專利名稱：具有抗腫瘤活性的疫苗組合物及其在惡性疾病治療方面的應(yīng)用的制作方法
本項發(fā)明涉及免疫學(xué)的領(lǐng)域，尤其是對自身表皮生長因子(EGF)能夠產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)的疫苗組合物。
本項發(fā)明的一個重要目標(biāo)是獲得一種疫苗組合物，它能夠?qū)GF依賴性的惡性腫瘤產(chǎn)生主動的免疫治療，它能夠抑制這些腫瘤的增殖，因此，它被用作惡性腫瘤及其它EGF相關(guān)疾病的治療。因此，本項發(fā)明也與腫瘤治療相關(guān)。
表皮生長因子，一種能夠刺激上皮細(xì)胞增殖的多肽，被認(rèn)為是一種在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中起作用的生長因子，其作用的發(fā)揮主要是通過其細(xì)胞膜受體。
表皮生長因子(EGF)是一53個氨基酸組成的多肽，其分子量約為6045D(道爾頓)。它首先是從鼠的下頜下腺被分離和純化(Co-hen S.J.Biol Chem(1962)237，1.555)，其后從人尿液中獲得一個相似的分子(Cohen S.人表皮生長因子分離及其化學(xué)和生物學(xué)特性PNAS USA 72，1975，1317)。
EGF能夠在體內(nèi)外刺激上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的增殖(CohenS.，Carpenten G.，PN AS USA 72，1317，1975)，對某些乳腺癌細(xì)胞系EGF能行使一個特異性的刺激作用(Osborne C.K.etals Can Res.40，2361(1980))。在乳腺分化過程中，EGF的作用，主要是對小葉乳泡系統(tǒng)的發(fā)展起作用已經(jīng)被證實(Tonelli C.J.Nature(1980)285，250-252)。
此種生物調(diào)節(jié)活性的發(fā)揮是通過一種細(xì)胞膜受體(EGF-R)來實現(xiàn)的，該受體為一個由1186個氨基酸組成的糖蛋白，分子量約為170KD，其基因已被克隆并且進(jìn)行了序列分析。此受體的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域與酪氨酸特異性的蛋白激酶活性相關(guān)，此酶和與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程有關(guān)的癌基因產(chǎn)物v-erb-B具有結(jié)構(gòu)上的同源性(HeldinC.H.Cell 37，9-20(1984))。
EGF和其受體組成一個高度特異性的分子復(fù)合體，它們之間的相互作用形成了細(xì)胞生長調(diào)節(jié)的重要機(jī)制。
高水平的EGF-R已經(jīng)在上皮起源的惡性腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，例如，乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、陰道癌、結(jié)腸癌、肺癌，腦癌和食管癌。EGF及其受體在調(diào)節(jié)腫瘤生長過程中的作用目前尚不清楚，有觀點認(rèn)為，ECF-R在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)提供了一種自分泌式的生長刺激機(jī)制，這種刺激導(dǎo)致了非控制性的增殖(Schlessinger J.，Schreiber A.B.，Levi A.，Liberman T.，Yarden Y.Cnt.Rev.Biochem 1983，14(2)93-111)。
