本發(fā)明涉及一種滅活病毒的疫苗制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

疫苗是指為了預(yù)防、控制傳染病的發(fā)生、流行，用于防控機(jī)體被病原體感染的生物制品。疫苗的發(fā)現(xiàn)可謂是人類發(fā)展史上一件具有里程碑意義的事件。疫苗被認(rèn)為是20世紀(jì)最重要的公共衛(wèi)生成果之一。在未來的5到15年中,新疫苗和新疫苗接種技術(shù)將從根本上改變醫(yī)生預(yù)防及治療疾病的方式,對公共衛(wèi)生產(chǎn)生巨大影響。傳統(tǒng)疫苗有滅活疫苗和減毒疫苗，減毒疫苗存在著再次感染的威脅，傳統(tǒng)滅活疫苗因主要基于甲醛滅活方法而會帶來機(jī)體對疫苗的過敏反應(yīng)，嚴(yán)重的情況時會導(dǎo)致接種者傷殘甚至死亡。同時甲醛的過量使用會給制備疫苗操作者帶來健康威脅。因此一種安全無毒且高效的滅活疫苗制備方法對于保護(hù)機(jī)體，保護(hù)操作者以及提高疫苗產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益具有重大意義。

低溫等離子體是繼固態(tài)、液態(tài)、氣態(tài)之后的物質(zhì)第四態(tài)，當(dāng)外加電壓達(dá)到氣體的著火電壓時，氣體分子被擊穿，產(chǎn)生包括電子、各種離子、原子和自由基在內(nèi)的混合體。等離子體可分為不同的類別：按熱力學(xué)平衡分類，等離子體可分為熱平衡等離子體和非熱平衡等離子體；按系統(tǒng)溫度分類，等離子體分為低溫等離子體和高溫等離子體。熱平衡等離子體中所有粒子的溫度都一樣，宏觀上表現(xiàn)為高溫等離子體。在非熱平衡等離子體中，電子的溫度可高達(dá)數(shù)萬度，而離子和中性粒子的溫度遠(yuǎn)小于電子溫度，整個體系呈現(xiàn)低溫狀態(tài)，所以也稱為低溫等離子體。低溫等離子體存在著大量的、種類繁多的活性粒子，因此非熱平衡等離子體可作為高活性反應(yīng)物應(yīng)用于多種實(shí)際應(yīng)用中。已有大量研究證明大氣壓低溫等離子體在滅活細(xì)菌、真菌、病毒等病原體具中有卓越的效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種物理無毒副作用的滅活病毒制備疫苗的技術(shù)方法，本發(fā)明采用低溫大氣壓空氣等離子體有效滅活病毒，并保留了病毒的免疫原性，進(jìn)一步輔以佐劑制備病毒疫苗。

本發(fā)明提供的一種基于低溫大氣壓空氣等離子體滅活病毒并制備疫苗的方法，包括如下步驟：1)向低溫等離子體發(fā)生裝置中通入氣體，然后打開電源，激發(fā)產(chǎn)生等離子體；2)用激發(fā)的大氣壓低溫等離子體處理病毒液，對病毒進(jìn)行滅活；3)用滅活的病毒病原體制備滅活病毒疫苗；

本發(fā)明中，所述病毒疫苗是由大氣壓低溫空氣等離子體滅活病毒制備而成。

本發(fā)明中，所述大氣壓低溫空氣等離子體由電驅(qū)動，電驅(qū)動可以為直流電，也可以為交流電。

上述方法中，所述的驅(qū)動電壓參數(shù)為0.5-10KV，電流為2-2.5A；

所述大氣壓低溫空氣等離子體的頻率可為20-100kHz；

上述方法中所述的病毒病原體可以為新城疫病毒(NDV LaSota strain)、禽流感病毒(H9N2AIV)。

上述方法中所述的等離子體與病原體溶液的作用時間范圍為30秒-10分鐘。

上述的方法中，所述大氣壓低溫空氣等離子體采用直流，交流或脈沖電源。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明采用大氣壓低溫空氣等離子體技術(shù)處理新城疫病毒和禽流感病毒，有效滅活病毒且保留病毒免疫原性，無毒、無刺激、無異味，有效避免甲醛滅活病毒遺留的毒副作用的不足的問題，同時大氣壓低溫空氣等離子體技術(shù)裝置耗能低，操作簡便，有效降低生產(chǎn)成本。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中采用的大氣壓低溫空氣等離子體的裝置圖。圖1說明：(a)1.電阻2.高壓電源3.高 壓銅電極4.絕緣陶瓷5.外部銅電極6.空氣氣流7.裝有病原體溶液的燒杯8.等離子體束；(b)1.空氣氣流2.絕緣管3.高壓電源4.高壓電極5.等離子體流；(c)1.空氣氣流2.絕緣管3.高壓電源4.高壓電極5.等離子體流

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中大氣壓低溫空氣等離子體對病毒的滅活過程。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中檢測滅活病毒免疫原性。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中雞的攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、滅活新城疫病毒NDV LaSota并制備疫苗的方法

病毒采用SPF雞胚尿囊液進(jìn)行培養(yǎng)；

1、將NDV LaSota毒株(來自于北京市農(nóng)林科學(xué)院)感染9-11日齡的無特定病原體(SPF)雞胚。收集尿囊液，低速離心。收集的病毒在使用前保存在-70℃.

