一種亞單位疫苗及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種亞單位疫苗，該疫苗的制備方法和應(yīng)用，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 多殺性己氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm)屬于己氏桿菌科己氏桿菌屬多殺 性己氏桿菌種，是有芙膜的革蘭氏陰性短桿菌，兼性厭氧。根據(jù)其芙膜和脂多糖的不同，可 將化分為A、B、D、E、巧個(gè)血清群和16個(gè)血清型，A型主要引起禽霍亂，B、E型主要引起出 血性敗血癥，產(chǎn)毒素的D型主要引起豬萎縮性鼻炎。該病原菌在世界各地均有流行，宿主范 圍較廣，可感染多種動(dòng)物并引起發(fā)病，不同動(dòng)物感染后發(fā)病癥狀和病理變化不盡相同。
[0003] 豬的多殺性己氏桿菌病多數(shù)是由化A、B、D血清型引起，非產(chǎn)毒素多殺性己氏桿 菌主要引發(fā)豬肺疫，又稱(chēng)豬出血性敗血癥，俗稱(chēng)"鎖喉風(fēng)"。該病最急性型呈敗血癥癥狀，咽 喉部急性腫脹，高度呼吸困難，犬坐姿勢(shì)，死亡迅速；急性型表現(xiàn)為纖維素性胸膜肺炎癥狀； 慢性型多為慢性肺炎、胃腸炎W及逐漸消瘦，有時(shí)伴發(fā)關(guān)節(jié)炎。產(chǎn)毒素多殺性己氏桿菌主要 引起進(jìn)行性豬萎縮性鼻炎，該病會(huì)導(dǎo)致豬鼻甲骨萎縮、鼻吻變形及全身骨骼發(fā)育受到影響， 使豬的生長(zhǎng)遲緩，容易繼發(fā)復(fù)合性肺炎，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0004] 目前臨床上用于預(yù)防多殺性己氏桿菌病的疫苗主要是滅活疫苗和弱毒活疫苗，滅 活苗對(duì)己氏桿菌不同血清型的交叉保護(hù)能力差、保護(hù)期短；弱毒活疫苗的免疫效果易受環(huán) 境等因素的影響且存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)。無(wú)論是滅活疫苗還是弱毒活疫苗，均需要多次重 復(fù)免疫，面對(duì)異型菌株的攻擊，其保護(hù)功效是十分有限的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的主要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種用于預(yù)防和/或治療豬多殺 性己氏桿菌病的疫苗組合物，包含H種豬己氏桿菌免疫保護(hù)性抗原和佐劑。
[0006] 本發(fā)明的第一方面包括一種疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括免疫量的豬 己氏桿菌抗原OmpA蛋白、OmpH蛋白和Pl祀蛋白。
[0007] 本發(fā)明采用大腸桿菌表達(dá)的0mpA、0mpH及Pl祀蛋白制備豬己氏桿菌亞單位疫苗， 對(duì)豬己氏桿菌不同血清型提供全面的保護(hù)；使用吸收效果好的新型水溶性佐劑，避免免疫 局部出現(xiàn)不良反應(yīng)，提高免疫應(yīng)答及對(duì)豬的免疫保護(hù)作用。
[000引本發(fā)明首次通過(guò)將化的外膜蛋白OmpA蛋白、OmpH蛋白和Pl祀蛋白組合使化針 對(duì)不同血清型豬己氏桿菌感染有較好的保護(hù)作用，而且只需要免疫一次，避免多次重復(fù)免 疫帶來(lái)的應(yīng)激反應(yīng)。通過(guò)免疫效力比較試驗(yàn)，意外發(fā)現(xiàn)，幾種蛋白組合使用，協(xié)同刺激機(jī)體 免疫反應(yīng)，能夠有效降低免疫劑量，大大降低免疫成本。
[0009] 本發(fā)明提供的預(yù)防和/或治療豬多殺性己氏桿菌病的疫苗組合物包含的豬己氏 桿菌免疫抗原為P. multocida重組OmpA、OmpH、Pl祀蛋白。
[0010] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的疫苗組合物中，所述豬己氏桿菌抗原 OmpA蛋白的氨基酸序列為SE化NO. 4,所述豬己氏桿菌抗原OmpH蛋白的氨基酸序列為SE化 NO. 5,所述豬己氏桿菌抗原Pl祀蛋白的氨基酸序列為SEQ. NO. 6。
[0011] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的預(yù)防和/或治療豬多殺性己氏桿菌病的疫苗組合物包含的 豬己氏桿菌免疫抗原OmpA蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0012] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的預(yù)防和/或治療豬多殺性己氏桿菌病的疫苗組合物包含的 豬己氏桿菌免疫抗原OmpH蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0013] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的預(yù)防和/或治療豬多殺性己氏桿菌病的疫苗組合物包含的 豬己氏桿菌免疫抗原Pl祀蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
