專利名稱：新城疫新型粘膜疫苗及其構建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新城疫疫苗以及構建的方法。
現(xiàn)有技術新城疫是危害養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一，被國際獸疫局(OIE)列為A類烈性傳染病。目前，我國對于新城疫的防制主要采用各種不同毒力的弱毒疫苗和油乳劑滅活疫苗等傳統(tǒng)疫苗進行免疫預防。但是有些弱毒疫苗保留了部分毒性，對雛雞仍有一定的致死率，而且弱毒苗還能引起雞呼吸道的溫和病變，增強了對其它病原的易感性。滅活疫苗雖然能產(chǎn)生高水平的循環(huán)抗體，但是不能刺激機體產(chǎn)生細胞免疫和粘膜免疫，且需要注射免疫，費時費力。另外，常規(guī)疫苗生產(chǎn)成本較高，免疫接種還會受到母源抗體的干擾。因此，尋求一種廉價、更為安全有效且使用方便的疫苗，對于新城疫的綜合防制具有重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于發(fā)明一種可經(jīng)粘膜途徑接種的新城疫新型粘膜疫苗。
新城疫病毒DNA疫苗的DNA長度為4647bp，其DNA排序為gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttcaa 720tatgggctcc agaccttcta ccaggatccc agcacctctg atgctgatca cccggattat 780
gctgatgttg ggctgtatcc gtccgacaag ctctcttgac ggcaggcctc ttgcagctgc 840aggaattgta gtaacaggag ataaggcagt caatgtatac acctcgtctc agacagggtc 900aatcatagtc aagttgctcc cgaatatgcc cagggataag gaagcgtgtg cgaaagcccc 960attagaggca tataacagaa cactgactac tttgctcact cctcttggcg actccatccg 1020caagatccaa gggtctgtgt ccacgtctgg aggaaggaga caaaaacgct ttataggtgc 1080tattattggc agtgtagctc ttggggttgc aacagcggca cagataacag cagctgcggc 1140cctaatacaa gccaaccaga atgctgccaa catcctccgg cttaaggaga gcattgctgc 1200aaccaatgaa gctgtgcatg aagtcaccga cggattatca caactatcag tggcagttgg 1260gaagatgcag cagtttgtca atgaccagtt taataataca gcgcgagaat tggactgtat 1320aaaaatcaca caacaggttg gtgtagaact caacctatac ctaactgaat tgactacagt 1380attcgggcca cagatcacct cccctgcatt gactcagctg accatccagg cactttataa 1440tttagctggt ggcaatatgg attacttatt aactaagtta ggtataggga acaatcaact 1500cagctcatta attggtagcg gcctgatcac tggttaccct attctgtacg actcacagac 1560tcaactcttg ggcatacaag tgaatttgcc ctcagtcggg aacttaaata atatgcgtgc 1620cacctatttg gagaccttat ctgtaagtac aaccaaagga tatgcctcag cacttgtccc 1680gaaagtagtg acacaagtcg gttctgtgat agaagagctt gacacctcat actgtataga 1740gtccgatctg gatttatatt gtactagaat agtgacattc cccatgtccc caggtattta 1800ttcctgtttg agcggcaaca catcagcttg catgtattca aagactgaag gcgcactcac 1860cacgccgtat atggccctta aaggctcagt tattgccaat tgtaagataa caacatgtag 1920atgtacagac cctcctggta tcatatcgca aaattatgga gaagctgtat ccctgataga 1980tagacattcg tgcaatgtct tatcattaga tgggataact ctgaggctca gtggggaatt 2040tgatgcaact tatcaaaaga acatctcaat actagattct caagtcatcg tgacaggcaa 2100tcttgatata tcaactgaac ttggaaacgt caacaattca atcagcaatg ccttggataa 2160gttggcggaa agcaacagca agctagaaaa agtcaatgtc agactaacca gcacatctgc 2220tctcattacc tatattgttc taactgtcat ttctctagtt ttcggtgcac ttagtctggg 2280tttagcgtgt tacctgatga tcaaacagaa ggcacaacaa aagaccttgc tatggcttgg 2340gaataatacc ctcgatcaga tgagagccac tacaagagca tgaatgcaga taagaggtgg 2400gaattctgca gatatccagc