去除重組漢遜酵母乙肝表面抗原中宿主細(xì)胞殘留dna的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種去除重組漢遜酵母乙肝表面抗原中宿主細(xì)胞殘留DNA的方法，該方法包括：步驟a、將待去除宿主細(xì)胞殘留DNA的重組漢遜酵母表達(dá)乙肝表面抗原樣品溶于含400～500mM NaCl的10～30mM PB溶液中；步驟b、以上述溶有重組漢遜酵母表達(dá)乙肝表面抗原樣品的含NaCl的PB溶液作為上樣液，利用Monoliths QA陰離子交換柱進(jìn)行層析純化，得到去除宿主細(xì)胞殘留DNA的重組漢遜酵母表達(dá)乙肝表面抗原樣品。本發(fā)明的方法能夠有效去除重組漢遜酵母乙肝表面抗原樣品中殘留DNA，使所制得疫苗滿(mǎn)足國(guó)家藥典三部(2010版)中對(duì)其中殘留DNA含量的規(guī)定。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
去除重組漢遜酵母乙肝表面抗原中宿主細(xì)胞殘留DNA的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明是關(guān)于一種去除重組漢遜酵母乙肝表面抗原中宿主細(xì)胞殘留DNA的方法， 具體而言，是一種關(guān)于利用層析方法去除重組漢遜酵母表達(dá)乙型肝炎表面抗原樣品中宿主 細(xì)胞殘留DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 重組漢遜酵母乙肝疫苗是一種乙型肝炎表面抗原(HbsAg)亞單位疫苗，它是采用 基因重組的方法將乙肝病毒表面抗原的基因進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)入漢遜酵母中、通過(guò)培養(yǎng)這 種重組酵母菌來(lái)表達(dá)乙肝表面抗原亞單位而制備的。
[0003] 重組漢遜酵母乙肝疫苗的制備技術(shù)中，純化過(guò)程是關(guān)鍵技術(shù)之一。根據(jù)國(guó)家藥典 三部（2010版)規(guī)定，重組乙型肝炎疫苗（漢遜酵母)每劑（10yg或20yg HBsAg)DNA含量不超 過(guò)10ng。目前重組漢遜酵母表達(dá)乙型肝炎表面抗原多是經(jīng)丁基-瓊脂糖(Butyl-Sepharose 4B)疏水層析精制純化，然而經(jīng)丁基-瓊脂糖疏水層析精制純化后的料液樣品中仍會(huì)殘留有 或多或少游離的宿主細(xì)胞DNA，殘留DNA濃度甚至可高達(dá)1000ng/ml，而HBsAg濃度一般為200 ~600μg/ml，這樣的純化料液用于制備疫苗，常常難以滿(mǎn)足國(guó)家藥典三部(2010版)規(guī)定的 重組乙型肝炎疫苗(漢遜酵母)每劑DNA含量不超過(guò)10ng的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種有效去除重組漢遜酵母乙肝表面抗原樣品中宿 主細(xì)胞殘留DNA的方法，以使所制得疫苗滿(mǎn)足國(guó)家藥典三部(2010版）中對(duì)其中殘留DNA含量 的規(guī)定。
[0005] 為達(dá)上述目的，本發(fā)明提供了一種去除重組漢遜酵母乙肝表面抗原中宿主細(xì)胞殘 留DNA的方法，該方法包括：
[0006] 步驟a、將待去除殘留宿主DNA的重組漢遜酵母乙肝表面抗原樣品溶于含400~ 500mM NaCl的 10~30mM PB溶液中；
