專利名稱：可控性腫瘤活細(xì)胞疫苗及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可控性腫瘤活細(xì)胞疫苗及其制備方法和用途，屬于腫 瘤生物免疫治療和細(xì)胞免疫學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前，癌癥仍然為人類的主要死亡原因。癌癥治療的常規(guī)方法，如手 術(shù)、放療和化療等，雖然在治療一^良性及生長(zhǎng)速度較慢的腫瘤效果較好， 但對(duì)于浸潤(rùn)生長(zhǎng)、增殖快速的惡性實(shí)質(zhì)腫瘤，這些常規(guī)的治療措施療效很 不理想。
大量研究表明，腫瘤細(xì)胞之所以能在生物體內(nèi)失控生長(zhǎng)、增殖，主要 原因是機(jī)體抗腫瘤免疫機(jī)制的缺陷或不完善，從而使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的 "免疫監(jiān)視"而處于"免疫逃逸"狀態(tài)，尤其反映在機(jī)體免疫細(xì)胞不能對(duì) 腫瘤抗原進(jìn)行特異性免疫識(shí)別，自身難以激發(fā)足夠的免疫反應(yīng)。
近年來，腫瘤細(xì)胞疫苗的發(fā)展為治療惡性腫瘤帶來了希望。目前用于 制備腫瘤細(xì)胞疫苗的細(xì)胞主要有腫瘤細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞(Antigen Presenting Cells, APC)兩種，所采用的方法通常有以下幾種1、直接 將死亡全腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞裂解輛作為腫瘤疫苗；2、將基因修飾的APC (一般是樹突狀細(xì)胞Denditic Cells, DC)作為腫瘤疫苗；3、將APC尤 其是DC與腫瘤細(xì)胞進(jìn)行融合形成雜交瘤，以其提取物作為腫瘤疫苗；4、 將基因修飾的腫瘤細(xì)胞滅活后制成腫瘤疫苗。
雖然采用上述方法制備的腫瘤細(xì)胞疫苗在體外、動(dòng)物試驗(yàn)和臨床前研 究方面證明其具有一定的有效性，但臨床試驗(yàn)有效果不好，主要存在以下 缺陷或不足 ，
1、 抗原提呈效率低，抗原提呈不完全，如腫瘤DNA疫苗、RNA疫苗不 能通過MHC或HLA-II類分子對(duì)腫瘤抗原進(jìn)行提呈，而滅活腫瘤細(xì)胞或其裂 解物與APC或T細(xì)胞共同培養(yǎng)又不能有效通過MHC或HLA- I類分子進(jìn)行腫
瘤抗原提呈。 '
2、 多數(shù)為單價(jià)腫瘤疫苗，僅供特定個(gè)體免疫治療，而絕大多數(shù)腫瘤 抗原異質(zhì)性高，缺乏特異抗原表型，單價(jià)疫苗效果差。3、疫苗效價(jià)低，活的腫瘤疫苗具有高效的抗腫瘤免疫能力，腫瘤疫 苗的失活是導(dǎo)致其效價(jià)降低的主要原因之一。研究表明，細(xì)胞因子基因修 飾的瘤苗，其細(xì)胞因子的表達(dá)與細(xì)胞活性呈線性相關(guān)，經(jīng)放射線處理后的 瘤苗與活瘤苗比較，細(xì)胞因子分泌量顯著減少，經(jīng)放射線處理后的腫瘤細(xì) 胞有可能產(chǎn)生腫瘤特異性抗原基因突變，導(dǎo)致腫瘤疫苗的特異性下降；而 DC經(jīng)放射線照射后，其表面共刺激分子和MHC分子表達(dá)均下降，必然影響 DC提呈抗原的活性，刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力也顯著降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的，是為了克服現(xiàn)有的腫瘤細(xì)胞疫苗存在抗原提呈 效率低、抗原提呈不完全、單價(jià)疫苗效果差和g價(jià)低的缺陷，提供一種可 控性腫瘤活細(xì)胞疫苗。
本發(fā)明的第二個(gè)目的，是為了提供可控性腫瘤活細(xì)胞疫苗的制備方法。
本發(fā)明的第三個(gè)目的，是為了il供可控性腫瘤活細(xì)胞疫苗的用途。
本發(fā)明的第--.個(gè)目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到 可控性腫瘤活細(xì)胞疫苗，其特點(diǎn)是
1) 由自殺基因胸苷激酶TK和免疫調(diào)節(jié)基因，通過轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞進(jìn)行