acagtggcgg ccgctcgagt ctagagggcc cgtttaaacc 2460cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc 2520gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa 2580attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac 2640agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg 2700gcttctactg ggcggtttta tggacagcaa gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct 2760ctggtaaggt tgggaagccc tgcaaagtaa actggatggc tttctcgccg ccaaggatct 2820gatggcgcag gggatcaagc tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg 2880aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg 2940actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg 3000ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaagacg 3060aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg 3120ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc 3160tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc 3240tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc 3300gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc 3360aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gagcatgccc gacggcgagg 3420
atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct 3480tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt 3540tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc 3600tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt 3660tcttctgaat tattaacgct tacaatttcc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt 3720gcggtatttc acaccgcata caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat 3780ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata 3840aatgcttcaa taatagcacg tgctaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa 3900gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc 3960gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat 4020ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga 4080gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt 4140ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata 4200cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac 4260cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg 4320ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg 4380tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag 4440cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct 4500ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc 4560aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctgggctt 4620ttgctggcct tttgctcaca tgttctt。
另外，本發(fā)明還對具有上述特征的新城疫新型粘膜疫苗提供構建方法，即先通過反轉錄-聚合酶鏈式RT-PCR反應，擴增出新城疫病毒融合蛋白F基因；再將F基因與質粒pVAX1進行連接反應，構建DNA疫苗pVAX1-F；最后將質粒pVAX1-F轉化進減毒鼠傷寒沙門氏菌SL7207中。上述新城疫病毒融合蛋白F基因的擴增引物是上游引物5′taagcttcaatatgggctccagacct 3′下游引物5′cgaattctccacctcttatctgcattcatgc 3′。