[0007] 步驟b、以上述溶有重組漢遜酵母乙肝表面抗原樣品的含NaCl的PB溶液作為上樣 液，利用Monoliths QA(季胺基-聚甲基丙烯酸酯整體介質(zhì)）陰離子交換柱進(jìn)行層析純化，得 到去除殘留宿主DNA的重組漢遜酵母乙肝表面抗原樣品。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的方法中，所述待去除宿主細(xì)胞殘留DNA的重 組漢遜酵母乙肝表面抗原樣品可為經(jīng)過(guò)Buty 1-4B疏水層析精制純化后的HBsAg料液樣品。 如前所述，重組漢遜酵母乙肝表面抗原(HBsAg)經(jīng)丁基-瓊脂糖(Butyl-Sepharose 4B)疏水 層析精制純化后，料液(樣品）中盡管HBsAg純度已較高(大于99%)，但仍殘留有游離的宿主 細(xì)胞DNA(宿主細(xì)胞殘留DNA濃度為180~1000ng/ml，而HBsAg濃度為200~600μg/ml)。這樣 的純化料液用于制備疫苗，特別是用于制備HBsAg較高劑量的疫苗時(shí)，往往不能滿(mǎn)足國(guó)家藥 典三部(2010版）中對(duì)每劑DNA含量的限定要求。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方案，本發(fā)明的方法所適用的待去除宿主細(xì)胞殘留 DNA的重組漢遜酵母乙肝表面抗原樣品中，HBsAg純度大于99%。更優(yōu)選地，這樣的待去除宿 主細(xì)胞殘留DNA的重組漢遜酵母乙肝表面抗原樣品中，HBsAg濃度為200~600μg/ml，殘留宿 主DNA濃度為180~1000ng/ml，通常每10yg HBsAg中的殘留宿主DNA含量在50ng以下，例如 為10~50ng。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的去除重組漢遜酵母乙肝抗原樣品中宿主細(xì) 胞殘留DNA的方法，主要是先將樣品溶于含特定濃度NaCl的1?溶液中（或?qū)悠返脑彌_液 置換為含特定濃度NaCl的PB溶液），以此作為上樣液進(jìn)行MonolithsQA陰離子交換柱層析純 化。通常情況下，HBsAg料液樣品的原緩沖液為濃度約5.0~6.5mM的低濃度磷酸鹽緩沖液， 這樣的料液樣品如果直接用于本發(fā)明的上樣柱并不能達(dá)到良好的去除宿主細(xì)胞殘留DNA的 效果。本發(fā)明中，是以含400~500mM NaCl的10~30mM高濃度PB溶液作為上樣緩沖液。其中， NaCl的添加對(duì)于純化結(jié)果（即宿主細(xì)胞殘留DNA的去除效率)具有重要影響，在本發(fā)明所述 的NaC 1濃度范圍內(nèi)，宿主細(xì)胞殘留DNA的去除效率可達(dá)90 %或更高。本發(fā)明的步驟a中的含 400~500mM NaCl的10~30mM PB溶液，在所述1?溶液濃度范圍（10~30mM)內(nèi)，PB溶液濃度 改變對(duì)宿主細(xì)胞殘留DNA的去除效率基本無(wú)顯著影響。另，含NaCl的PB溶液的pH值可保持與 HBsAg料液樣品的原緩沖液一致，例如，所述1?溶液的pH為7.0~7.4(該范圍內(nèi)pH值的改變 對(duì)宿主細(xì)胞殘留DNA的去除效率基本無(wú)顯著影響）。此外，本發(fā)明的方法中，優(yōu)選控制上樣液 中，HBsAg濃度為200~600μg/ml，宿主細(xì)胞殘留DNA濃度為180~1000ng/ml。
[0011] 將待去除宿主細(xì)胞殘留DNA的重組漢遜酵母乙肝抗原樣品（通常為溶液形式)溶于 含特定濃度NaCl的1?溶液中的過(guò)程可以采用所屬領(lǐng)域中任何可行的辦法，例如，可采用超 濾等技術(shù)將HBsAg料液樣品中的緩沖液置換為含400~500mM NaCl的10~30mM 1?溶液，制 備得到上樣液。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明所用的Monoliths QA陰離子交換柱可為所屬 領(lǐng)域中的已有設(shè)備，例如可采用奧地利公司BIA Separation的產(chǎn)品C丨MK Mono 1 iths層析柱 (Convective interaction media Monoliths)〇