EGF-R在腫瘤細(xì)胞中的存在已經(jīng)被證明是人類乳腺癌預(yù)后不良的指標(biāo)。大約40％的乳腺腫瘤顯示有對EGF具有高度親和力的特異性的結(jié)合位點，也有在有與雌激素受體相反的關(guān)系，它指示EGF-R作為一種反分化的標(biāo)記或者惡性細(xì)胞增殖潛能的指示器(Perez R.，Pascual M.R.，Macias A.，Lage A.，乳腺癌研究與治療4，189-193，1984)。
也已經(jīng)有報道在局部的神經(jīng)節(jié)轉(zhuǎn)移灶中EGF-R的表達(dá)要高于原發(fā)的乳腺腫瘤組織(Sainsbury J.R.，et al(1985)Lancet1(8，425)，364-366)，并且有報道說，在乳腺腫瘤細(xì)胞不同的組織嚴(yán)型之間該受體的表達(dá)也存在著不同，這也使得它們的存在是預(yù)后不良的一個信號(Macias A.，et al(1986)，AnticancerRes.6849-852)。
先前用Balb-C小鼠的艾化腹水瘤(EAT)模型的研究證明EGF在體內(nèi)的抑制作用(Lombardero J.，et als Neoplas-ma33，4(1987))，因此，認(rèn)為此分子作為一個生物反應(yīng)的調(diào)節(jié)物是可能的。
早先的研究已經(jīng)報道，在EGF依賴性的腫瘤細(xì)胞膜上存在著EGF的前體分子。該發(fā)明的作者報道，一個重要的事實是該分子也是自身抗體作用的靶分子(Patent Application Cuba No.113/93)。來自不同的研究結(jié)果顯示，EGF/EGF-R系統(tǒng)是治療作用可能的靶。
應(yīng)用抗EGF-R的單克隆抗體進(jìn)行被動免疫治療，許多研究表明，該受體的抗體的特異性識別抑制了EGF的結(jié)合，同時對惡性細(xì)胞的促有絲分裂刺激也產(chǎn)生了抑制效應(yīng)(SATO J.D.，et al.Metliods in Enzymology，Vol 146 pp63-81(1987))。然而，這些鼠源性的抗體通常將產(chǎn)生人抗鼠的抗體反應(yīng)(HAMA)。
直到本項發(fā)明為止，沒胡一項能夠抑制細(xì)胞增殖的主動免疫治療來治療EGF依賴性的腫瘤的方案被提出，因為先前的觀念一致認(rèn)為“自身”的分子不將誘導(dǎo)任何免疫反應(yīng)，因為機(jī)體是自我耐受性的。
本項發(fā)明提供了一種包含有被連接在一個載體蛋白分子上的自體EGF的疫苗組合物，通過自身免疫效應(yīng)，該組合物能夠抑制EGF依賴性的腫瘤的生長，而不產(chǎn)生那種異源蛋白進(jìn)入人體所產(chǎn)生的副效應(yīng)。
這種疫苗組合物可用于EGF依賴性腫瘤或EGF相關(guān)的惡性疾病的治療。
在此說明，在該設(shè)計中EGF應(yīng)該被理解為包含其任意片段或者其衍生物，它們與其原始物具有相似的免疫學(xué)特性或者效應(yīng)。衍生物包括但不僅僅限于常規(guī)的氨基酸的替代，氨基酸位點直接的置換以便增加穩(wěn)定性或者活性和化學(xué)的修飾等等。I.免疫原制劑的獲得要獲得兩種制劑。第一種是連接在蛋白載體上的鼠EGF(mu-EGF)，第二種是人重組EGF(hu-rec-EGF)(National Medica-ment Register Office from Cuba，HEBERMIN，No.1266)，它也被連接在一個載體蛋白分子上。
包含有連接在載體蛋白上的hu-rec-EGF的制劑只用在非人的靈長動物和人。同時輔以適應(yīng)的免疫佐劑。
被連接在蛋白載體上的mu-EGF在小鼠動物模型上使用，以便確定包含自身EGF分子的制劑的免疫原性和抗瘤作用。