本發(fā)明采用以減毒鼠傷寒沙門氏菌運送新城疫病毒DNA疫苗，構建新城疫新型粘膜疫苗SL7207(pVAX1-F)。通過口服方式(飲水或拌料)對家禽(雞、鵝、鴿等)直接進行免疫，較傳統(tǒng)的新城疫弱毒疫苗安全，且較傳統(tǒng)的新城疫油乳劑滅活疫苗使用方便，可克服母源抗體干擾以及油乳劑滅活疫苗不能產(chǎn)生粘膜免疫應答的缺陷，并能提供對新城疫病毒強毒攻擊的保護。
上述新城疫病毒融合蛋白F基因長度為1662bp，其DNA排序為atgggctcca gaccttctac caggatccca gcacctctga tgctgatcac ccggattatg 60
ctgatgttgg gctgtatccg tccgacaagc tctcttgacg gcaggcctct tgcagctgca 120ggaattgtag taacaggaga taaggcagtc aatgtataca cctcgtctca gacagggtca 180atcatagtca agttgctccc gaatatgccc agggataagg aagcgtgtgc gaaagcccca 240ttagaggcat ataacagaac actgactact ttgctcactc ctcttggcga ctccatccgc 300aagatccaag ggtctgtgtc cacgtctgga ggaaggagac aaaaacgctt tataggtgct 360attattggca gtgtagctct tggggttgca acagcggcac agataacagc agctgcggcc 420ctaatacaag ccaaccagaa tgctgccaac atcctccggc ttaaggagag cattgctgca 480accaatgaag ctgtgcatga agtcaccgac ggattatcac aactatcagt ggcagttggg 540aagatgcagc agtttgtcaa tgaccagttt aataatacag cgcgagaatt ggactgtata 600aaaatcacac aacaggttgg tgtagaactc aacctatacc taactgaatt gactacagta 660ttcgggccac agatcacctc ccctgcattg actcagctga ccatccaggc actttataat 720ttagctggtg gcaatatgga ttacttatta actaagttag gtatagggaa caatcaactc 780agctcattaa ttggtagcgg cctgatcact ggttacccta ttctgtacga ctcacagact 840caactcttgg gcatacaagt gaatttgccc tcagtcggga acttaaataa tatgcgtgcc 900acctatttgg agaccttatc tgtaagtaca accaaaggat atgcctcagc acttgtcccg 960aaagtagtga cacaagtcgg ttctgtgata gaagagcttg acacctcata ctgtatagag 1020tccgatctgg atttatattg tactagaata gtgacattcc ccatgtcccc aggtatttat 1080tcctgtttga gcggcaacac atcagcttgc atgtattcaa agactgaagg cgcactcacc 1140acgccgtata tggcccttaa aggctcagtt attgccaatt gtaagataac aacatgtaga 1200tgtacagacc ctcctggtat catatcgcaa aattatggag aagctgtatc cctgatagat 1260agacattcgt gcaatgtctt atcattagat gggataactc tgaggctcag tggggaattt 1320
gatgcaactt atcaaaagaa catctcaata ctagattctc aagtcatcgt gacaggcaat 1380cttgatatat caactgaact tggaaacgtc aacaattcaa tcagcaatgc cttggataag 1440ttggcggaaa gcaacagcaa gctagaaaaa gtcaatgtca gactaaccag cacatctgct 1500ctcattacct atattgttct aactgtcatt tctctagttt tcggtgcact tagtctgggt 1560ttagcgtgtt acctgatgat caaacagaag gcacaacaaa agaccttgct atggcttggg 1620aataataccc tcgatcagat gagagccact acaagagcat ga具體實施例一、新城疫病毒融合蛋白(F)基因的擴增1、引物上游引物5′taagcttcaatatgg gctccagacct 3′下游引物5′gaattctccacctcttatctgcattcatgc 3′上游和下游引物分別含HindIII和EcoRI限制性酶切位點(下劃線標出)。
2、新城疫病毒基因組RNA的制備1.5ml的新城疫病毒強毒JS5(本室分離)尿囊液沉淀用0.4ml磷酸鹽緩沖液(PBS)懸浮，轉移至經(jīng)DEPC處理過的指形管中，加入50μl經(jīng)DEPC處理的10％SDS顛倒混勻，再加入500μl飽和酚混勻，于冰水浴中作用5min，4000rpm離心5min，吸取上清置于DEPC處理過的指形管中，分別加入5％體積的2M醋酸鈉、5％體積的4M氯化鋰及2.5倍體積的無水乙醇，混勻后置-20℃作用1h以上，12000-14000rpm離心15min，棄上清，將指形管置于超凈臺內(nèi)揮發(fā)1h。
