一種樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于生物制劑領(lǐng)域，特別涉及一種負(fù)載腫瘤抗原致敏樹突狀細(xì)胞而獲得的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗及其制備方法。
【背景技術(shù)】
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[0002]樹突狀細(xì)胞(DC)是存在于外周血、皮膚、淋巴器官和胸腺中的抗原提呈細(xì)胞(APC)，是人體內(nèi)功能最強的APC，除了具有強大的抗原提呈能力外，在樹突狀細(xì)胞表面上表達(dá)的I類和II類分子的抗原肽，能分別激活CD4+和CD8 +T細(xì)胞，并通過這種激活DC誘導(dǎo)針對特定抗原的體內(nèi)免疫應(yīng)答，所述抗原是例如腫瘤相關(guān)抗原、病原微生物抗原以及移植物抗原等。
[0003]樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗(DC腫瘤疫苗)是一類攜帶腫瘤抗原信息的功能性樹突狀細(xì)胞，能有效激活特異性T細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)及免疫記憶功能。DC腫瘤疫苗的優(yōu)勢是能通過特異性腫瘤抗原誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟，并通過DC將腫瘤抗原信息傳遞給T細(xì)胞，使T細(xì)胞重新認(rèn)識并殺傷腫瘤細(xì)胞。采用不同形式的腫瘤抗原體外沖擊致敏DC后可以產(chǎn)生較強的抗腫瘤免疫，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，并能在患者體內(nèi)誘發(fā)免疫記憶，使患者體內(nèi)獲得長期的抗腫瘤效應(yīng)從而有效防止腫瘤的復(fù)發(fā)。
[0004]現(xiàn)有的樹突狀細(xì)胞體外負(fù)載的抗原主要是已知的腫瘤特異性抗原，即腫瘤細(xì)胞株裂解物。由于許多腫瘤的特異性抗原尚未明確且易發(fā)生抗原位點變異，另外腫瘤細(xì)胞株在體外傳代過程中表面抗原可能發(fā)生改變，DC細(xì)胞不能將該腫瘤的所有抗原有效呈遞給效應(yīng)T細(xì)胞，從而限制了效應(yīng)T細(xì)胞在體內(nèi)的抗腫瘤效應(yīng)。
[0005]傳統(tǒng)的胸、腹水腫瘤細(xì)胞的提取方法有多種，其中采用密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法操作較為簡單、經(jīng)濟，但由于腹水中含有較多紅細(xì)胞、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞等，使制備成的細(xì)胞懸液不利于腫瘤細(xì)胞的分離；而貼壁培養(yǎng)法是根據(jù)腫瘤細(xì)胞易貼壁而淋巴細(xì)胞不易貼壁的原理，將經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離得到的淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞混合培養(yǎng)并根據(jù)貼壁特性進(jìn)行分離獲得，由于細(xì)胞需要在體外傳代培養(yǎng)，其表面抗原可能發(fā)生變化；采用免疫磁珠法較為先進(jìn)，但需要特異性腫瘤細(xì)胞抗體，價格較昂貴，成本較高，不利于規(guī)模化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有高效腫瘤細(xì)胞致敏的DC腫瘤疫苗及其制備方法，特別是采用胸、腹水腫瘤細(xì)胞致敏的DC腫瘤疫苗及其制備方法。
[0007]本發(fā)明是通過下面的技術(shù)方案實現(xiàn)上述發(fā)明目的的。
[0008]一方面，本方法采用胸、腹水腫瘤細(xì)胞抗原，與腫瘤特異性抗原相比，該胸、腹水中了細(xì)胞抗原中抗原肽豐富，有效避免了腫瘤細(xì)胞可能對特異性單一抗原的抵抗作用；與腫瘤細(xì)胞株抗原相比，由于胸、腹水腫瘤細(xì)胞是原代細(xì)胞而避免了腫瘤細(xì)胞株在體外傳代過程中可能產(chǎn)生表面抗原結(jié)構(gòu)的變異，此外采用患者胸、腹水中特異性腫瘤細(xì)胞裂解液作為腫瘤抗原，效應(yīng)T細(xì)胞的殺傷活性更強；且原料中不添加額外的化學(xué)藥物，安全性更高。
[0009]另一方面，本發(fā)明在胸、腹水腫瘤抗原制備過程中，使用蛋白酶抑制劑避免了在體外裂解胸、腹水腫瘤細(xì)胞過程中胸、腹水腫瘤細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶釋放到胞外降解胸、腹水腫瘤細(xì)胞抗原蛋白，最大程度上保持了胸、腹水腫瘤細(xì)胞抗原的完整性，對腫瘤細(xì)胞抗原起到很好的保護(hù)作用，進(jìn)而可以通過負(fù)載DC細(xì)胞制備具有高效殺瘤活性的胸、腹水腫瘤細(xì)胞致敏的DC腫瘤疫苗。
[0010]第三方面，使用細(xì)胞因子刺激增加成熟的樹突狀細(xì)胞數(shù)目，對治療效果的提高起著關(guān)鍵作用，優(yōu)選使用rhTNF-α，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和/或白細(xì)胞介素，有效增強樹突狀細(xì)胞擴增倍數(shù)，成熟DC細(xì)胞的成熟度> 86 %，解決了現(xiàn)有DC細(xì)胞制備過程中細(xì)胞數(shù)量少、增殖緩慢等問題。