結(jié)合的hu-EGF載體蛋白的免疫原性研究用靈長動物進(jìn)行實驗，因為hu-EGF與靈長類EGF非常相似，盡管它被認(rèn)作一個自體分子。允許證實自體分子免疫原反應(yīng)的結(jié)果能夠被得出。
制劑準(zhǔn)備如下，溶解于PBS/10mM MgCl2中的鼠EGF或者h(yuǎn)u-rec-EGF溶液與用同樣溶劑溶解的載體蛋白溶液，以1-5摩爾EGF/每摩爾蛋白的比率相混合。
然后再加入0.5％戊二醛，使終濃度為0.1％-0.05％之間。
混合物在室溫下溫育1-3小時，然后用PBS/MgCl210mM溶液進(jìn)行透析，至少更換透析液三次。結(jié)合物特性鑒定。
結(jié)合效率試驗和免疫原性保持試驗，通過ELISA測定進(jìn)行。
經(jīng)PVC(NUNC)活化的ELISA平板用50μl抗載體蛋白的抗血清進(jìn)行包被，濃度在1-10μg/ml。例如用霍亂毒素B(CTB)作為載體，平板用神經(jīng)節(jié)苷脂GM1進(jìn)行包被。
接著用PBS/Tween洗三次，然后再用0.5-1％的BSA溶液(溶于PBS/Tween中)封閉，37℃溫育30分鐘至一小時。然后把待測定的結(jié)合物用0.1-0.001的稀釋度加到平板上，每孔50μl，37℃溫育1-2小時。
接著用1∶500～1∶1000的稀釋度加鼠抗hu-rec-EGF抗血清，每孔50μl，37℃溫育30分鐘至1小時。
最后，用1∶500～1∶1000稀釋度加抗鼠堿性磷酸酶抗血清，每孔50μl，37℃溫育30分鐘至一小時。
用濃度為1mg/ml的對硝基苯磷酸酯(溶于二乙醇胺中)黑色，每孔加50μl，37℃溫充30分鐘。用ELISA平板讀數(shù)儀測定405nm波長時的光密度(OD值)。
結(jié)果表示分子的活性和結(jié)合物的效率，因為結(jié)合物保持有對包被平板的分子的識別位點，該分子特異性地識別載體蛋白，同時，結(jié)合物又為抗EGF的抗血清所識別。II.包含mu-EGF的制劑的效能特征前臨床研究IIa)內(nèi)源性的EGF的免疫原性小鼠自身免疫性的誘導(dǎo)。
為了證實上述包含mu-EGF的免疫原制劑誘導(dǎo)抗內(nèi)源性EGF的自身免疫的能力，在Balblc小鼠中進(jìn)行了分組實驗。
各組動物接種不同的劑量，范圍在每只小鼠每周注射50-100μg的mu-EGF/載體蛋白，持續(xù)4-6周。
第一周，免疫原制劑與弗氏完全佐劑按1∶1的比率配制，隨后的劑量都是與弗氏不完全佐劑來配制。
在對照組中也進(jìn)行同樣的程序，只是動物僅用佐劑來處理。在最后一次免疫接種以后一周，從實驗動物采血，分離血清，抗mu-EGF血清抗體效價用ELISA技術(shù)進(jìn)行測定。IIb)hu-rec-EGF的免疫原性為了證實hu-rec-EGF對小鼠的免疫原性，同時為了顯示抗hu-rec-EGF抗體識別mu-EGF的能力，在Balblc小鼠中進(jìn)行了實驗。
動物分組以后，按每只小鼠每周注射50-100μg的hu-rec-EGF/載體蛋白，每組接種不同的劑量，持續(xù)4-6周。
第一周，免疫原制劑與弗氏完全佐劑按1∶1的比率配制。隨后的各劑量與弗氏不完全佐劑配制。
相同的程序也在對照組中進(jìn)行，只是動物僅用佐劑來處理。
在最后一次免疫接種以后一周，從動物采血，分離血清，抗mu-EGF抗體的效價用ELISA技術(shù)進(jìn)行測定。IIc)抗腫瘤活性。
本實驗的主要目的是為了確定抗自身EGF的免疫反應(yīng)是否能夠在EGF依賴性的腫瘤中引出抗腫瘤作用。
根據(jù)以上技術(shù)，在確定具有高滴度抗體的動物體內(nèi)接種艾氏腹水瘤(EAT)，接種的細(xì)胞濃度為每只動物20-200。萬對照組按同樣的方法進(jìn)行處理。