[0014] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的疫苗組合物中，所述編碼豬己氏桿菌 抗原OmpA蛋白的核巧酸序列為SE化NO. 1，所述編碼豬己氏桿菌抗原OmpH蛋白的核巧酸序 列為SEQ. NO. 2,所述編碼豬己氏桿菌抗原Pl祀蛋白的核巧酸序列為SEQ. NO. 3。
[0015] 本發(fā)明提供的預(yù)防和/或治療豬多殺性己氏桿菌病的疫苗組合物包含的豬己氏 桿菌免疫抗原OmpA蛋白、Om抑蛋白、Pl祀蛋白還可W是與其功能衍生物基本相同的氨基酸 序列的多膚。
[0016] 術(shù)語(yǔ)"功能衍生物"指具有與完整蛋白/膚序列的生物活性基本類(lèi)似的功能生物 活性的蛋白/膚序列。換言之，其優(yōu)選地指當(dāng)將所述功能衍生物施用于動(dòng)物時(shí)，基本上保留 了激發(fā)免疫應(yīng)答，如針對(duì)豬己氏桿菌菌株攻擊的保護(hù)性反應(yīng)的能力的多膚或其片段。
[0017] 術(shù)語(yǔ)"片段"指送樣的多核巧酸序列，其是人工構(gòu)建（例如通過(guò)化學(xué)合成）或通過(guò) 將天然產(chǎn)物裂解成多個(gè)小片段（使用限制性內(nèi)切酶，或機(jī)械剪切）構(gòu)建的本發(fā)明核酸的分 離的部分，或通過(guò)PCR、DNA聚合酶或本領(lǐng)域公知的任何其他聚合技術(shù)合成的核酸的部分， 或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的重組核酸技術(shù)在宿主細(xì)胞中表達(dá)的核酸部分。
[001引術(shù)語(yǔ)"保護(hù)性反應(yīng)"意為在動(dòng)物中預(yù)防豬己氏桿菌相關(guān)疾病或由豬己氏桿菌導(dǎo)致 的感染的發(fā)作或減輕存在的送樣的疾病的嚴(yán)重性。
[0019] 本發(fā)明涉及的豬己氏桿菌多膚，其有利地激發(fā)動(dòng)物中的保護(hù)性反應(yīng)。具體地，本發(fā) 明實(shí)施方式的多膚包含與其功能衍生物基本相同的氨基酸序列。
[0020] 如本文一般理解和使用，"功能性片段"指編碼與完整核酸序列的生物活性基本相 似的功能生物活性的核酸序列。換言之，在本發(fā)明的上下文中，其優(yōu)選地指基本上保留了編 碼送樣的多膚/蛋白質(zhì)能力的核酸或其片段，所述多膚/蛋白質(zhì)當(dāng)施用于動(dòng)物時(shí)，激發(fā)針對(duì) 豬己氏桿菌菌株攻擊的免疫應(yīng)答，和更優(yōu)選地保護(hù)性反應(yīng)。
[0021] 當(dāng)指氨基酸序列時(shí)，"基本上相同"可W理解為本發(fā)明的多膚優(yōu)選地具有送樣的氨 基酸序列，其與SEQ ID NO ;4-6中所示的序列的部分或全部具有至少70%同源性，或甚至 優(yōu)選地80%同源性，或甚至更優(yōu)選地90%同源性，或最優(yōu)選地95%同源性。
[0022] 在本文中術(shù)語(yǔ)"同源性"還包括與參比序列相同或類(lèi)似，同時(shí)提供任何氨基酸的簡(jiǎn) 單替換/修飾。可W用BLAST-P (基本局部排比檢索工具），本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的程序進(jìn) 行該方面的同源性檢索。對(duì)于相應(yīng)的核酸序列，同源性涉及在本領(lǐng)域中已知的BLASTX和 BLASTN 程序。
[0023] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的疫苗組合物中，所述豬己氏桿菌抗原 OmpA蛋白含量為50-150 U g/ml，所述豬己氏桿菌抗原OmpH蛋白含量為50-150 U g/ml，所述 豬己氏桿菌抗原Pl祀蛋白含量為100-400 U g/ml。
[0024] 本發(fā)明的組合物的成分或組分的量?jī)?yōu)選地是治療有效量。所述治療有效量是指在 組合物施用的宿主中發(fā)揮它們的免疫學(xué)作用而不導(dǎo)致過(guò)度副作用所必需量。所用的成分 和待施用的組合物的精確的量將根據(jù)因素如治療的疾病的類(lèi)型，待治療的動(dòng)物的類(lèi)型和年 齡，施用的方式，W及組合物中的其它成分而變化。
