一種融合細(xì)胞及其制備方法和其作為腫瘤疫苗的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種融合細(xì)胞及其制備方法和該融合細(xì)胞作為腫瘤疫苗的應(yīng)用，尤其 是涉及一種采用新型抗原遞呈細(xì)胞ysT-APC和新城雞瘟病毒株NDV-Ulser修飾的腫瘤細(xì) 胞融合制備融合細(xì)胞的方法，還涉及所得融合細(xì)胞作為腫瘤疫苗的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 樹突狀細(xì)胞（以下稱為DendriticCell,DC)作為專職抗原遞呈細(xì)胞在誘導(dǎo)抗病 原微生物和抗腫瘤的免疫應(yīng)答中起至關(guān)重要的作用。以DC為基礎(chǔ)的抗癌疫苗在臨床試驗 中也日益受到廣泛的關(guān)注。為了獲得腫瘤特異性疫苗，研究者們采用了多種策略來研制基 于DC細(xì)胞的腫瘤疫苗，以激發(fā)抗腫瘤特異性免疫應(yīng)答。臨床試驗中應(yīng)用的DC疫苗主要包 括抗原負(fù)載的DC細(xì)胞疫苗、基因修飾的DC細(xì)胞疫苗等。但令人失望的是，在這些DC疫苗 的臨床試驗中，僅有很少的患者接受上述DC細(xì)胞疫苗治療后出現(xiàn)客觀應(yīng)答反應(yīng)。其原因主 要在于：一是對于各種腫瘤已經(jīng)確定的特異性腫瘤抗原極少，腫瘤細(xì)胞也容易通過抗原變 異逃避針對單一抗原表位的免疫作用；二是由于提取的腫瘤蛋白抗原在體內(nèi)容易被蛋白質(zhì) 水解酶降解，誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)不能持久，難以獲得理想的治療效果；三是基因修飾法制備的 DC細(xì)胞腫瘤疫苗，受基因?qū)胄屎突蜣D(zhuǎn)移的靶向性等技術(shù)難題的影響；四是DC的的細(xì) 胞疫苗還受到DC細(xì)胞的數(shù)量少、純度低以及DC和腫瘤細(xì)胞的免疫源性差等的影響。對于 DC融合細(xì)胞來說，理論上所有的腫瘤細(xì)胞抗原都能夠有效地進(jìn)入抗原遞呈途徑，免疫源性 TAA或TSA肽在共刺激分子存在下由MHCI和MHCII遞呈到細(xì)胞表面。而且融合細(xì)胞能夠迀 移到腫瘤引流淋巴結(jié)，在那里它們能直接與⑶4+T和⑶8+T細(xì)胞直接進(jìn)行相互作用，誘導(dǎo)強(qiáng) 烈的抗腫瘤免疫應(yīng)答。另外，宿主DC細(xì)胞也可以攝取死亡的融合細(xì)胞釋放的TAAs并依靠 其表面MHCI和MHCII分子遞呈同時活化CD4+和CD8+T細(xì)胞。DC的融合細(xì)胞疫苗雖然可以 涵蓋所有已知和未知的腫瘤特異性抗原及腫瘤相關(guān)抗原庫，但DC融合細(xì)胞疫苗也受DC細(xì) 胞數(shù)量和純度及腫瘤細(xì)胞的免疫源性等的影響，因此，上述DC腫瘤疫苗在臨床上的效果往 往并不理想。
[0003] 近年來，DC和腫瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞疫苗的出現(xiàn)成為了腫瘤免疫治療的研究熱點(diǎn)， 因為融合細(xì)胞既表達(dá)腫瘤的所有抗原成分，又具有DC細(xì)胞的抗原提呈能力，即融合細(xì)胞能 遞呈腫瘤細(xì)胞所有的抗原。腫瘤細(xì)胞特異性抗原仍未得到明確鑒定，因此用DC-腫瘤融合 細(xì)胞遞呈全腫瘤抗原被認(rèn)為是一種簡單而有效的抗腫瘤方法。DC-腫瘤融合細(xì)胞可通過化 學(xué)方法如聚乙二醇（PEG)或是使用電融合儀獲得。腫瘤細(xì)胞在融合前一般都要經(jīng)過射線照 射或是絲裂霉素C處理，所得到的DC-腫瘤融合細(xì)胞疫苗是沒有增殖危險的。Zhou(Zhou J,ffengD,ZhouFetal.Patientderivedrenalcellcarcinomacellsfusedwith allogeneicdendriticcellselicitanti-tumoractivity：invitroresultsand clinicalresponses.CancerImmunolImmunother[J]，2009, 58(10):1587-1597)報 道10個進(jìn)展的腎癌患者接受疫苗治療后，其中6個人的病情穩(wěn)定（SD)持續(xù)了 1.5年。 