3、反轉錄用13μl經(jīng)DEPC處理的超純水溶解上述揮發(fā)干燥的RNA，于65℃水浴作用5min，迅速置冰水浴中作用5min，分別加入AMV RT 5×Buffer 5μl，10mmol/L dNTP 3μl，50pmol/L上游引物1μl，25U/μl AMV反轉錄酶2μl，40U/μl RNasin 1μl，混勻并短暫離心后，置42℃水浴作用1h，進行PCR。
4、PCRPCR反應體系為50μL反轉錄產(chǎn)物6μL10×緩沖液5μL上游引物(50pmol/L)1μL下游引物(50pmol/L)1μL高保真DNA聚合酶(2.5U/μL)0.5μL4種dNTP混合物(2.5mmol/L)2μL超純水34.5μLPCR反應條件為94℃ 45S，46℃ 45S，72℃ 120S，共30個循環(huán)，結束后用濃度為0.8％瓊脂糖電泳分離，回收長1696bp的F基因。
二、DNA疫苗pVAX1-F的構建回收的F基因用HindIII和EcoRI雙酶切，同時用HindIII和EcoRI雙酶切質粒pVAX1，然后將F基因與載體進行連接反應，體系如下F基因(HindIII-EcoRI)3μLpVAX1(HindIII-EcoRI)1μL連接緩沖液1μLT4 DNA連接酶(1U/μL)1μL超純水4μL4℃連接16小時，然后轉化大腸桿菌DH5α，涂布含卡那霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24小時后，挑取生長菌落LB液體培養(yǎng)，提質粒鑒定。
質粒先采用酶切鑒定，用HindIII和EcoRI雙酶切，0.8％瓊脂糖電泳觀察到長約1.7kb的目的條帶。然后將質粒送上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定。測定結果表明，克隆的F基因全長1696bp，編碼一個由553個氨基酸組成的前體蛋白F0，與已報道的NDV強毒株F基因的特征相符。證實DNA疫苗pVAX1-F構建正確。
三、新城疫新型粘膜疫苗的構建將DNA疫苗pVAX1-F轉化減毒鼠傷寒沙門氏菌SL7207(美國斯坦福大學Stocker博士贈送)，涂布于含卡那霉素的LB瓊脂平板。37℃培養(yǎng)24小時后，挑取生長菌落LB液體培養(yǎng)，提質粒鑒定。質粒采用酶切鑒定，用HindIII和EcoRI雙酶切，0.8％瓊脂糖電泳觀察到長約1.7kb的目的條帶，證實DNA疫苗pVAX1-F已被成功導入減毒鼠傷寒沙門氏菌SL7207中，構成以減毒鼠傷寒沙門氏菌運送的新城疫病毒DNA疫苗，其DNA疫苗的DNA長度為4647bp。
應用實驗1、SL7207(pVAX1-F)對雛雞的安全性試驗結果將SL7207(pVAX1-F)分別以108CFU、109CFU、1010CFU口服接種1日齡商品代伊莎褐蛋雞，每劑量組10只，同時設立口服PBS對照組10只。觀察各組試驗雞的健康狀況，2周后撲殺所有試驗雞，檢查是否出現(xiàn)眼觀病變。
實驗結果顯示，在觀察期內(nèi)，所有接種雞均無任何不良反應。2周后撲殺，剖檢沒有發(fā)現(xiàn)在肝臟、脾臟等實質臟器上有眼觀病變。
2、SL7207(pVAX1-F)對雛雞的免疫效力試驗結果1日齡商品代伊莎褐蛋雞共分為4組，分別為重組菌SL7207(pVAX1-F)免疫組(109CFU/羽，30羽)，SL7207(pVAX1)免疫組(109CFU/羽，25羽)，油乳劑滅活疫苗免疫組(25羽)，空白對照組(25羽)。細菌免疫以口服方式進行三次，首免于1日齡進行，二免于2周齡進行，三免于4周齡進行，油乳劑滅活疫苗(揚州大學生物制品研究開發(fā)中心產(chǎn)品)于1日齡頸部皮下接種0.2ml/羽。各免疫組在首免后第14、28和35天分別經(jīng)翅靜脈采血，每組各采10只，室溫靜置，分離血清；同時，每組剖殺兩只試驗雞采集完整的小腸，去除多余的脂肪，于5ml PBS(含100μg/ml PMSF)中用剪刀將腸道剖開，剪成1cm小段，置于100ml瓶中劇烈搖振5min，4℃ 8000rpm離心20min取上清，制備腸道粘膜樣品，通過間接ELISA方法測定F蛋白特異的血清和粘膜抗體效價。分別于第1天和第35天稱量各試驗組所有雞只的體重，觀察其增重情況。于三免后10天用新城疫標準強毒株F48E8以滴鼻途徑對雞群進行攻毒，攻毒劑量為8×104EID50，攻毒后每天觀察雞的反應，連續(xù)觀察14天，統(tǒng)計各組的存活數(shù)，計算免疫保護率。于攻毒后第14天，撲殺所有存活雞，觀察攻毒后試驗雞的大體病變；采集試驗雞的腸道、氣管、法氏囊、胸腺等臟器，以10％中性福爾馬林固定，制備上述臟器的石蠟組織切片，部分組織經(jīng)H.E.染色后，觀察相應的病理變化。
實驗結果顯示，疫苗SL7207(pVAX1-F)免疫不影響雞的增重。疫苗SL7207(pVAX1-F)免疫既能激發(fā)雞產(chǎn)生血清抗體，又能激發(fā)雞產(chǎn)生局部粘膜抗體，而油乳劑滅活疫苗免疫雞沒有產(chǎn)生局部粘膜抗體。疫苗SL7207(pVAX1-F)免疫能抵抗雞母源抗體的干擾，并提供雞對新城疫病毒強毒攻擊良好的免疫保護作用，免疫保護率與油乳劑滅活疫苗試驗組相當。SL7207(pVAX1-F)免疫組攻毒雞的腺胃肌胃、腸道、盲腸扁桃體、脾臟、法氏囊、胸腺及氣管未見大體病變和組織學病變，而SL7207(pVAX1)空載體組攻毒雞上述臟器可見明顯的大體病變和組織學病變。