[00巧]優(yōu)選地，對(duì)于動(dòng)物豬而言，本發(fā)明疫苗組合物OmpA蛋白抗原含量為50-100 Ji g/ ml ;0mpH蛋白抗原含量為50-100U g/ml ;P1祀蛋白抗原含量為100-400U g/ml。
[0026] 更優(yōu)選地，所述疫苗組合物OmpA蛋白抗原含量為100 y g/ml ;0mpH蛋白抗原含量 為IOOy g/ml ;PlpE蛋白抗原含量為200U g/ml。
[0027] 作為本發(fā)明的一種最優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的疫苗組合物中，所述豬己氏桿菌抗 原OmpA蛋白含量為100 U g/ml，所述豬己氏桿菌抗原OmpH蛋白含量為100 U g/ml，所述豬 己氏桿菌抗原Pl祀蛋白含量為200 U g/ml。
[0028] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的疫苗組合物中，所述豬己氏桿菌抗原 OmpA蛋白含量為50 y g/ml，所述豬己氏桿菌抗原OmpH蛋白含量為50 y g/ml，所述豬己氏桿 菌抗原Pl祀蛋白含量為IOOy g/ml。
[0029] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的疫苗組合物中，所述豬己氏桿菌抗原 OmpA蛋白含量為150 U g/ml，所述豬己氏桿菌抗原OmpH蛋白含量為150 U g/ml，所述豬己氏 桿菌抗原Pl祀蛋白含量為400 U g/ml。
[0030] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的疫苗組合物中，所述疫苗組合物還包 含佐劑，所述佐劑包括油佐劑，水溶性佐劑，鉛鹽佐劑，細(xì)胞因子佐劑。
[0031] 術(shù)語(yǔ)"佐劑"指加入到本發(fā)明的組合物中W增加組合物的免疫原性的物質(zhì)。已知 的佐劑包括，但不限于；油佐劑，水溶性佐劑，鉛鹽佐劑，細(xì)胞因子佐劑。
[0032] 本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)"油佐劑"又稱(chēng)"油性佐劑"或"油乳佐劑"，是由包括植物油、動(dòng) 物油、礦物油中的一種或幾種組成，用于延緩免疫原在機(jī)體內(nèi)的存留時(shí)間，使之持續(xù)緩慢釋 放，增強(qiáng)巨瞻細(xì)胞的吞瞻與殺菌能力。
[0033] 本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)"水溶性佐劑"又稱(chēng)"水基佐劑"或"水佐劑"，是一種聚合物水溶 性分散體，用于提高水溶性疫苗的功效和安全性，可W由高分子量聚丙帰酸類(lèi)合成聚合物 組成。
[0034] 本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)"鉛鹽佐劑"，又稱(chēng)"鉛膠佐劑"或"鉛佐劑"，包括氨氧化鉛佐劑和 磯酸鉛佐劑，其主要功能為緩釋?zhuān)瑫r(shí)具有對(duì)免疫細(xì)胞的激活作用。將抗原和氨氧化鉛或 磯酸鉛混合注射，能夠使抗原保存在注射部位，具有抗原緩釋和非特異免疫刺激作用。
[0035] 本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞因子佐劑"，包括比-1、比-2、比-3、比-4、比-5、比-6、比-7、 IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、INF- Y、GM-CSF、TNF- a、TNF-目、TCA-3 等，又稱(chēng)"細(xì)胞因子" 或"細(xì)胞素"，是活體宿主細(xì)胞分泌的通過(guò)擴(kuò)散、細(xì)胞間接觸或血液循環(huán)到達(dá)宿主其他細(xì)胞， 在體液中W極低濃度發(fā)揮作用的一類(lèi)非免疫球蛋白、局部天然蛋白或糖蛋白，也是一類(lèi)由 機(jī)體活化的免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞產(chǎn)生、分泌，能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化，與造血、炎癥反 應(yīng)、免疫應(yīng)答反應(yīng)和創(chuàng)傷愈合等密切相關(guān)的高活性多功能小分子蛋白的統(tǒng)稱(chēng)，可W刺激或 抑制免疫功能，在免疫應(yīng)答中促進(jìn)細(xì)胞發(fā)育分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能和細(xì)胞間信息傳遞，在 免疫系統(tǒng)中起著非常重要的調(diào)控作用。
[0036] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的疫苗