Avigan(AviganD,VasirB，GongJetal.Fusioncellvaccinationofpatients withmetastaticbreastandrenalcanerinducesimmunologicalandclinical responses.ClinCancerRes[J], 2004, 10 (14):4699-4708)的研究結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)移性 乳腺癌病人中，一位患者胸壁8cmX6cm的腫塊幾乎完全消退。另一位患者腎上腺腫塊 縮小了 50%，肺上的包塊縮小了 44%。Trefzer(TrefzerU，HerberthG，WohlanK，et al.Vaccinationwithhybridsoftumoranddendriticcellsinducestumor-specific TcellandclinicalresponsesinmelanomastageIIIandIVpatients.IntJ Cancer[J]，2004, 110(5) :730-740)研究報道，17例III和IV期黑色素瘤患者接受了融合 細(xì)胞疫苗治療后，8例患者有臨床療效，1例達(dá)到完全緩解，1例達(dá)到部分緩解，6例疾病穩(wěn) 定，平均存活28個月；另外9例患者存活5-22個月，平均存活時間為12. 5個月，較IV期黑 色素瘤患者平均存活時間（8個月）明顯延長。
[0004] 然而DC-腫瘤融合疫苗也有其很大的局限性，雖然DC細(xì)胞可由外周血中的單核細(xì) 胞來誘導(dǎo)，但單核細(xì)胞來源的DC(Mo-DC)受體外增殖能力和不同DC誘導(dǎo)條件的限制，使得 單核來源DC(Mo-DC)數(shù)量很有限，一般100ml外周血分離PBMCs并經(jīng)貼壁誘導(dǎo)后最多可獲 得1X107個DC，而且這些Mo-DC細(xì)胞均一性很差，往往是成熟與未成熟DC交織在一起，未 成熟DC細(xì)胞純度一般只能達(dá)到40-50 %左右，未經(jīng)修飾的DC-腫瘤的融合效率大概在30 % 左右，按照DC細(xì)胞：腫瘤細(xì)胞=1:10的比例進(jìn)行融合，融合率僅為20-30 %，融合細(xì)胞相關(guān) 抗原的表達(dá)一般也只能達(dá)到30-50%左右，因此臨床試驗中制備的DC-腫瘤融合細(xì)胞疫苗 要達(dá)到理想的治療效果必須得滿足以下條件：一是用于制備融合細(xì)胞的無論是抗原遞呈細(xì) 胞還是腫瘤細(xì)胞必須要有很強(qiáng)的免疫源性；二是必須得提高抗原遞呈細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的 融合效率，只有足夠數(shù)量的融合細(xì)胞才能更好的發(fā)揮有效的免疫應(yīng)答作用；三是要獲得足 夠數(shù)量的融合細(xì)胞，首先要有足夠數(shù)量且表型均一的抗原遞呈細(xì)胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種融合細(xì)胞及其制備方法和所得融合 細(xì)胞作為腫瘤疫苗的應(yīng)用。本發(fā)明中采用新型抗原遞呈細(xì)胞YST-APC和新城雞瘟病毒株 NDV-Ulser修飾的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，其中新型抗原遞呈細(xì)胞y5T-APC是通過采用磷酸 化抗原或雙膦酸鹽類藥物刺激活化臍帶血來源的單個核細(xì)胞細(xì)胞獲得的，將所得融合細(xì)胞 進(jìn)行分離純化和擴(kuò)大培養(yǎng)并將其制備成疫苗。其中，本發(fā)明所涉及的yST-APC、NDV-Ulser 修飾的腫瘤細(xì)胞、二者的融合細(xì)胞都可以進(jìn)行大量制備；與采用DC細(xì)胞和未經(jīng)修飾的腫瘤 細(xì)胞進(jìn)行融合相比，本發(fā)明方法能得到更多的新型抗原遞呈細(xì)胞TST-APC，yST-APC和 經(jīng)過修飾的腫瘤細(xì)胞的融合率高，本發(fā)明所得融合細(xì)胞腫瘤抗原效價更完整、免疫源性更 強(qiáng)、腫瘤抗原負(fù)載率高。