[0013] 本發(fā)明的去除重組漢遜酵母乙肝抗原樣品中宿主細(xì)胞殘留DNA的方法中，是采用 穿透模式進(jìn)行層析，即，使宿主細(xì)胞殘留DNA結(jié)合在Monolith-QA層析介質(zhì)上、而HBsAg流穿 出去，收集穿透峰得到去除宿主細(xì)胞殘留DNA的重組漢遜酵母乙肝表面抗原樣品。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的去除重組漢遜酵母乙肝抗原樣品中宿主細(xì) 胞殘留DNA的方法中，在利用Monoliths QA陰離子交換柱進(jìn)行層析純化前，可采用含400~ 500mM NaCl的10~30mM PB溶液（同樣的，所述PB溶液的pH值可為7.0~7.4)對(duì)Mono 1 i ths QA陰離子交換柱進(jìn)行平衡。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的去除重組漢遜酵母乙肝抗原樣品中宿主細(xì) 胞殘留DNA的方法中，上樣時(shí)，每毫升Monolith-QA柱，上樣量為2~15ml，優(yōu)選上樣量為2~ 10ml。每毫升Monolith-QA柱，上料速度為：1~4ml/min。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的去除重組漢遜酵母乙肝抗原樣品中宿主細(xì) 胞殘留DNA的方法，步驟b中，還可包括將收集穿透峰得到去除宿主細(xì)胞殘留DNA的重組漢遜 酵母乙肝表面抗原樣品中的緩沖液置換為原緩沖液（即待去除宿主細(xì)胞殘留DNA的重組漢 遜酵母乙肝抗原樣品料液中的緩沖液，通常為濃度約5.0~6.5mM的低濃度磷酸鹽緩沖液） 的過(guò)程。該過(guò)程也可以采用蛋白純化領(lǐng)域中任何可行的辦法，例如，可采用超濾等技術(shù)進(jìn) 行。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的去除重組漢遜酵母乙肝抗原樣品中宿主細(xì) 胞殘留DNA的方法，還可包括以步驟b所得到的去除宿主細(xì)胞殘留DNA的重組漢遜酵母乙肝 表面抗原樣品制備疫苗的過(guò)程。所述以步驟b所得到的去除宿主細(xì)胞殘留DNA的重組漢遜酵 母乙肝表面抗原樣品制備疫苗的過(guò)程可以參照所屬領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行。本發(fā)明中，能有 效去除重組漢遜酵母乙肝抗原樣品中宿主細(xì)胞殘留DNA，可使所制得疫苗滿(mǎn)足國(guó)家藥典三 部(2010版）中對(duì)其中殘留DNA含量的規(guī)定。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的去除重組漢遜酵母乙肝抗原樣品中宿主細(xì) 胞殘留DNA的方法，還可包括在步驟b后對(duì)使用過(guò)的Monoliths QA陰離子交換柱進(jìn)行洗脫和 介質(zhì)再生的過(guò)程，其中：
[0019] 洗脫液優(yōu)選為含1.9~2.1M NaCl的10~30mM PB溶液（同樣的，優(yōu)選所述PB溶液的 pH值為7.0~7.4)，洗脫流速為每ml Monolith-QA為1~4ml/min，洗脫8~12個(gè)柱床體積；
[0020] 再生過(guò)程優(yōu)選為:先用1M NaOH溶液，以lml/min流速再生1~2h;再用30%異丙醇， 以lml/min流速再生1~2h;之后用注射用水，以每ml Monolith-QA 1~4ml/min的流速?zèng)_洗 lh;接著用20%乙醇，以每ml Monolith-QA 1~4ml/min的流速?zèng)_洗（乙醇的沖洗時(shí)間保證 QA柱沖洗完全即可，通常為20min~30min)。
[0021] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明用奧地利BIA Seperation公司生產(chǎn)的 CIM' Monoliths層析柱（其具有強(qiáng)陰離子交換介質(zhì)一季胺基-聚甲基丙稀酸酯整體介質(zhì) (Monolith-QA))實(shí)施了本發(fā)明的去除重組漢遜酵母乙肝抗原樣品中宿主細(xì)胞殘留DNA的方 法。