觀察動物移植瘤生長和動物生存情況。II.免疫反應(yīng)的鑒定IIIa)抗體反應(yīng)的同型性為了證實用自身EGF免疫接種小鼠所獲得的自身免疫反應(yīng)是一種IgM或IgG同型抗體的反應(yīng)，進(jìn)行了ELISA測定，按條款I(lǐng)Ia)和b)描述的方法檢測了用EGF免疫動物的血清。對于IgM，用抗IgM的抗血清與樣品一起溫育，檢測IgG的特征時用抗IgG抗血清與樣品一起溫育。IIIb)免疫反應(yīng)記憶的鑒定開發(fā)一種能夠用于主動免疫治療的疫苗產(chǎn)品，必須確定該產(chǎn)品誘導(dǎo)免疫記憶的能力，如果免疫記憶被誘導(dǎo)出，要能夠確定該記憶的持久性。
這些信息使得該產(chǎn)品的免疫計劃能夠被正確地設(shè)計，并且能夠被很好地完成。
用hu-rec-EGF免疫各組小鼠，每只動物用5-100μg的hu-rec-EGF，hu-rec-EGF與弗氏完全佐劑按1∶1比率配制。
在不同的動物組，抗mu-EGF的抗本產(chǎn)生過程的動力學(xué)被研究。動力學(xué)研究在首次免疫接種后和當(dāng)抗體滴度下降時再加強(qiáng)免疫接種后進(jìn)行?？贵w水平用ELISA技術(shù)測定。IV.在非人靈長動物進(jìn)行免疫原性研究免疫原制劑的免疫原性的標(biāo)準(zhǔn)必須建立在從非人靈長類動物獲得的實驗結(jié)果之上，因為它們與人類的親緣關(guān)系最近。
用包含hu-rec-EGF免疫原制劑免疫一組靈長動物，劑量為500μg，hu-rec-EGF被結(jié)合在破傷風(fēng)類毒素上，并且與免疫佐劑一起使用。最后一次免疫接種后采血，測定抗hu-EGF抗全效價。
實施例1在EGF依賴性腫瘤細(xì)胞膜上有EGF前體分子存在的研究本研究所用技術(shù)為蛋白印跡技術(shù)。所用樣品為，5例不同階段的乳腺導(dǎo)管癌，1例頭頸部腫瘤，4例纖維發(fā)育不良癥，5例正常樣品作為對照。
從樣品分離細(xì)胞膜，按Grimaux M.的操作程序(GrimauxM.Rev Neurol，1988，144101-103)。
電泳條件為250V，10mA，3DW，15℃，150Vh。分子量標(biāo)準(zhǔn)范圍為14,300D(溶菌酶)～340,000D(a2巨球蛋白)。
用一Phast系統(tǒng)裝置在轉(zhuǎn)移緩沖液中把電泳分離開的蛋白帶轉(zhuǎn)移到0.45μm的硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)移完成后，膜用10％脫脂乳封閉過夜，不斷振搖。
用緩沖液洗滌三次后，加入一鼠抗人EGF單克隆抗全，孵育4小時。
洗灑三次，加入生物素?；目故罂谷?，孵育一小時。加入過氧化物酶鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合物溫育1小時后，加入二氨基聯(lián)苯胺和過氧化氫顯色。
結(jié)果顯示，來源于正常組織的樣品，在高分子量的區(qū)段沒有出現(xiàn)條帶。而來源于乳腺有病理學(xué)改變的樣品(發(fā)育不良癥和腫瘤)在高分子量的區(qū)段出現(xiàn)彌散型的條帶。這就是在腫瘤細(xì)胞膜上存在高分子量的EGF前體的實驗證據(jù)。實施例2制備mu-EGF/CTB結(jié)合物1毫升濃度為1mg/ml的mu-EGF(溶于PBS/MgCl210mM溶液中)與2毫升的CTB溶液(溶于PBS/10mM MgCl2中)相混合?；旌夏枖?shù)之比為1∶1。加入3毫升0.5％戊二醛，使終濃度為0.05％。
