苗的制備:具體步驟是:
[0066]步驟2獲得的上述貼壁培養(yǎng)的DC細(xì)胞于第6天加入步驟I獲得的腫瘤相關(guān)全抗原50ug/ml,次日加入濃度為1000U/ml的rhTNF- α,繼續(xù)培養(yǎng)24h后檢測成熟DC細(xì)胞的數(shù)量和成熟度。
[0067]結(jié)果顯示:成熟的DC數(shù)量至少達(dá)到1.5X107,成熟樹突狀細(xì)胞的成熟度>86% (如圖1所示)。
[0068]HLA-DR+CDllc+:93.56%
[0069]CD40+CDllc+:85.41%
[0070]CD80+CDllc+:87.34%
[0071]CD83+CDllc+:82.82%
[0072]CD86+CD1 Ic+:93.40%
[0073]實(shí)施例2活性腫瘤細(xì)胞致敏的DC腫瘤疫苗的制備
[0074]根據(jù)實(shí)施例1步驟I通過胸腹水離心獲得細(xì)胞抗原。根據(jù)實(shí)施例1步驟2分離和獲取DC細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞致敏DC腫瘤疫苗的制備具體步驟如下:
[0075]在步驟2制備獲得的DC細(xì)胞中加入無血清培養(yǎng)基,所述無血清培養(yǎng)基包括以下含量的成分:RPM1-1640培養(yǎng)基(購自美國Gibco公司,貨號:31800-105),其中添加濃度為5mM的L-谷氨酰胺,濃度為10mg/L的重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白,濃度為8g/L的重組人白蛋白,濃度為5mg/L的重組人胰島素,濃度為50mg/L的維生素PP,濃度為30mg/L的維生素C,濃度為30ng/mL的氫化可的松,濃度為5mg/L微量元素砸。所述無血清培養(yǎng)基按照如下含量添加如下組分:含有3%的血漿,1000U/ml的重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF),1000U/ml的白細(xì)胞介素-4 (IL-4),1000U/ml的白細(xì)胞介素_2 (IL-2);進(jìn)一步向上述培養(yǎng)液中添加3%血漿;作為血清,使用胎牛血清(FCS)。
[0076]同現(xiàn)有技術(shù)相比,上述制備的DC腫瘤疫苗有效增強(qiáng)了樹突狀細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù),成熟的樹突狀細(xì)胞數(shù)量至少達(dá)到1.5X107,成熟DC細(xì)胞的成熟度> 86%。
[0077]實(shí)施例3 T細(xì)胞活化功能鑒定
[0078]取實(shí)施例1獲得的非成熟imDC、成熟mDC以及自體和異體T淋巴細(xì)胞,分別按效靶比(E: T) =20: I的比例加入96孔板中,于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中共同孵育24h后加入CCK-8試劑(Cell Counting Kit,CCK_8,購自日本同仁CCK8試劑盒,產(chǎn)品型號:CK04)20ul/孔,培養(yǎng)3h后,于酶標(biāo)儀450波長測定OD值。
[0079]結(jié)果顯示:成熟DC細(xì)胞(mDC)能有效激活自體或異體T淋巴細(xì)胞(如圖2所示)。
[0080]實(shí)施例4 DC疫苗的抗腫瘤效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研宄
[0081]如下進(jìn)行DC誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL(cytotoxic lymphocyte,CTL)實(shí)驗(yàn):
[0082]將實(shí)施例1得到的負(fù)載腫瘤相關(guān)全抗原的DC細(xì)胞分別與自體或異體T淋巴細(xì)胞按照 I: 5、1: 10、1: 20、1: 40 分組混合,在 RPM1-1640 培養(yǎng)基中加入 GM-CSF、IL-4、IL-2培養(yǎng)I周,每3天半量換液,維持細(xì)胞濃度為IXlO6Ail ;培養(yǎng)I周后按以上比例加入DC細(xì)胞再培養(yǎng)48h后獲得腫瘤特異性CTL細(xì)胞(結(jié)果見圖3)。
[0083]取培養(yǎng)48h后的CTL上清液,按照ELISA試劑盒說明,應(yīng)用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定A值,計算各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-y的平均濃度,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算IFN-y的分泌量。
[0084]實(shí)施例5 DC誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL致敏DC腫瘤疫苗的體外抗腫瘤作用試驗(yàn)