相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果顯示：當(dāng)乙型肝炎疫苗關(guān)鍵有效成分乙型肝炎表面抗原(HBsAg)溶于含特 定濃度NaCl的PB溶液中，采用穿透模式上樣(料)時(shí)，漢遜酵母宿主細(xì)胞殘留的游離DNA能夠 吸附在Monolith-QA柱上，而HBsAg不與QA柱結(jié)合而流穿出來(lái)；在80ml QA柱以800ml HBsAg 精制純化樣品（料液)上樣(料）后，不僅1 〇yg HBsAg中DNA含量小于1 Ong，而且20yg HBsAg中 DNA含量也小于10ng，可分別滿(mǎn)足制備10yg和20yg HBsAg劑量重組漢遜酵母乙肝疫苗的要 求。本發(fā)明的技術(shù)方案能夠有效解決重組漢遜酵母乙肝疫苗宿主細(xì)胞殘留DNA高于國(guó)家藥 典規(guī)定上限的問(wèn)題，對(duì)去除高HBsAg劑量(高于20yg)重組酵母乙肝疫苗中的宿主細(xì)胞殘留 DNA也提供了解決方案及借鑒。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖l:HBsAg樣品在不同NaCl濃度條件上樣的層析圖（lml Monolith-QA柱）。
[0023] 圖2:8ml Monolith-QA柱 16ml HBsAg樣品上樣層析圖。
[0024] 圖3:8ml Monolith-QA柱24ml HBsAg樣品上樣層析圖。
[0025] 圖4:8ml Monol ith-QA柱 120ml HBsAg樣品上樣層析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì) 理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。下列各實(shí)施例中未注 明具體條件的操作方法，按照常規(guī)條件或按照儀器制造廠商所建議的條件進(jìn)行。
[0027] 各實(shí)施例中所用試劑材料設(shè)備和基本方法：
[0028] 1.1試劑和材料
[0029] (1 )Butyl_4B疏水層析精制純化后的HBsAg料液樣品
[0030]由北京天壇生物制品股份有限公司（天壇生物）疫苗研究二室提供，HBsAg純度大 于99%，邢348濃度為200~60(^8/1111，0嫩濃度為180-10001^/1111，每1(^8邢848中的0嫩含量 約為10~50ng。
[0031] (2)CIM_Monoliths QA陰離子交換柱
[0032] 為奧地利公司BIA Separation產(chǎn)品，規(guī)格分別為lml、8ml、80ml。
[0033] 1.2主要儀器和設(shè)備
[0034] AlCTAPurifier 100型純化系統(tǒng)，購(gòu)自美國(guó)GE公司，用于小量介質(zhì)（lml、8ml)試 驗(yàn)，操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
[0035] 1.3上柱料液的制備
[0036] 通過(guò)購(gòu)自德國(guó)賽多利斯公司的超濾裝置100KD Vivaflow 50,將含有HBsAg料液樣 品中的緩沖液置換為含特定濃度NaCl的PB溶液，置換流速為50ml/min，從而制備得到上柱 料液(上樣液）。
[0037] 1.4層析過(guò)程
[0038] 1.4.1Monolith-QA 介質(zhì)平衡：
[0039]以與上樣液中緩沖液相同的含特定濃度NaCl的1?溶液平衡CM-Monoliths QA介 質(zhì)，依Monolith-QA柱規(guī)格設(shè)定流速（lml Monol ith-QA為4ml/min; 8ml Monol ith-QA為 lOml/min; 80ml Monolith-QA, 80ml/min)，緩沖液總量大于10個(gè)柱床體積，且基線為直線， 即可上料(樣）。
[0040] 1.4.2上料(樣）：
[0041 ] 將上柱料液(上樣液），栗入(ΠΜ-Monoliths QA柱，依Monolith-QA柱規(guī)格設(shè)定流速 (lml Monolith-QA為4ml/min;8ml Monolith-QA為10ml/min;80ml Monolith-QA,80ml/ min);待起峰時(shí)開(kāi)始收集穿透峰料液(樣品）。