2、在等離子體滅活病毒的實(shí)驗(yàn)中，首先在37℃解凍10mL含有NDV的尿囊液，然后用低溫等離子體分別處理2min，4min，6min。

3、等離子體處理過程中，病毒液置于等離子體激發(fā)裝置下1-3cm距離，開啟電源激發(fā)等離子體，使等離子體與病毒液相互作用。未經(jīng)過處理含有NDV的尿囊液分別作為對照。

4、采用傳統(tǒng)的雞胚致死實(shí)驗(yàn)和紅血球凝聚分析來判斷等離子體對病毒的滅活情況。油佐劑分別與等離子體和甲醛處理后的病毒抗原相混合便可以制成疫苗。pH調(diào)整到7。

5、觀察胚致死現(xiàn)象，不同的方法處理病毒后，注射到11日齡的含胚雞蛋中。每24h，進(jìn)行照蛋器檢查，并且記錄，直到雞胚長至120h。死亡雞胚冷藏在4℃。

6、紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(HA)，從雞胚中收集的尿囊液與血清的反應(yīng)實(shí)驗(yàn)在V型微孔平板中進(jìn)行。

7、評估疫苗的有效性，150個SPF28日齡的雞被標(biāo)記，然后隨機(jī)分到10個組中，包括生理鹽水組，甲醛處理NDV組，等離子體處理NDV2min組，等離子體處理NDV4min組，等離子體處理NDV6min組，每組15只雞。所有的接種疫苗組接種0.2mL的疫苗。免疫原性的測定中的血清來自于第0天，第7，14，21天雞的翅脈。通過紅血球凝聚抑制試驗(yàn)，檢測NDV特定抗體的存在。

8、雞的攻毒實(shí)驗(yàn)，為了決定等離子體處理后的抗體的保護(hù)作用，在皮下接種疫苗后21天，NDV組中雞注射具有胚致死毒性的NDV0.5mL。之后每24h拍照，并將死亡的雞冷藏于4℃下。氣管和前胃進(jìn)行解剖和分析。檢測10天內(nèi)的臨床癥狀和死亡數(shù)。

實(shí)施例2、滅活禽流感病毒H9N2AIV病毒并制備疫苗的方法

病毒采用SPF雞胚尿囊液進(jìn)行培養(yǎng)；

1、將H9N2AIV毒株(來自于北京市農(nóng)林科學(xué)院)感染9-11日齡的無特定病原體(SPF)雞胚。收集尿囊液，低速離心。收集的病毒在使用前保存在-70℃.

2、在等離子體滅活病毒的實(shí)驗(yàn)中，首先在37℃解凍10mL含有AIV的尿囊液，然后用低溫等離子體分別處理1min，2min，3min，4min。

3、等離子體處理過程中，病毒液置于等離子體激發(fā)裝置下1-3cm距離，開啟電源激發(fā)等離子體，使等離子體與病毒液相互作用。未經(jīng)過處理含有AIV的尿囊液分別作為對照。

4、采用傳統(tǒng)的雞胚致死實(shí)驗(yàn)和紅血球凝聚分析來判斷等離子體對病毒的滅活情況。油佐劑分別與等離子體和甲醛處理后的病毒抗原相混合便可以制成疫苗。pH調(diào)整到7。

5、觀察胚致死現(xiàn)象，不同的方法處理病毒后，注射到11日齡的含胚雞蛋中。每24h，進(jìn)行照蛋器檢查，并且記錄，直到雞胚長至120h。死亡雞胚冷藏在4℃。

6、紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(HA)，從雞胚中收集的尿囊液與血清的反應(yīng)實(shí)驗(yàn)在V型微孔平板中進(jìn)行。

7、評估疫苗的有效性，150個SPF28日齡的雞被標(biāo)記，然后隨機(jī)分到10個組中，包括生理鹽水組，甲醛處理AIV組，等離子體處理AIV1min組，等離子體處理AIV2min組，等離子體處理AIV3min組，等離子體處理AIV4min組，每組15只雞。所有的接種疫苗組接種0.2mL的疫苗。免疫原性的測定中的血清來自于第0天，第7，14，21天雞的翅脈。通過紅血球凝聚抑制試驗(yàn)，檢測AIV特定抗體的存在。