專利名稱：新城疫病毒高粘膜免疫水平弱毒疫苗株ndv/lx及反向遺傳構(gòu)建系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)，篩選一株能同時在消化道和呼吸道產(chǎn)生高水平粘膜免疫的基因I型新城疫病毒弱毒株NDV/LX，用于制造疫苗。
背景技術(shù)：
新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)是嚴重危害世界養(yǎng)禽業(yè)的重要傳染性病原體之一，可以感染多種禽類，常導(dǎo)致養(yǎng)禽業(yè)產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟損失 [Alexander, D. J. 2001.GordonMemorial Lecture.Newcastle disease. Br Poult Sci 42:5-22.]。該病毒屬于副粘病毒科、副粘病毒亞科、禽腮腺炎病毒屬(Avulavirus)的成員[Mayo, M.A. 2002. Virus taxonomy-Houston 2002. Arch Virol 147:1071—1076·]。 新城疫病毒有囊膜，基因組為單股、負鏈、不分節(jié)段的RNA病毒，基因組結(jié)構(gòu)模式為 3' -NP-P-M-F-HN-L-5'，依次編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白 (M)、融合蛋白(F)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白(L)即核蛋白(NP)，P，M， F, HN和L蛋白。根據(jù)對雞的毒力，NDV毒株可以為強毒(Velogenic)、中等毒力(mesogenic) 和弱毒(Lentogen)。已開展廣泛的試驗來闡明病毒致病性的分子決定因素[Huang Ζ, KrishnamurthyS，Panda A,Samal SK. Newcastle disease virus V protein is associated with viral pathogenesis andfunctions as an alpha interferon antagonist. Journal of virology 2003 Aug ；77 (16) :8676-85.]。大部分研究是關(guān)于F和HN蛋白對致病性的作用，研究結(jié)果一致認為F蛋白裂解位點處的氨基酸序列是病毒毒力的主要決定因素[Seal BS. Nucleotide and predicted amino acid sequence analysisof the fusion protein and hemagglutinin-neuraminidase protein genes among Newcastle diseasevirus isolates. Phylogenetic relationships among the Paramyxovirinae based on attachmentglycoprotein sequences. Funct Integr Genomics 20040ct ；4 (4) :246-57.]。 NDV毒力差異的分子基礎(chǔ)主要決定于FO蛋白的蛋白酶裂解位點的氨基酸序列，強毒的裂解位點有聚堿性氨基酸序列，其模式基序為112GR/K-R-Q-K/R-R-F117 ；弱毒的裂解位點則缺少聚堿性氨基酸序列，其模式基序為112-E/G-R/K-Q-E/G-R-L117。自1擬6年發(fā)現(xiàn)新城疫(ND)以來，ND已發(fā)生了四次大的流行，而且每一次流行都有不同基因型的毒株出現(xiàn)，尤其是90年代之后出現(xiàn)了新的基因VII型NDV，給我國的養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。在控制疫病的過程中，使用疫苗是最有效最經(jīng)濟的方法，新城疫的疫苗已使用了幾十年，由于ND疫苗的廣泛使用，此病已基本上得到了較好的控制，但是臨床上非典型ND的發(fā)生十分普遍，ND仍然成為威脅養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病之一，也就是說，常規(guī)的疫苗對于NDV強毒的攻擊并不能提供理想的保護。從近十年來的ND流行特點來看，臨床上所分離到的NDV毒株大多數(shù)屬于基因VII型[Liu, X. F.