[0011]相對于原有DC培養(yǎng)技術(shù)用血量多，擴增倍數(shù)少、擴增效率不高等情況，本發(fā)明提供的這種新的腫瘤樹突狀細(xì)胞治療性疫苗的制備方法用于腫瘤的治療及預(yù)防，具有用血量少、制備方法工序簡便、細(xì)胞增殖數(shù)量多、特異性殺傷活性強、療效好等特點。由于DC在人外周血中比例較低，因此提高擴增倍數(shù)，增加成熟的樹突狀細(xì)胞數(shù)目，對治療效果的提高起著關(guān)鍵作用。
[0012]本發(fā)明提供了一種DC腫瘤疫苗，其特征在于所述疫苗為腫瘤治療性疫苗。所述的DC腫瘤疫苗，其特征在于所述腫瘤包括:胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌或食管癌等。
[0013]本發(fā)明采用的DC細(xì)胞，可通過外周血直接采取獲得，可通過外周血單個核細(xì)胞分離獲得，可通過骨髓或其他組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化獲得，還可通過HLA基因半相合或全相合同種異體外周血、外周血單個核細(xì)胞、骨髓造血細(xì)胞或其他組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞分離或定向分化獲得。
[0014]本發(fā)明還提供了一種腫瘤細(xì)胞致敏DC腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于:用含抑肽酶和亮抑蛋白酶肽的RPM1-1640重懸胸、腹水離心過濾后的單細(xì)胞懸液；將貼壁培養(yǎng)的DC細(xì)胞加入上述腫瘤相關(guān)全抗原單細(xì)胞懸液，加入rhTNF- a ,GM-CSF和/或IL，繼續(xù)培養(yǎng)，得到腫瘤細(xì)胞致敏DC腫瘤疫苗。
[0015]在本發(fā)明的實施方案中，腫瘤細(xì)胞致敏DC腫瘤疫苗的制備方法特征在于包括以下步驟:
[0016]1.抗原的制備:包括如下步驟:
[0017](I)取胸、腹水離心，用生理鹽水洗滌，經(jīng)過濾后收取單細(xì)胞懸液；
[0018](2)用含抑肽酶(Aprotinin)和亮抑蛋白酶肽(Leupeptin)的RPM1-1640重懸步驟⑴得到的細(xì)胞；
[0019]2.DC疫苗的制備:將貼壁培養(yǎng)的DC細(xì)胞加入上述步驟(2)獲得的腫瘤相關(guān)全抗原細(xì)胞，加入rhTNF- a、GM-CSF和/或IL，繼續(xù)培養(yǎng)，得到腫瘤細(xì)胞致敏DC腫瘤疫苗。在優(yōu)選的實施方案中，用rhTNF-α刺激加入腫瘤相關(guān)全抗原的貼壁培養(yǎng)的DC細(xì)胞。在另一個優(yōu)選的實施方案中，用GM-CSF，IL-2和IL-4刺激加入腫瘤相關(guān)全抗原的貼壁培養(yǎng)的DC細(xì)胞。
[0020]優(yōu)選地，所述抑肽酶終濃度為0.05-2.0mg/ml，亮抑蛋白酶肽終濃度為0.05-2.0mg/ml。所述 rhTNF- α 濃度為 50_2000U/ml，GM-CSF 濃度為 500U/ml-2000U/ml，IL 是 IL-2 和 / 或 IL-4，濃度為 50U/ml-2000U/ml。
[0021]在優(yōu)選的實施方案中，用濃度為50_2000U/ml的rhTNF-α刺激加入腫瘤相關(guān)全抗原的貼壁培養(yǎng)的DC細(xì)胞。在另一個優(yōu)選的實施方案中，用濃度為500U/ml-2000U/ml的GM-CSF，濃度為 50U/ml-2000U/ml 的 IL-2 和濃度為 500U/ml-2000U/ml 的 IL-4 刺激加入腫瘤相關(guān)全抗原的貼壁培養(yǎng)的DC細(xì)胞。
[0022]在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，腫瘤細(xì)胞致敏DC腫瘤疫苗的制備方法特征在于包括以下步驟:
[0023]1.抗原的制備:包括如下步驟:
[0024](I)取胸、腹水離心，用生理鹽水洗滌，經(jīng)過濾后收取單細(xì)胞懸液；
[0025](2)用含終濃度為0.05-2.0mg/ml的抑肽酶，終濃度為0.05-2.0mg/ml亮抑蛋白酶肽的RPM1-1640重懸步驟(I)得到的細(xì)胞；
[0026](3)將步驟(2)的細(xì)胞速凍后置于水浴中，待混合液完全溶化后，再次抗原制備，反復(fù)3-5次；
[0027](4)將步驟(3)的細(xì)胞經(jīng)60-Gy輻照后，將腫瘤細(xì)胞裂解物離心，收取上清；
[0028](5)將步驟(4)獲得的腫瘤細(xì)胞凍溶上清液過濾除菌；
[0029]2.DC疫苗的制備:將貼壁培養(yǎng)的DC細(xì)胞加入腫瘤相關(guān)全抗原，加入rhTNF-α、GM-CSF和/或IL，其中所述rhTNF- α濃度優(yōu)選為50_2000U/ml，GM-CSF濃度優(yōu)選為500U/ml-2000U/ml，IL優(yōu)選是IL-2和/或IL-4，濃度優(yōu)選為50U/ml-2000U/ml，繼續(xù)培養(yǎng)，得到腫瘤細(xì)胞致敏DC腫瘤疫苗。在優(yōu)選的實施方案中，用濃度為50-2000U/ml的rhTNF-α刺激加入腫瘤相關(guān)全抗原的貼壁培養(yǎng)的DC細(xì)胞。在另一個優(yōu)選的實施方案中，用濃度為500U/ml-2000U/ml 的 GM-CSF，濃度為 50