[0006] -種融合細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：
[0007] (1)制備NDV-Ulster病毒株修飾的腫瘤細(xì)胞
[0008] 將腫瘤細(xì)胞滅活，在滅活的腫瘤細(xì)胞中按照每（1-2)X107個滅活的腫瘤細(xì)胞中加 入NDV-Ulster病毒株32個血凝單位的比例加入NDV-Ulster病毒株，得混合物，將混合物 移入培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)瓶中加入無血清細(xì)胞培養(yǎng)基并于37°C、5%C02的條件下培養(yǎng)0. 5-2 小時，離心收集NDV-Ulster病毒株修飾后的腫瘤細(xì)胞，洗滌并進(jìn)行無菌檢驗，無菌檢驗陰 性為合格；
[0009] (2)制備采用磷酸抗原或雙膦酸鹽類藥物刺激活化的新型抗原遞呈細(xì)胞 y 8 T-APC
[0010] 從臍帶血血庫購買的或患者自己在商業(yè)機(jī)構(gòu)保存的臍帶血中分離單個核細(xì)胞后， 用含2-10%所述臍帶血血漿的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基將單個核細(xì)胞稀釋到1-2X106個/ml， 置于培養(yǎng)瓶中，并向培養(yǎng)瓶中加入磷酸化抗原或雙膦酸鹽類藥物，優(yōu)選1-羥基-2_(咪 唑-i-yl)-亞乙基卜二磷酸-水化物刺激活化單個核細(xì)胞，使磷酸化抗原或雙膦酸鹽 類藥物濃度為1-10yM，將培養(yǎng)瓶置于37°C、5%C02的條件下培養(yǎng)18-24h后，再在培養(yǎng)瓶 中加入重組人白細(xì)胞介素-II(即rhIL-2)，使其濃度為100-1000U/ml，優(yōu)選1000U/ml，每 隔2-3天繼續(xù)補(bǔ)充所述含2-10%所述臍帶血血漿的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基并補(bǔ)充重組人白細(xì) 胞介素-II，使重組人白細(xì)胞介素-II濃度保持為l〇〇-l〇〇〇U/ml，優(yōu)選1000U/ml，如此總共 培養(yǎng)7-14天，優(yōu)選14天，即可獲得活化的yST-APC，離心將yST-APC收集起來，對活化 的yST-APC細(xì)胞進(jìn)行微生物、細(xì)胞活率及免疫表型的檢測，微生物檢測陰性，細(xì)胞活率> 85%，目標(biāo)免疫表型的陽性率均> 80%才能用于融合細(xì)胞的制備；
[0011] (3)制備yST-APC和NDV-Ulser修飾的腫瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞
[0012] 使用不同熒光染料標(biāo)記的抗體對步驟（1)所得NDV-Ulser修飾的腫瘤細(xì)胞以及步 驟⑵培養(yǎng)的yST-APC進(jìn)行染色，每2X105個yST-APC加入UXloefNDV-Ulster 修飾的腫瘤細(xì)胞（即細(xì)胞比例1:5-10)進(jìn)行融合，獲得融合產(chǎn)物；優(yōu)選使用FITC標(biāo)記的 抗MUC1 (HMPV,BDPharminggen)單克隆抗體和 / 或FITC標(biāo)記的抗Her-2/neu(TA-l,BD Pharminggen)單克隆抗體對步驟（1)所得NDV-Ulser修飾的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行染色，優(yōu)選使用 PE標(biāo)記的抗HLA-DR(