在室溫下溫育一小時，然后用PBS/10mM MgCl2溶液進(jìn)行透析，至少更換透析液三次。實施例3mu-EGF/CTB結(jié)合體鑒定結(jié)合試驗的ELISA測定PVC活化的ELISA平板(NUNC)用50μl溶于甲醇之中的濃度為4μg/ml的神經(jīng)節(jié)苷酯GM1(能夠識別CTB分子)包被，放置通風(fēng)櫥中干燥一小時。
接著用PBS/Tween洗三次，然后用1％BSA(溶于PBS/Tween中)溶液封閉平板，37℃溫育30分鐘。
用0.1-0.001mg/ml的稀釋度把結(jié)合物加入平板，每孔50μl，37℃溫育一小時。
然后把1∶1000稀釋的鼠抗mu-EGF的抗血清加入平板.，每孔加50μl，37℃溫育一小時。
每孔加50μl抗鼠抗血清堿性磷酸酶結(jié)合物(稀釋度為1∶1000)，37℃溫育一小時。每孔再加50μl濃度為1mg/ml的對硝基苯磷酸酯(溶于二乙醇胺中)，37℃溫育30分鐘顯色，讀取405nm波長的光密度(OD)。
結(jié)果證實結(jié)合物濃度與吸收值之間直接的相互關(guān)系。顯示了結(jié)合活性和結(jié)合的效率。因為，分子保持對神經(jīng)節(jié)苷酯GM1的識別(由CTB識別)，同時也被抗mu-EGF抗血清所識別(

圖1)。實施例4自身EGF的免疫原性小鼠自身免疫的誘導(dǎo)。
為了證實包含自身EGF的免疫原制劑能夠誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)，在Balb/C小鼠進(jìn)行了實驗。
免疫接種幾組動物，每只動物每周皮下注射50μg結(jié)合的mu-EGF，持續(xù)4-6周。
第一周，免疫原制劑與弗氏完全佐劑按1∶1的比例配制，隨后的劑量與弗氏不完全佐劑配制。
對照組動物僅用佐劑處理。最后一次免疫注射后一周，采血，分離血清，用ELISA測定抗mu-EGF抗體的效價。
在包被板之中加入濃度為10μg/ml mu-EGF(用碳酸鹽碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)pH9.6)，溫育過夜。平板被洗滌以后，加入不同稀釋度的樣品，孵育1小時。加入堿性磷酸酶抗鼠抗體結(jié)合物，孵育1小時后出現(xiàn)顏色，用ELISA讀數(shù)儀讀取405nm波長的光密度。
所有被mu-EGF-CTB免疫的動物均產(chǎn)生抗mu-EGF抗體，其最高效價達(dá)1∶1000稀釋度，而對照組未出現(xiàn)抗體(圖2)。實施例5hu-rec-EGF的免疫原性小鼠自身免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)為了證實包含hu-rec-EGF的免疫原制劑能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生抗mu-EGF抗體，在Balb/C小鼠進(jìn)行了實驗。
動物進(jìn)行分組。每只動物每周皮下注射50μg的hu-rec-EGF，持續(xù)4-6周。
第一周，免疫原制劑與弗氏完全佐劑按1∶1的比率配制，隨后的劑量與弗氏不完體佐劑配制。
設(shè)置對照組。其動物僅用佐劑處理。
最后一次接種后一周，采血分離血清，用ELISA方法測定抗mu-EGF抗體效價。
實驗所用包被板用10μg/ml的mu-EGF(溶于碳酸鹽碳酸氫鹽緩沖液pH9.6)包被。溫育過夜。洗灑后加入各種稀釋度的樣品，孵育1小時。加入堿性磷酸酶抗鼠抗體結(jié)合物孵育1小時后出現(xiàn)顏色，用ELISA讀數(shù)儀讀取波長為405nm時的光密度。
所有被hu-rec-EGF免疫的動物均出現(xiàn)抗mu-EGF抗全，其最高效價達(dá)1∶20000稀釋度，而對照組無抗體出現(xiàn)(圖3)。實施例6hu-rec-EGF在氫氧化鋁制劑中的免疫原性為了證實包含hu-rec-EGF免疫原制劑在以氫氧化鋁為佐劑時能夠產(chǎn)生抗mu-EGF抗體，在Balb/C小鼠進(jìn)行實驗。