[0085]取96孔板加入原代培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞lX104/100ul/孔,培養(yǎng)3_4天后按E: T =20: I的比例加入CTL,同時設(shè)單一靶細(xì)胞、單一效應(yīng)細(xì)胞及空白對照,每組設(shè)3個復(fù)孔,培養(yǎng)24h后加入CCK-8試劑20ul/孔,共同培養(yǎng)3h后用酶標(biāo)儀于450nm波長處測定A值,按照如下公式計算CTL對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷效率(% )。
[0086]殺傷效率(% ) = [1_(實(shí)驗(yàn)孔OD值-效應(yīng)孔OD值/靶細(xì)胞孔OD值)]X100%
[0087]結(jié)果顯示:
[0088]由負(fù)載自體腫瘤相關(guān)抗原的DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的效應(yīng)CTL細(xì)胞對原代培養(yǎng)的自體腫瘤細(xì)胞的殺傷效率為85.67% ±0.56%,顯著高于對異體原代腫瘤細(xì)胞的殺傷效率(20.05%±0.67% ;P < 0.01)。
【主權(quán)項】
1.一種腫瘤細(xì)胞致敏DC腫瘤疫苗的制備方法,其特征在于:用含抑肽酶和亮抑蛋白酶肽的RPM1-1640重懸胸腹水離心過濾后的單細(xì)胞懸液;將貼壁培養(yǎng)的DC細(xì)胞加入上述腫瘤相關(guān)全抗原單細(xì)胞懸液,加入rhTNF- a ,GM-CSF和/或IL進(jìn)行刺激,繼續(xù)培養(yǎng),得到腫瘤細(xì)胞致敏DC腫瘤疫苗。
2.一種權(quán)利要求1的腫瘤細(xì)胞致敏DC腫瘤疫苗的制備方法,其特征在于所述抑肽酶終濃度為0.05-2.0mg/ml,亮抑蛋白酶肽終濃度為0.05-2.0mg/ml。
3.—種權(quán)利要求1的腫瘤細(xì)胞致敏DC腫瘤疫苗的制備方法,其特征在于所述rhTNF- α 濃度為 50-2000U/ml,GM-CSF 濃度為 500U/ml-2000U/ml,IL 是 IL-2 和 / 或 IL-4,濃度為 50U/ml-2000U/ml。
4.一種權(quán)利要求3的腫瘤細(xì)胞致敏DC腫瘤疫苗的制備方法,其特征在于:用濃度為50-2000U/ml的rhTNF- α刺激加入腫瘤相關(guān)全抗原的貼壁培養(yǎng)的DC細(xì)胞。
5.一種權(quán)利要求3的腫瘤細(xì)胞致敏DC腫瘤疫苗的制備方法,其特征在于:用濃度為500U/ml-2000U/ml 的 GM-CSF,濃度為 50U/ml-2000U/ml 的 IL-2 和濃度為 500U/ml_2000U/ml的IL-4刺激加入腫瘤相關(guān)全抗原的貼壁培養(yǎng)的DC細(xì)胞。
6.一種權(quán)利要求1的腫瘤細(xì)胞致敏DC腫瘤疫苗的制備方法,其特征在于包括如下步驟: -抗原的制備:包括 (1)取胸、腹水離心,用生理鹽水洗滌,經(jīng)過濾后收取單細(xì)胞懸液; (2)用含抑肽酶和亮抑蛋白酶肽的RPM1-1640重懸步驟(I)得到的細(xì)胞;_DC疫苗的制備:將貼壁培養(yǎng)的DC細(xì)胞加入步驟(2)得到的腫瘤相關(guān)全抗原細(xì)胞,加入rhTNF-α、GM-CSF和/或IL,繼續(xù)培養(yǎng),得到腫瘤細(xì)胞致敏DC腫瘤疫苗。
7.一種權(quán)利要求1-6任一項的腫瘤細(xì)胞致敏DC腫瘤疫苗的制備方法獲得的DC腫瘤疫苗。
8.—種DC細(xì)胞培養(yǎng)基,其特征在于在無血清培養(yǎng)基中含有含量如下的組分:2-10%血漿;500U/ml-2000U/ml的重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子;500U/ml-2000U/ml的白細(xì)胞介素-4 ;50U/ml-2000U/ml的白細(xì)胞介素_2。
9.一種權(quán)利要求8所述的DC細(xì)胞培養(yǎng)基,其特征在于所述無血清培養(yǎng)基包括以下含量的成分:RPM1-1640培養(yǎng)基,其中添加濃度為1-1OmM的L-谷氨酰胺,濃度為5_20mg/L的重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白,濃度為l-10g/L的重組人白蛋白,濃度為l-10mg/L的重組人胰島素,濃度為10-100mg/L的維生素PP,濃度為10_50mg/L的維生素C,濃度為l_50ng/mL的氫化可的松,濃度為l-10mg/L微量元素砸。
10.一種生物制劑,其特征在于含有權(quán)利要求8或9的DC細(xì)胞培養(yǎng)基。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種腫瘤細(xì)胞致敏DC腫瘤疫苗及其制備方法。用含抑肽酶和亮抑蛋白酶肽的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸胸腹水離心過濾后的單細(xì)胞懸液,將貼壁培養(yǎng)的DC細(xì)胞加入上述腫瘤相關(guān)全抗原細(xì)胞,加入rhTNF-α、GM-CSF和/或IL,繼續(xù)培養(yǎng),得到腫瘤細(xì)胞致敏DC腫瘤疫苗。
【IPC分類】A61P35-00, A61K39-00
【公開號】CN104815323
【申請?zhí)枴緾N201510140870
【發(fā)明人】盧戌, 劉靜維, 王躍, 楊照敏
【申請人】北京康愛瑞浩生物科技股份有限公司
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2015年3月27日