[0042] 1.4.3流洗：
[0043]上料(樣)結(jié)束后，繼續(xù)以與上樣液中緩沖液相同的含特定濃度NaCl的PB溶液流洗 CIM-Mono 1 iths，依Monol ith-QA柱規(guī)格設(shè)定流速（lml Mono 1 ith-QA為4ml/min ; 8ml Monol ith-QA為lOml/min; 80ml Monol ith-QA，80ml/min)，直至穿透峰結(jié)束，結(jié)束收集，回歸 基線后方可進(jìn)行介質(zhì)洗脫和再生;測(cè)量穿透峰料液(樣品)體積。
[0044] 1.4.4洗脫和介質(zhì)再生：
[0045] 用含 2M NaCl 的20mM ΡΒ(ρΗ7· 2)，依Monol ith-QA 柱規(guī)格設(shè)定流速（lml Monol ith- QA 為4ml/min;8ml Monol ith-QA 為 10ml/min; 80ml Monol ith-QA ， 80ml/min) ， 洗脫 10 個(gè)柱床 體積；用謂他0!1以11111/1^11流速再生1-211;用30%異丙醇以11111/1^11流速再生1-211 ;用注射 用水，依Monol ith-QA柱規(guī)格設(shè)定流速（lml Monol ith-QA為4ml/min; 8ml Monol ith-QA為 lOml/min; 80ml Monol ith-QA，80ml/min)沖洗lhr;最后用20% 乙醇，依Monol ith-QA 柱規(guī)格 設(shè)定流速（lml Monolith-QA為4ml/min;8ml Monolith-QA為10ml/min;80ml Monolith-QA, 80ml/min)沖洗約20分鐘后并保存。
[0046] 1.5樣品檢測(cè)
[0047] 1 ·5· lHBsAg含量檢測(cè)（Lowry法）
[0048]蛋白質(zhì)在堿性溶液中可形成銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物，此復(fù)合物加入酚試劑后，產(chǎn)生藍(lán)色 化合物，該藍(lán)色化合物在650nm處的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，根據(jù)供試品的吸光度，計(jì) 算供試品的蛋白質(zhì)含量。
[0049] (1)加空白（去離子水）、標(biāo)準(zhǔn)品（14、29、30、43、58、72和86以8/1111)及已經(jīng)稀釋過(guò)后 的樣品各lml于試管中；
[0050] (2)各試管中各加 C液5ml，混勻室溫放置lOmin;
[0051 ] (3)各試管各加 D液0.5ml，充分混勾，室溫放置30min顯色；
[0052] (4)測(cè)定各管液體在560nm的吸光度值。
[0053] 1.5.2DNA 檢測(cè)方法(Picogreen 熒光法）
[0054] (1 )DNA標(biāo)準(zhǔn)品配制：以TE緩沖液為溶劑精確配制10μg/ml的小牛胸腺嘧啶DNA溶液 作為標(biāo)準(zhǔn)品母液，先用TE緩沖液稀釋至100ng/ml，然后連續(xù)稀釋8個(gè)稀釋度，具體如下:①10 倍稀釋至1〇〇〇1^/1111;@12.5倍稀釋至8〇1^/1111;@2倍稀釋至4〇1^/1111 ;標(biāo)準(zhǔn)品@-@均為上 一個(gè)樣品的2倍稀釋;標(biāo)準(zhǔn)品②-⑨DNA濃度分別為：80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、 5ng/ml、2 · 5ng/ml、1 · 25ng/ml和0 · 625ng/ml，共8個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品樣品；
[0055] (2)料液樣品準(zhǔn)備:準(zhǔn)備待檢測(cè)樣品的原倍樣品、10倍稀釋樣品及100倍稀釋樣品， 為供試品；