轉(zhuǎn)基因操作形成雙基因修飾的可控腫瘤活細(xì)胞疫苗；
2) 可直接接種宿主或與抗原提呈細(xì)胞DC融合后接種宿主，可控腫瘤 活細(xì)胞疫苗在接種-周后可以于體內(nèi)給予GCV滅活；
3) 既可控制活疫苗體內(nèi)生長(zhǎng)，又可使目的基因充分分泌表達(dá)。 本發(fā)明的第一個(gè)目的還可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到
所述的免疫調(diào)節(jié)基因可以是IL-18、 IL-12、 IL-2、 B7-l、 IFN-Y 、 GM-CSF
等各種免疫基因，以及其他治療用具有免疫活性的目的基因等。
本發(fā)明的第二個(gè)目的可以通過釆取如下技術(shù)方案達(dá)到
可控性腫瘤活細(xì)胞疫苗的制備方法，其特征在于將自殺基因胸苷激
酶TK和免疫調(diào)節(jié)基因如IL-18通過慢病毒感染和脂質(zhì)體介導(dǎo)的方式轉(zhuǎn)染 腫瘤細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，篩選穩(wěn)定表達(dá)上述目'的基因的細(xì)胞克隆培養(yǎng)擴(kuò) 增獲得雙基因修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗；具體包括如下歩驟1) 建立穩(wěn)定表達(dá)TK基因的腫瘤細(xì)胞系；
2) 建立雙基因修飾的腫瘤活細(xì)胞疫苗；
3) 活腫瘤細(xì)胞疫苗的體外調(diào)控抑瘤觀察；
4) 活腫瘤細(xì)胞疫苗的體內(nèi)調(diào)控抑瘤觀察；
5) 活細(xì)胞疫苗致敏DC誘導(dǎo)制備特異性抗J3，瘤CTL。
本發(fā)明中進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作需要應(yīng)用慢病毒載體，所述載體可以是腺相 關(guān)病毒載體、慢病毒載體或質(zhì)粒DNA載體。
本發(fā)明中應(yīng)用的慢病毒載體可以是第三代慢病毒載體質(zhì)粒，所應(yīng)用的 慢病毒表達(dá)系統(tǒng)ViraPowerTM Lentiviral Expression Systems 為載體質(zhì) 粒、包裝質(zhì)粒、rev質(zhì)粒和包膜蛋白質(zhì)粒4質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞生產(chǎn)假病 毒顆粒。應(yīng)用該系統(tǒng)包裝的基因質(zhì)?？朔讼俨《咀鳛檩d體轉(zhuǎn)染時(shí)不能建 立長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)目的基因細(xì)胞系的缺點(diǎn)。
該包裝系統(tǒng)中①去掉了 HIV的大部分的蛋白編碼基因，不存在產(chǎn)生復(fù) 制型HIV的可能性；②慢病毒載體的包裝質(zhì)粒中缺失掉了 LTRs，因而載體 基因組只能在生產(chǎn)細(xì)胞中表達(dá)，而不可能被整合入病毒粒子中；③假型慢 病毒載體無復(fù)制性，只攜帶外源基因，相當(dāng)均一，無類似于復(fù)制型腺病毒 (replication competent adenoviruses, RCA)之類的成分；④載體基因 組有自滅活機(jī)制，整合于宿主基因組后，不可能再被拯救而產(chǎn)生可被包裝 的病毒基因組，因而其生物安全性極高。
本發(fā)明所述包裝系統(tǒng)中去掉了 HIV的大部分的蛋白編碼基因；慢病毒 載體的包裝質(zhì)粒中缺失掉了 LTRs;假型慢病毒載體無復(fù)制性，只攜帶外源 基因；載體基因組有自滅活機(jī)制。
本發(fā)明的第三個(gè)目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到
可控性腫瘤活細(xì)胞疫苗的用途，其特征在于通過基因修飾的活腫瘤
細(xì)胞疫苗激活免疫系統(tǒng)淋巴細(xì)胞增殖，產(chǎn)生特異性CTL殺傷效應(yīng)和/或非 特異性NK殺傷效應(yīng)，在宿主體內(nèi)產(chǎn)生顯著增強(qiáng)的抗腫瘤免疫應(yīng)答。