附表1 疫苗SL7207(pVAX1-F)免疫對雛雞增重的影響組別 雞只數(shù) 5周齡平均體重(kg)SL7207(pVAX1-F) 22 0.413±0.047空白對照 16 0.438±0.041SL7207(pVAX1) 17 0.427±0.044油 苗 18 0.403±0.055附表2 疫苗SL7207(pVAX1-F)對商品代伊莎褐蛋雞的免疫原性試驗結果平均ELISA抗體效價組 別血清樣品 小腸粘膜樣品首免后2周 三免后1周 首免后2周三免后1周SL7207(pVAX1-F) 320.00±195.95 576.00±143.10 128.00 192.00±90.51SL7207(pVAX1)96.00±35.7740.0032.00 32.00油 苗1024.00±350.54 896.00±350.54 48.00±22.6348.00±22.63空 白96.00±35.7736.00±35.77 32.00 32.00
附表3疫苗SL7207(pVAX1-F)對商品代伊莎褐蛋雞的免疫保護結果組 別 雞 數(shù) 存活數(shù)死亡數(shù) 保護率(％)SL7207(pVAX1-F) 22 175 77.27SL7207(pVAX1) 17 5 12 29.42油苗 18 153 83.22空白 16 2 14 12.50由上述實驗得出1、新城疫疫苗SL7207(pVAX1-F)制備方便，免疫簡單易行，適于獸醫(yī)臨床應用。
2、體內(nèi)實驗表明，新城疫疫苗SL7207(pVAX1-F)對雞具有良好的安全性，且不影響雞的增重；具有激發(fā)機體產(chǎn)生全身性免疫應答和局部粘膜免疫應答的能力；能提供新城疫病毒強毒攻擊良好的免疫保護作用，為該疫苗推廣使用奠定了堅實的基礎。
權利要求
1.新城疫新型粘膜疫苗，其特征在于其DNA疫苗的DNA長度為4647bp，其DNA排序為gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttcaa 720tatgggctcc agaccttcta ccaggatccc agcacctctg atgctgatca cccggattat 780gctgatgttg ggctgtatcc gtccgacaag ctctcttgac ggcaggcctc ttgcagctgc 840aggaattgta gtaacaggag ataaggcagt caatgtatac acctcgtctc agacagggtc 900aatcatagtc aagttgctcc cgaatatgcc cagggataag gaagcgtgtg cgaaagcccc 960attagaggca tataacagaa cactgactac tttgctcact cctcttggcg actccatccg 1020caagatccaa gggtctgtgt ccacgtctgg aggaaggaga caaaaacgct ttataggtgc 1080tattattggc agtgtagctc ttggggttgc aacagcggca cagataacag cagctgcggc 1140cctaatacaa gccaaccaga atgctgccaa catcctccgg cttaaggaga gcattgctgc 1200aaccaatgaa gctgtgcatg aagtcaccga cggattatca caactatcag tggcagttgg 1260gaagatgcag cagtttgtca atgaccagtt taataataca gcgcgagaat tggactgtat 1320aaaaatcaca caacaggttg gtgtagaact caacctatac ctaactgaat tgactacagt 1380attcgggcca cagatcacct cccctgcatt gactcagctg accatccagg cactttataa 1440tttagctggt ggcaatatgg attacttatt aactaagtta ggtataggga acaatcaact 1500cagctcatta attggtagcg gcctgatcac tggttaccct attctgtacg actcacagac 1560tcaactcttg ggcatacaag tgaatttgcc ctcagtcggg aacttaaata atatgcgtgc 1620cacctatttg gagaccttat ctgtaagtac aaccaaagga tatgcctcag cacttgtccc 1680gaaagtagtg acacaagtcg gttctgtgat agaagagctt gacacctcat actgtataga 1740gtccgatctg gatttatatt gtactagaat agtgacattc cccatgtccc caggtattta 1800ttcctgtttg agcggcaaca catcagcttg catgtattca aagactgaag gcgcactcac 1860cacgccgtat atggccctta aaggctcagt tattgccaat tgtaagataa caacatgtag 1920atgtacagac cctcctggta tcatatcgca aaattatgga gaagctgtat ccctgataga 1980tagacattcg tgcaatgtct tatcattaga tgggataact ctgaggctca gtggggaatt 2040tgatgcaact tatcaaaaga acatctcaat actagattct caagtcatcg tgacaggcaa 2100tcttgatata tcaactgaac ttggaaacgt caacaattca atcagcaatg ccttggataa 2160gttggcggaa agcaacagca agctagaaaa agtcaatgtc agactaacca gcacatctgc 2220tctcattacc tatattgttc taactgtcat ttctctagtt ttcggtgcac ttagtctggg 2280tttagcgtgt tacctgatga tcaaacagaa ggcacaacaa aagaccttgc tatggcttgg 2340gaataatacc ctcgatcaga tgagagccac