動物進(jìn)行分組。每只動物每周皮下注射一劑50μg的hu-rec-EGF(氫氧化鋁為佐劑)，持續(xù)4-6周。
設(shè)置對照組，其動物只用佐劑處理。是后一次接種后一周，采血分離血清，用ELISA方法測定抗mu-EGF抗體效價。
用在碳酸鹽碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中濃度為10μg/ml的mu-EGF包被平板過夜。洗滌后加入各種稀釋度的樣品孵育1小時。加入堿性磷酸酶抗鼠抗體結(jié)合物后1小時出現(xiàn)顏色反應(yīng)，用ELISA讀數(shù)儀讀取405nm波長時的光密度。
所有被hu-rec-EGF/Al(OH)3免疫的動物均出現(xiàn)血清抗mu-EGF抗體，其最高效價達(dá)1∶4000稀釋度。對照組無血清抗體產(chǎn)生(圖4)。實施例7抗腫瘤活性。
本實驗的主要目的是確定獲得的抗自身EGF的免疫反應(yīng)是否能夠在EGF依賴性的腫瘤引出抗腫瘤作用。
按實施例5中描述技術(shù)確定的具有高效價抗體的動物，接種艾氏腹水瘤(EAT)，每只動物按二百萬EAT細(xì)胞濃度接種。對照組(非免疫鼠)按同樣方法處理。
觀察實驗動物移植瘤生長和動物生存情況。處理組和對照組動物生存曲線如圖5所示。
生命期指數(shù)增加22.5％，并且處理組比對照組生存數(shù)的增加具有統(tǒng)計學(xué)的顯著性(按照Mantel Haenszel和Wilcoxon試驗)。實施例8按mu-EGF抗體效價與125I EGF生物學(xué)分布之間的相關(guān)性進(jìn)行本實驗的目的是為了證實在有抗mu-EGF抗體的動物與體內(nèi)無抗mu-EGF抗體的動物體內(nèi)，125I標(biāo)記的EGF存在著不同的生物學(xué)分布。
為了實現(xiàn)此目的，用4組動物(鼠)進(jìn)行實驗第1組30只帶有抗mu-EGF抗體的小鼠。
第2組30只無抗mu-EGF抗體的小鼠。
第3組30只有抗mu-EGF抗體并且?guī)AT移植瘤的小鼠。
第4組30只無抗mu-EGF抗體但有EAT移植瘤的小鼠。
在第1組和第2組在注射125I標(biāo)記的EGF后2，5，8，11，15，20，30，60，120和150分鐘分別殺死3只動物，分別從血液、肺、腎，肝和皮膚取樣，然后計數(shù)被取器官的放射活性。
實驗結(jié)果顯示不同時間125I標(biāo)記EGF蓄積情況的不同，主要分布腎和肝(圖6-a，b)，結(jié)果證實抗mu-EGF抗體的存在改變了該分子的生物學(xué)分布。
第3、4組動物，樣品取自于血液，肺，腎，肝，皮膚和腹水。分別在2，5，8，11，15，20，30，60，120和150分鐘10個時間點上殺死3只動物，計數(shù)被取器官的放射活性。
實驗結(jié)果顯示，帶有抗體的動物腹水中標(biāo)記EGF蓄積比不帶抗體的動物腹水中標(biāo)記EGF蓄積少(圖7)。結(jié)果顯示，在有抗體的動物能夠比較快地清除存在于腹水中的EGF，或者能夠限制EGF進(jìn)入腹水。實施例9免疫反應(yīng)的鑒定抗自身EGF的同型性為了確知被自身EGF免疫的小鼠所獲得的自身免疫反應(yīng)是否是產(chǎn)生同型IgM或者IgG抗體的反應(yīng)，進(jìn)行了ELISA測試，平板用10μg/ml的mu-EGF包被，每孔50μl，37℃孵育一小時。
接著加入稀釋度為1∶10～1∶1000被mu-EGF-CTB免疫的動物的血清，每孔加50μl，37℃溫育一小時。
用對應(yīng)的抗血清(分別用抗IgG、抗IgM)來檢測IgG和IgM反應(yīng)。