本發(fā)明所述的可控腫瘤活細(xì)胞疫苗可以單獨(dú)使用，或與手術(shù)、放療、 化療及其他生物治療聯(lián)合應(yīng)用以取得最佳療效。
本發(fā)明所述的可控腫瘤活細(xì)胞疫苗可以直接使用，也可以在體外刺激產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，間接使用。
本發(fā)明所述的可控腫瘤活細(xì)胞疫苗使用途徑包括但不限于以下幾種 皮下、皮內(nèi)、腫瘤內(nèi)注射，其中以靠近腋窩、腹股溝附近的皮內(nèi)注射為佳。
應(yīng)用本發(fā)明處理細(xì)胞時(shí)，外源基因表達(dá)效率的提高不是由轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因 種類引起的，因此多種基因都可以用于轉(zhuǎn)染，以適應(yīng)不同設(shè)計(jì)需要，例如 IL-12、 IL-2、 B7-1、 IFN-y、 GM-tSF等各種免疫基因，以及其他治療用 具有免疫活性的目的基因等。
本發(fā)明具有如下有益效果
1、本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，通過對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操 作，制備成可調(diào)控的活細(xì)胞疫苗免疫治療惡性腫瘤的新策略以及制備方 法，經(jīng)過這樣的處理后，腫瘤疫苗的效價(jià)更高，腫瘤抗原的提呈更加完全， 外源免疫調(diào)節(jié)基因的表達(dá)增高并且穩(wěn)定，更好的實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的效果，從而 增強(qiáng)腫瘤疫苗激發(fā)的特異性免疫反應(yīng)，增加腫瘤疫苗的療效。
2 、本發(fā)明利用HSV-TK/GCV系統(tǒng)在特定時(shí)間控制免疫調(diào)節(jié)基因修飾的 腫瘤細(xì)胞疫苗死活，有機(jī)地結(jié)合免^基因工程化技術(shù)和DC疫苗的優(yōu)勢(shì)達(dá) 到抗原提呈及目的基因分泌最大化的雙重效應(yīng)。在保證安全性的前提下， 這一疫苗策略可擴(kuò)展為使用同種異體腫瘤細(xì)胞系建立活細(xì)胞通用疫苗庫(kù)， 克服自身腫瘤取材及培養(yǎng)的不足，同時(shí)有利于克服自身腫瘤抗原免疫逃逸 的缺點(diǎn)，刺激機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫識(shí)別和殺傷效應(yīng)。
3、 本發(fā)明首次利用慢病毒載體取代傳統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝攜帶TK基 因，大大提高了轉(zhuǎn)染效率，可以高效整合入腫瘤細(xì)胞基因組中，經(jīng)過加壓 篩選獲得穩(wěn)定傳代表達(dá)的細(xì)胞系，為活疫苗構(gòu)建奠定了前提基礎(chǔ)。
4、 本發(fā)明能滿足大量腫瘤疫苗制備要求，適于建立通用抗腫瘤疫苗 庫(kù)，可縮短現(xiàn)有疫苗方法的制備時(shí)間和成本，并且容易形成一種惡性腫瘤 免疫治療標(biāo)準(zhǔn)。 ，


圖l為本發(fā)明通過HSV-TK/GCV系統(tǒng)對(duì)U87/TK/I1-18腫瘤細(xì)胞疫苗 "死活"的體外調(diào)控示意圖。
圖2為本發(fā)明通過MTT法測(cè)試GCV對(duì)U87/ TK/IL-18腫瘤細(xì)胞疫苗的
增殖抑制示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于 說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的 實(shí)驗(yàn)方法，如大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取及限制性內(nèi)切 酶消化、DNA片段的回收、線性DNA片段的連接、重組質(zhì)粒的篩選與鑒定、 PCR擴(kuò)增反應(yīng)、蛋白印跡等按照常規(guī)條件如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn) 室手冊(cè) (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 中 所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1:
