日發(fā)明者姚偉,沈吉友,蘇波申請人:浙江天元生物藥業(yè)股份有限公司