，H. Q. Wan，Χ. X. Ni，Y. Τ. Wu, and W. B. Liu. Pathotypical and genotypical characterization of strain of Newcastledisease isolatedfrom outbreaks in chicken and goose flocks in some regions of China during 1985-2001. ArchivesofVirology, 2003,148 (7) : 1387-1403.]，而常規(guī)的 ND 疫苗株的基因型主要為I和II型(如V4、La Sota等)，因此，在遺傳距離上當前NDV分離株與常規(guī)ND疫苗株相差較遠。在我國，ND已成為地方流行性疾病，很難撲滅和根除，對商業(yè)雞群進行疫苗免疫是防控新城疫最重要的措施之一。ND疫苗有活疫苗和滅活疫苗之分，活疫苗使用方便，價格便宜，并能產(chǎn)生堅強的免疫力。ND活疫苗不僅能刺激產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫，而且能誘導(dǎo)產(chǎn)生呼吸道和消化道粘膜免疫[Senne, D. A.，D. J. King, and D. R. Kapczynski. 2004. Control ofNewcastle disease by vaccination. Dev Biol (Basel) 119 :165-170.]。因為呼吸道和消化道粘膜是NDV感染宿主的門戶，所以堅強的粘膜免疫在免疫保護中起著十分重要的作用[Erf, G. F. 2004. Cell-mediated immunity in poultry. Poultry science 83 :580-590.]。大多數(shù)商業(yè)化NDV弱毒疫苗都能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對NDV的特異抗體，但是血清中產(chǎn)生的NDV特異抗體并不足以保護動物抵抗NDV強毒的侵襲感染[Reynolds，D. L.， and A. D. Maraqa. 2000. Protective immunityagainst Newcastle disease the role of antibodies specific to Newcastle disease virus polypeptides. Avian Dis 44: 138-144.])。研究表明以呼吸道和腸道分泌性IgA抗體為代表的粘膜免疫在保護免疫雞群抵抗 ND 的感染中起到重要作用[Barbour，Ε. K.，Μ. Kallas，and Μ. Τ. Farran. 2001. Immune response to Newcastle disease virus in broilers :a useful model for the assessment ofdetoxification of ervil seeds. Rev Sci Tech 20 :785-790.]。粘膜中分泌性IgA抗體的產(chǎn)生與疫苗株病毒在粘膜上皮細胞中的復(fù)制密切相關(guān)。但是不同的疫苗病毒在腸道和呼吸道中刺激粘膜產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力有很大的差異。例如常用的疫苗株La Sota是嗜呼吸道型病毒能刺激產(chǎn)生較高水平的呼吸道粘膜免疫，但刺激產(chǎn)生腸道粘膜免疫的能力很差。相反常用疫苗株QV4是嗜腸道病毒，具有較強誘導(dǎo)粘膜免疫的能力，但是誘導(dǎo)呼吸道粘膜免疫的能力差[Brown，C. C.，D. J. King, and B. S. Seal. 1999. Comparison of pathology-based techniques for detection ofviscerotropic velogenic Newcastle disease virus in chickens. J Comp Pathol 120:383-389·]。而從美國火雞腸道中分離的VG/GA毒株，能在呼吸道和消化道中很好的復(fù)制，同時誘導(dǎo)產(chǎn)生堅強的呼吸道和消化道粘膜免疫應(yīng)答，因此它具有比單誘導(dǎo)腸道粘膜免疫的疫苗株QV4和單誘導(dǎo)呼吸道粘膜免疫的疫苗株 La Sota 更大的優(yōu)越性[Perozo，F(xiàn).，P. Villegas, R. Dolz, C. L. Afonso, and L.B.Purvis. 2008. The VG/GA strain of Newcastle disease virus :mucosal immunity, protection against lethal challenge and molecular analysis. Avian Pathol 37 237-245.]