本實(shí)施例提供一種可控腫瘤活細(xì)胞疫苗，其特點(diǎn)是
1) 由自殺基因胸苷激酶TK和免疫調(diào)節(jié)基因，通過轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞進(jìn)行
轉(zhuǎn)基因操作形成雙基因修飾的可控i中瘤活細(xì)胞疫苗；
2) 可直接接種宿主或與抗原提呈細(xì)胞DC融合后接種宿主，可控腫瘤 活細(xì)胞疫苗在接種一周后可以于體內(nèi)給予GCV滅活；
3) 既可控制活疫苗體內(nèi)生長(zhǎng)，又可使目的基因充分分泌表達(dá)。 本實(shí)施例的制備方法包括如下步驟
1、建立穩(wěn)定表達(dá)TK基因的腫瘤細(xì)胞系 '
本實(shí)施例以腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87為例進(jìn)行說明，所述操作均在無菌條
件下進(jìn)行。
(1) 腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng) ，
按照ATCC (http : 〃www. atcc.org)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方案及U87細(xì)胞 系培養(yǎng)方案，用含10。/。胎牛血清(FBS)、青霉素100U/ml、鏈霉素100Pg/ml 和1%L-谷氨酰胺的DMEM(高糖)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于5%C02、 37°C、飽 和濕度條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
(2) TK基因修飾腫瘤細(xì)胞
對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞鋪6孔板，2.'0X105 cells/per well, 在37°C、5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)；感染前更換新鮮DMEM完全培養(yǎng)基， 置于培養(yǎng)箱中待用；將表達(dá)TK基因的載體pLenti-TK質(zhì)粒(含抗性基因 BSD)慢病毒液，由-7(TC冰箱取出，37。C水浴融化，按10-2終稀釋比，加入培養(yǎng)孔板感染腫瘤細(xì)胞，前后晃板混勻，置于箱中培養(yǎng)24h后更換培 養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h更換含BSD(終濃度6 u g/ml)的新鮮DMEM完全培養(yǎng)基 篩選；每3 4d更換培養(yǎng)基，給予BSD壓力培養(yǎng)10d后，采用畫圈法挑取 單克隆細(xì)胞株，擴(kuò)增傳代，RT-PCR及Western鑒定目的基因的表達(dá)。
2、 建立雙基因修飾的腫瘤活細(xì)胞疫苗 '
本實(shí)施例以免疫調(diào)節(jié)基因IL-18為例進(jìn)行說明，以篩選獲得穩(wěn)定高表 達(dá)目的基因的腫瘤細(xì)胞株為活疫苗的主體。
利用LipofectamineTM 2000纟旨質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(Sigma產(chǎn)品)介導(dǎo)的 pcDNA3. l-hIL-18轉(zhuǎn)染U87/TK細(xì)胞。U87/TK細(xì)胞以1X105 cells/500 u 1 /well鋪24孔板培養(yǎng)，達(dá)到90%融合度時(shí)轉(zhuǎn)染；將lug的質(zhì)粒稀釋于 50 u 1無血清的DMEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻；2u 1的LipofectamineTM 2000 溶于50y 1無血清的匿EM培養(yǎng)基中，室溫下孵育5min;稀釋后的質(zhì)粒與 LipofectamineTM 2000輕輕均勻混合，室溫下孵育20min;將轉(zhuǎn)染液 (100u l)加入待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞孔中，前后輕搖培養(yǎng)板充分混勻，置于37"C、 