用溶于二乙醇胺之中濃度為1mg/ml的對硝基苯磷酸酯進(jìn)行顯色反應(yīng)。37℃溫育30分鐘后讀取405nm波長時的OD值。
在所有被處理的動物獲得了IgG反應(yīng)(圖8)。實施例10抗自身EGF免疫記憶的鑒定研究用二組動物，每組10只小鼠，用50μg hu-rec-EGF(用弗氏完全佐劑)一次免疫接種。
在第一組，研究動物抗mu-EGF抗體產(chǎn)生動力學(xué)。每4天采血一次，用ELISA技術(shù)測定抗體水平。
在第二組，參照第一組當(dāng)抗體效價下降時，再免疫接種一次，每2天采血一次，用ELISA技術(shù)測定抗體水平。
結(jié)果顯示，當(dāng)用同一制劑再次免疫動物時，能夠產(chǎn)生免疫記憶反應(yīng)(圖9)。實施例11免疫原制劑的制備hu-rec-EGF/破傷風(fēng)類毒素(TT)溶于PBS/10mM MgCl2中的hu-rec-EGF濃度為4mg/ml，溶于PBS/10mM MgCl2中的破傷風(fēng)類毒素(TT)溶液濃度為4mg/ml，把1ml hu-rec-EGF溶液與2ml TT溶液相混合，加入3ml 0.5％戊二醛，使終濃度為0.05％。
室溫下溫育1小時，然后用PBS/10mM MgCl2溶液透析，更換透析液至少三次。實施例12結(jié)合特性hu-rec-EGF/TT用ELISA測定進(jìn)行結(jié)合試驗用50μl抗TT抗血清包被平板，溫育過夜?？筎T抗血清來源于羊，濃度為10μg/ml。
用PBS/Tween法滌三次，平板再用1％BSA溶液(在PBS/Tween中)封閉，37℃溫育30分鐘。
每孔加50μl結(jié)合物，稀釋度為0.1-0.001mg/ml，37℃溫育1小時。
每孔加50μl鼠抗hu-rec-EGF抗血清，稀釋度為1∶1000，37℃溫育1小時。
然后，每孔加50μl抗鼠抗血清堿性磷酸酶結(jié)合物(稀釋度為1∶1000)，37℃溫育1小時。每孔加50μl/mg/ml的對硝基苯磷酸酯，37℃溫育30分鐘顯色，讀取波長405nm時的光密度。
結(jié)果顯示結(jié)合物濃度與吸收值之間直接的相互關(guān)系。
結(jié)果顯示結(jié)合物的活性和結(jié)合效率。因為該分子保持對抗TT抗血清的識別，同時其又被抗mu-EGF抗血清所識別(圖10)。實施列13在非人靈長動物研究連接至載體蛋白(TT)的hu-rec-EGF/TT的免疫原性研究工作用4只獼猴來開展。先提供一項臨床獸醫(yī)學(xué)檢查包括一般身體檢查胸部X光檢查血液化驗這些動物用hu-rec-EGF/TT進(jìn)行免疫，按實施例10提供的方法進(jìn)行。
分別在1，2，3，4，6和12周進(jìn)行皮下接種。第1次免疫接種輔以弗氏完全佐劑，其余各次輔以弗氏不完全佐劑。
取血，用ELISA測定抗體效價。
實驗所有包被板用10μg/ml的hu-EGF包被過夜，hu-EGF溶于碳酸鹽碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)之中。洗滌后加不同稀釋度的樣品，溫育1小時。加堿性磷酸酶抗人抗體復(fù)合物，溫育1小時后再顯色，用ELISA讀數(shù)儀讀取OD405值。
所有用hu-EGF/TT制劑免疫的動物均產(chǎn)生抗hu-EGF抗體，其最高效價達(dá)1∶20000稀釋度(圖11)。
圖1確定CTB與hu-rec-EGF之間結(jié)合效率的ELISA測定。