tacaagagca tgaatgcaga taagaggtgg 2400gaattctgca gatatccagc acagtggcgg ccgctcgagt ctagagggcc cgtttaaacc 2460cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc 2520gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa 2580attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac 2640agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg 2700gcttctactg ggcggtttta tggacagcaa gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct 2760ctggtaaggt tgggaagccc tgcaaagtaa actggatggc tttctcgccg ccaaggatct 2820gatggcgcag gggatcaagc tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg 2880aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg 2940actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg 3000ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaagacg 3060aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg 3120ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc 3160tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc 3240tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc 3300gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc 3360aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gagcatgccc gacggcgagg 3420atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct 3480tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt 3540tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc 3600tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt 3660tcttctgaat tattaacgct tacaatttcc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt 3720gcggtatttc acaccgcata caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat 3780ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata 3840aatgcttcaa taatagcacg tgctaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa 3900gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc 3960gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat 4020ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga 4080gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt 4140ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata 4200cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac 4260cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg 4320ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg 4380tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag 4440cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct 4500ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc 4560aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctgggctt 4620ttgctggcct tttgctcaca tgttctt。
2.新城疫新型粘膜疫苗的構建方法，其特征在于先通過反轉錄一聚合酶鏈式RT-PCR反應，擴增出新城疫病毒融合蛋白F基因；再將F基因與質粒pVAX1進行連接反應，構建DNA疫苗pVAX1-F；最后將質粒pVAX1-F轉化進減毒鼠傷寒沙門氏菌SL7207中；上述新城疫病毒融合蛋白F基因的擴增引物是上游引物5′taagcttcaatatgg gctccagacct 3′下游引物5′cgaattctccacctcttatctgcattcatgc 3′。