5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱；轉(zhuǎn)染后次閂更換為DM'EM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)， 轉(zhuǎn)染后48h更換為含G418及BSD的DMEM完全培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)；每3 4d 更換培養(yǎng)基，給予G418及BSD壓力培養(yǎng)10d后，采用畫圈法挑取單克隆 細(xì)胞株，擴(kuò)增傳代，RT-PCR、 ELISA及Western鑒定目的基因的表達(dá)。
3、 活腫瘤細(xì)胞疫苗的體外調(diào)控抑瘤觀察
將U87/TK/IL-18細(xì)胞接種96孔板，每孔接種細(xì)胞2 4X 103，置于 37°C、 5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)；6h或過夜后加入GCV，使GCV 終濃度為0、 0.01、 0.1、 1、 10、 50ug/ml，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)6天，每天觀察細(xì)胞存活情況；6天后，吸除96孔板中培養(yǎng)液， 加入200ixl無血清純培養(yǎng)液稀釋的0.5mg/mlMTT溶液，37'C避光培養(yǎng) 4-6h;除去MTT液，加入100u 1DMS0溶液，在ll聯(lián)免疫檢測(cè)儀上以570nm 吸收波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)孔吸 光值/對(duì)照孔吸光值)X100%，細(xì)胞殺傷率=1一細(xì)胞存活率。
4、 活腫瘤細(xì)胞疫苗的體內(nèi)調(diào)控抑瘤觀察
(1)將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的體外培養(yǎng)的活細(xì)胞疫苗以4.2X106個(gè)/只分 別皮下接種于裸鼠腋下， 一周后隨機(jī)分組，給予GCV100mg/kg，給藥途徑 為腹腔注射給藥，給藥容量0. lml/10g體重，l次/天，連續(xù)給藥7天。
9(2)實(shí)驗(yàn)過程中比較各組動(dòng)物存活時(shí)間的'差異；根據(jù)以下公式計(jì)算 腫瘤體積V4/2X長(zhǎng)徑X短徑2，計(jì)算腫瘤體積并比較各組間腫瘤生長(zhǎng)曲
線的差異。
(3 )療效評(píng)價(jià)按照RTV=Vt /,V0公式計(jì)算相對(duì)腫瘤體積(RTV )和相 對(duì)腫瘤增殖率T/C%， T/Cy^給藥組的RTV平均值/陰性對(duì)照組的RTV平均值
X100%， (Vt:每天測(cè)量腫瘤得到的瘤體積；V0:初始瘤體積(給藥前))，
如果1/0%>40%，為無效，如果T/C。/?！?0。/。，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理P<0. 05，為有效。
(4)腫瘤組織的病理組織學(xué)觀察觀察各主要臟器有無轉(zhuǎn)移瘤形成，
腫瘤及心肝脾肺腎等組織制備石蠟切片，進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。
5、活細(xì)胞疫苗致敏DC誘導(dǎo)制備特異性抗腫瘤CTL
(1) DC細(xì)胞的培養(yǎng)和成熟
無菌操作抽取健康人外周血，jp素抗凝后緩慢加入裝有淋巴細(xì)胞分離 液的離心管中，分層后離心棄上清，吸取中間的白色細(xì)胞層；在含有5% FCS和1%雙抗的RPMI-1640中培養(yǎng)2小時(shí)，將懸浮的細(xì)胞(含T細(xì)胞) 吸出，置入含10U/ml人重組白介素-2(rhlL-2) 、 80ng/ml人重組GM-CSF、 10%FCS和1%雙抗的RPMI-1640中培養(yǎng)，每二天換液一次。貼壁的細(xì)胞 加入DC培養(yǎng)液(含RPMI-1640、 5%FCS、 100U/ ml GM-CSF、 500 U/ml IL-4)， 于37。C、 5%C02的孵箱中培養(yǎng)，每三天換液，可加入40 ng/ml的TNF-a 或l y g/ml的LPS刺激DC成熟，第七天收獲DC細(xì)胞備用。