。NDV/LX株是我們從健康雞群中分離到的一株NDV弱毒。初步研究表明，NDV/LX具有良好的免疫原性，能在呼吸道和消化道很好的復(fù)制，誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的特異抗體和粘膜免疫應(yīng)答。NDV/LX病毒的ICPI值為0. 12，MDT為1 IOh,按照OIE標準測得HA效價10. 51og2。 攻毒用毒株為基因VII型強毒分離株JS-5-05-GO分離自發(fā)病鴨群，其F和HN基因序列號分別為EU044798、EU044816，其ICPI和MDT分別是1. 91和46小時，HA效價平均為81og
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于發(fā)明一種新城疫病毒高粘膜免疫水平弱毒疫苗株NDV/ LX及反向遺傳構(gòu)建系統(tǒng)，從而解決當前所用疫苗株不能同時在消化道和呼吸道產(chǎn)生黏膜免疫的問題。本發(fā)明基因I型弱毒疫苗株NDV/LX，于2010年5月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC NO :3843.本發(fā)明中NDV/LX株是我們從健康家禽群中分離到一批NDV弱毒。將這些毒株分別以IO6EID50免疫SPF雞，在免疫后1、4、7、11、15、21天，每組撲殺3只雞，獲取雞氣管和小腸沖洗物以及膽汁。試驗的對照組分別為常用疫苗株La Sota、QV4免疫組和PBS免疫空白對照組。經(jīng)過黏膜抗體水平比較，獲得具有良好的免疫原性的NDV/LX株，能在呼吸道和消化道很好的復(fù)制，誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的特異抗體和粘膜免疫應(yīng)答。本發(fā)明的第二個目的在于測定基因I型弱毒疫苗株NDV/LX全基因組序列，其全基因組序列如SEQ ID NO. 37所示。NDV/LX毒株既能在腸道上皮細胞又能在呼吸道上皮細胞中復(fù)制的原因仍然是未知的。據(jù)報道L蛋白、F蛋白或HN蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白的變化是組織嗜性和毒力的主要決定因素。HN和F蛋白可能決定病毒的獨特吸附和融合，這將使嗜腸道的病毒能優(yōu)先進入小腸細胞；而L蛋白的變異將允許嗜腸道毒株在小腸高水平復(fù)制，卻抑制呼吸道型毒株在小腸的復(fù)制。對該毒株進行全基因組測序和反向遺傳構(gòu)建，分析該毒株既能在腸道上皮細胞又能在呼吸道上皮細胞中復(fù)制的分子機制，通過反向遺傳構(gòu)建全長克隆使對其基因組修飾成為可能。本發(fā)明的第三個目的在于構(gòu)建基因I型弱毒疫苗株NDV/LX的全長克隆。本發(fā)明的構(gòu)建方法如下1)基因I型新城疫病毒株NDV/LX株的篩選，對從健康家禽腸道分離到一批新城疫病毒弱毒株進行生物學(xué)特性和免疫原性分析，測定血清中抗新城疫病毒的效價以及消化道和呼吸道粘膜免疫水平。2) NDV/LX株基因組序列測定，新城疫病毒NDV/LX株由揚州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點開放實驗室構(gòu)建、保存。設(shè)計7對引物擴增基因組序列，引物如下
權(quán)利要求
1.一種新城疫病毒弱毒疫苗株NDV/LX，它的保藏號為CGMCC NO :3843。
2.權(quán)利要求所述新城疫病毒弱毒疫苗株NDV/LX的全基因組序列，如SEQID NO. 37所
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)，公開了一株新城疫病毒弱毒株NDV/LX及它的全基因組序列。所述新城疫病毒弱毒疫苗株NDV/LX的保藏號為CGMCC NO3843；全基因組序列如SEQIDNO.37所示。研究表明，NDV/LX具有良好的免疫原性，能在呼吸道和消化道很好的復(fù)制，誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的特異抗體和粘膜免疫應(yīng)答。以常用疫苗株LaSota和QV4為對照，系統(tǒng)研究了NDV/LX株感染SPF雞后在呼吸道和腸道的分布、全身體液免疫和局部粘膜免疫以及免疫雞對流行強毒的保護效力。
文檔編號C12N15/45GK102559607SQ20121000068
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月4日
發(fā)明者劉慧謀, 劉文博, 劉曉文, 劉秀梵, 王曉泉, 胡順林 申請人:揚州大學(xué)