3.根據(jù)權利要求2所述新城疫新型粘膜疫苗的構建方法，其特征在于新城疫病毒融合蛋白F基因長度為1662bp，其DNA排序為atgggctcca gaccttctac caggatccca gcacctctga tgctgatcac ccggattatg 60ctgatgttgg gctgtatccg tccgacaagc tctcttgacg gcaggcctct tgcagctgca 120ggaattgtag taacaggaga taaggcagtc aatgtataca cctcgtctca gacagggtca 180atcatagtca agttgctccc gaatatgccc agggataagg aagcgtgtgc gaaagcccca 240ttagaggcat ataacagaac actgactact ttgctcactc ctcttggcga ctccatccgc 300aagatccaag ggtctgtgtc cacgtctgga ggaaggagac aaaaacgctt tataggtgct 360attattggca gtgtagctct tggggttgca acagcggcac agataacagc agctgcggcc 420ctaatacaag ccaaccagaa tgctgccaac atcctccggc ttaaggagag cattgctgca 480accaatgaag ctgtgcatga agtcaccgac ggattatcac aactatcagt ggcagttggg 540aagatgcagc agtttgtcaa tgaccagttt aataatacag cgcgagaatt ggactgtata 600aaaatcacac aacaggttgg tgtagaactc aacctatacc taactgaatt gactacagta 660ttcgggccac agatcacctc ccctgcattg actcagctga ccatccaggc actttataat 720ttagctggtg gcaatatgga ttacttatta actaagttag gtatagggaa caatcaactc 780agctcattaa ttggtagcgg cctgatcact ggttacccta ttctgtacga ctcacagact 840caactcttgg gcatacaagt gaatttgccc tcagtcggga acttaaataa tatgcgtgcc 900acctatttgg agaccttatc tgtaagtaca accaaaggat atgcctcagc acttgtcccg 960aaagtagtga cacaagtcgg ttctgtgata gaagagcttg acacctcata ctgtatagag 1020tccgatctgg atttatattg tactagaata gtgacattcc ccatgtcccc aggtatttat 1080tcctgtttga gcggcaacac atcagcttgc atgtattcaa agactgaagg cgcactcacc 1140acgccgtata tggcccttaa aggctcagtt attgccaatt gtaagataac aacatgtaga 1200tgtacagacc ctcctggtat catatcgcaa aattatggag aagctgtatc cctgatagat 1260agacattcgt gcaatgtctt atcattagat gggataactc tgaggctcag tggggaattt 1320gatgcaactt atcaaaagaa catctcaata ctagattctc aagtcatcgt gacaggcaat 1380cttgatatat caactgaact tggaaacgtc aacaattcaa tcagcaatgc cttggataag 1440ttggcggaaa gcaacagcaa gctagaaaaa gtcaatgtca gactaaccag cacatctgct 1500ctcattacct atattgttct aactgtcatt tctctagttt tcggtgcact tagtctgggt 1560ttagcgtgtt acctgatgat caaacagaag gcacaacaaa agaccttgct atggcttggg 1620aataataccc tcgatcagat gagagccact acaagagcat ga。
全文摘要
新城疫新型粘膜疫苗及其構建方法，涉及一種新城疫疫苗以及構建的方法，先通過反轉錄—聚合酶鏈式RT－PCR反應，擴增出新城疫病毒融合蛋白F基因；再將F基因與質粒pVAX1進行連接反應，構建DNA疫苗pVAX1－F；最后將質粒pVAX1－F轉化進減毒鼠傷寒沙門氏菌SL7207中，最終獲得DNA長度為4647bp的新城疫病毒DNA疫苗。本發(fā)明采用以減毒鼠傷寒沙門氏菌運送新城疫病毒DNA疫苗，構建新城疫新型粘膜疫苗SL7207(pVAX1－F)。通過口服方式(飲水或拌料)對家禽(雞、鵝、鴿等)直接進行免疫，較傳統(tǒng)的新城疫弱毒疫苗安全，且較傳統(tǒng)的新城疫油乳劑滅活疫苗使用方便，可克服母源抗體干擾以及油乳劑滅活疫苗不能產(chǎn)生粘膜免疫應答的缺陷，并能提供對新城疫病毒強毒攻擊的保護。
文檔編號A61K48/00GK1616108SQ200410064940
公開日2005年5月18日 申請日期2004年10月10日 優(yōu)先權日2004年10月10日
發(fā)明者焦新安, 潘志明, 黃金林, 張曉明, 張小榮, 殷月蘭, 孫林, 劉秀梵 申請人:揚州大學