(2) 腫瘤細(xì)胞疫苗在體外刺激DC
將制備好的腫瘤細(xì)胞疫苗加入成熟的DC細(xì)胞中，按DC與腫瘤細(xì)胞的 比例為5:1-10:1混合，37°C， 5%(:，02溫箱孵育24 48h，作為致敏的抗原 提呈細(xì)胞。
(3) 特異性抗腫瘤CTL的誘導(dǎo)制備
將致敏的腫瘤細(xì)胞疫苗與10 20倍的自體淋巴細(xì)胞等體積混合，37 °C， 5%(:02溫箱培養(yǎng)5 6天，3天后加入30U/ml的IL-2誘導(dǎo)抗原特異性 CTL的活化和擴(kuò)增，收集通過Nylon wool分離的T cell，此特異性抗腫 瘤CTL細(xì)胞可直接應(yīng)用于臨床治療。
(4) 細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)檢測(cè)收集通過Nylon wool分離的T cell,與51Cr標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞混合， 在37'C、 5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5小時(shí)，在Y射線檢測(cè)儀上檢測(cè)51Cr的 釋放的強(qiáng)度，即可反映細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)對(duì)相應(yīng)靶細(xì)胞的殺傷作用。
研究結(jié)果表明，本發(fā)明是一種安全、有效的基因工程腫瘤活細(xì)胞疫苗， 具有丌發(fā)成為用于惡性腫瘤治療性疫苗的良好前景。
本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，用免疫細(xì)胞因，基因修飾腫瘤細(xì)胞的瘤 苗，在體內(nèi)細(xì)胞因子僅需極微量的表達(dá)，就可以達(dá)到大劑量全身系統(tǒng)給藥 才能產(chǎn)生的生物學(xué)免疫反應(yīng)，而且基因的持續(xù)表達(dá)，可以避免反復(fù)大劑量 給藥對(duì)機(jī)體的副損害。經(jīng)基因修飾的細(xì)胞疫苗更加高效地增強(qiáng)細(xì)胞的抗原 提呈能力，增加細(xì)胞的免疫原性，糾正患者的"免疫耐受"狀態(tài)，激發(fā)和 強(qiáng)化患者自身的特異性抗腫瘤免疫功能。
權(quán)利要求
1、可控性腫瘤活細(xì)胞疫苗，其特征是1)由自殺基因胸苷激酶TK和免疫調(diào)節(jié)基因，通過轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作形成雙基因修飾的可控腫瘤活細(xì)胞疫苗；2)可直接接種宿主或與抗原提呈細(xì)胞DC融合后接種宿主，可控腫瘤活細(xì)胞疫苗在接種一周后可以于體內(nèi)給予GCV滅活；3)既可控制活疫苗體內(nèi)生長(zhǎng)，又可使目的基因充分分泌表達(dá)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的可控性腫瘤活細(xì)胞疫苗，其特征是所述的免 疫調(diào)節(jié)基因是IL-18、 IL-12、 IL-2、 B7-l、 IFN-Y或GM-CSF免疫基因，或者是 治療用具有免疫活性的目的基因。
3、 可控性腫瘤活細(xì)胞疫苗的制備方法，其特征在于將自殺基因胸 苷激酶TK和免疫調(diào)節(jié)基因如IL-18通過慢病毒感染和脂質(zhì)體介導(dǎo)的方式 轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，篩選穩(wěn)定表達(dá)上述目的基因的細(xì)胞克隆培 養(yǎng)擴(kuò)增獲得雙基因修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗；具體包括如下步驟1) 建立穩(wěn)定表達(dá)TK基因的腫瘤細(xì)胞系；2) 建立雙基因修飾的腫瘤活細(xì)胞疫苗；3) 活腫瘤細(xì)胞疫苗的體外調(diào)控抑瘤觀察；4) 活腫瘤細(xì)胞疫苗的體內(nèi)調(diào)控抑瘤觀察；5) 活細(xì)胞疫苗致敏DC誘導(dǎo)制備特異性抗腫瘤CTL。