X軸結(jié)合物的連續(xù)稀釋度(1～0.001mg/ml)y軸波長為405nm時的光密度(OD405)(用ELISA讀數(shù)儀測定)圖25只用mu-EGF-CTB免疫的小鼠抗mu-EGF抗體效價的ELISA測定X軸抗血清稀釋度(1∶10，1∶100，1∶1000)Y軸波長為405nm時的光密度(由ELISA技術(shù)測定)曲線表示5只實驗動物的抗體效價(與同一動物免疫之前的比較)圖35只用hu-rec-EGF免疫小鼠抗mu-EGF抗體效價的ELISA測定X軸血清稀釋度1∶100，1∶1000，1∶10000，1∶20000Y軸405nm波長光密度圖45只用hu-rec-EGF(氫氧化鋁為佐劑)免疫的小鼠抗mu-EGF抗體效價的ELISA測定X軸血清稀釋度1∶100，1∶500，1∶1000，1∶2000，1∶4000，1∶8000
Y軸405nm波長光密度圖5用mu-EGF-CTB免疫后又接種了艾氏腹水瘤的動物的生存率與非免疫但接種了艾氏腹水瘤的對照動物生存率的比較。
圖6ahu-rec-EGF免疫小鼠與非免疫對照動物肝組織中125I標(biāo)記EGF蓄積時間圖。
圖6bhu-rec-EGF免疫小鼠與非免疫對照小鼠腎組織中125I標(biāo)記EGF蓄積時間圖。
圖7hu-rec-EGF免疫并且?guī)в蠩AT移植瘤動物腹水中125I標(biāo)記mu-EGF蓄積時間圖。
圖8mu-EGF-CTB免疫動物的免疫反應(yīng)的IgG和IgMELISA測定。
圖9hu-rec-EGF免疫動物抗mu-EGF抗體(IgG)反應(yīng)動力學(xué)(免疫記憶)。
X軸時間(無數(shù))Y軸抗體效價的反對數(shù)(平均值)圖10破傷風(fēng)類毒系與hu-rec-EGF結(jié)合效率的ELISA測定X軸結(jié)合物的稀釋度Y軸405nm波長的光密度(OD405)圖11hu-rec-EGF/TT免疫非人靈長動物抗hu-rec-EGF抗體效價。
權(quán)利要求
1.結(jié)合在任何一種載體蛋白上的自身EGF疫苗組合物，它包括佐劑，能夠產(chǎn)生抗自身EGF的自身免疫反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征是含有hu-rec-EGF。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征是含有載體蛋白CTB(霍亂毒素B)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征是含有載體蛋白破傷風(fēng)類毒素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征是含有作為載體蛋白的單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征是含有作為載體蛋白的腦膜炎球菌外膜蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征是含有作為佐劑的氫氧化鋁。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任何一項的疫苗組合物在惡性疾病治療方面的應(yīng)用。
9.哺乳動物自身EGF在制備用于治療EGF相關(guān)疾病的疫苗方面的應(yīng)用。
全文摘要
該項發(fā)明提供了EGF和由EGF組成的疫苗組合物的新的應(yīng)用。尤其是，自身EGF或者其結(jié)段或者其衍生物被用作，抗EGF依賴性的腫瘤或者EGF依賴性疾病的免疫接種法。自身EGF能夠被很好地結(jié)合在載體蛋白，例如，破傷風(fēng)類毒素或者霍亂毒素B上。根據(jù)該項發(fā)明，該疫苗組合物通常包含一個免疫佐劑，如氫氧化鋁。
文檔編號C07K16/00GK1142973SQ95115090
公開日1997年2月19日 申請日期1995年8月17日 優(yōu)先權(quán)日1993年12月9日
發(fā)明者A·B·L·達(dá)維拉, G·G·馬諾羅, B·S·拉米里, I·B·德咖道, G·N·嗄多夫, E·S·比塔納 申請人:分子免疫中心