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的可控性腫瘤活細(xì)胞疫苗的制備方法，其特 征在于進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作需要應(yīng)用慢病毒載體，所述載體是腺相關(guān)病毒載 體、慢病毒載體或質(zhì)粒DNA載體。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的可控性腫瘤活細(xì)胞疫苗的制備方法，其特 征在于所應(yīng)用的慢病毒載體為載體質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒、rev質(zhì)粒和包膜蛋 白質(zhì)粒4質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞生產(chǎn)假病毒顆粒。
6、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的可控性腫瘤活細(xì)胞疫苗的制備方法，其特 征在于所應(yīng)用的慢病毒載體中去掉了 HIV的大部分的蛋白編碼基因；慢 病毒載體的包裝質(zhì)粒中缺失掉了 LTRs;假型慢病毒載體無復(fù)制性，只攜帶 外源基因；載體基因組有自滅活機(jī)制。
7、 可控性腫瘤活細(xì)胞疫苗的用途，其特征在于通過基因修飾的活 腫瘤細(xì)胞疫苗激活免疫系統(tǒng)淋巴細(xì)胞增殖，產(chǎn)生特異性CTL殺傷效應(yīng)和/ 或非特異性NK殺傷效應(yīng)，在宿主體內(nèi)產(chǎn)生顯著增強(qiáng)的抗腫瘤免疫應(yīng)答。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的可控性腫瘤活細(xì)胞疫苗的用途，其特征在 于可控腫瘤活細(xì)胞疫苗單獨(dú)使用，或與手術(shù)、放療、化療及其他生物治療聯(lián)合應(yīng)用。
9、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的可控性腫瘤活細(xì)'胞疫苗的用途，其特征在 于可控腫瘤活細(xì)胞疫苗可以直接使用，或者在體外刺激產(chǎn)生細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞，間接使用。
10、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的可控性腫瘤活細(xì)胞疫苗的用途，其特征在 于可控腫瘤活細(xì)胞疫苗使用途徑包括皮下、皮內(nèi)、腫瘤內(nèi)注射，其中以 靠近腋窩、腹股溝附近的皮內(nèi)注射為佳。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可控性腫瘤活細(xì)胞疫苗及其制備方法和用途，其特征在于將自殺基因胸苷激酶TK和免疫調(diào)節(jié)基因通過慢病毒感染和脂質(zhì)體介導(dǎo)的方式轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，篩選穩(wěn)定表達(dá)上述目的基因的細(xì)胞克隆培養(yǎng)擴(kuò)增獲得雙基因修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗。本發(fā)明疫苗能夠激活免疫系統(tǒng)淋巴細(xì)胞增殖，產(chǎn)生特異性CTL殺傷效應(yīng)和/或非特異性NK殺傷效應(yīng)，在宿主體內(nèi)產(chǎn)生顯著增強(qiáng)的抗腫瘤免疫應(yīng)答。本發(fā)明腫瘤疫苗的效價(jià)更高，腫瘤抗原的提呈更加完全，外源免疫調(diào)節(jié)基因的表達(dá)增高并且穩(wěn)定，更好的實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的效果，從而增強(qiáng)腫瘤疫苗激發(fā)的特異性免疫反應(yīng)，增加腫瘤疫苗的療效。
文檔編號(hào)A61K39/00GK101559220SQ20081019875
公開日2009年10月21日 申請(qǐng)日期2008年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月25日
發(fā)明者戴學(xué)軍, 健 林, 王偉民 申請(qǐng)人:廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院