[0056] (3)熒光染料配制:TE緩沖液1:200稀釋?zhuān)∷枇康腜icoGreen染料溶于20ml溶于 TE緩沖液中；
[0057] (4)空白、供試品和熒光染料等體積混合:精密量取標(biāo)準(zhǔn)品樣品、供試品樣品溶液 各500μ1于1.5ml EP管中，分別加入新配置的熒光染料500μ1，混勻后，避光室溫反應(yīng)5min;
[0058] (5)酶標(biāo)板加樣:取上述標(biāo)準(zhǔn)品和供試品樣品反應(yīng)液250μ1加入酶標(biāo)板，各做3個(gè)復(fù) 孔；
[0059] (6)檢測(cè):激發(fā)波長(zhǎng)480nm，發(fā)射波長(zhǎng)520nm，ΤΕ緩沖液為空白對(duì)照，測(cè)得熒光強(qiáng)度為 本底；
[0060] (7)計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度對(duì)其熒光強(qiáng)度做直線回歸，求直線方程，將供試品 樣品的熒光強(qiáng)度帶入直線方程，求出樣品中的DNA含量。
[0061 ] 1.5.3計(jì)算：
[0062]
[0063]
[0064]
[0065] 實(shí)施例1
[0066] 采用100KD Vivaflow 50超濾裝置，將20121010批經(jīng)Butyl-4B疏水層析精制純化 后的冊(cè)848料液樣品以液體置換方式溶于分別含300、400、500和60011^似(：1的2011^?8 (PH7.2)中，作為上樣液；
[0067] lml規(guī)格的Monolith-QA柱，依次分別以含300、400、500和600mM NaCl的20mM PB做 為上樣緩沖液，以含2M NaCl的20mM PB(pH7.2)作為洗脫緩沖液，上樣量為5ml。分別收集穿 透峰和洗脫峰樣品，檢測(cè)穿透峰和洗脫峰中的DNA水平和HBsAg水平。
[0068] HBsAg樣品在不同NaCl濃度條件上樣的層析圖（lml Monolith-QA柱)參見(jiàn)圖1。 [0069] HBsAg樣品在不同NaCl濃度條件上樣的層析（1ml Monolith-QA柱)實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見(jiàn) 表1。
[0070] 表1、HBsAg樣品在不同NaCl濃度條件上樣的層析實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0071]
[0072] Λ: 20101010: HBsAg濃度：423 · 42μg/ml ;DNA濃度：753 · 25ng/ml
[0073] /:無(wú)法計(jì)算，無(wú)效值
[0074] 從表1中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，當(dāng)NaCl濃度為400~500mM時(shí)，穿透峰中的DNA去除 率在90 %以上，且每1 Oyg HBsAg中的DNA含量從〈1 Ong。
[0075] 實(shí)施例2
[0076] 取 20100908、20101009、20101010 和 20120605批經(jīng) Butyl-4B 疏水層析精制純化后 的HBsAg料液樣品，將樣品采用100KD Vivaflow 50超濾裝置以液體置換方式溶于含500mM NaCl的20mM PB(pH7.2)中作為上樣液，用8ml規(guī)格Monolith-QA進(jìn)行不同上樣量試驗(yàn)，上樣 量分別采取161111、241111和12〇1111，洗脫緩沖液為含21似(：1的2〇1111?8(?!17.2)，收集穿透峰溶 液并測(cè)量其體積，檢測(cè)穿透峰HBsAg濃度和DNA濃度。評(píng)價(jià)穿透峰中DNA水平及HBsAg收率和 DNA去除率。
[0077] (i)i6ml 上樣量
[0078] 16ml上樣量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見(jiàn)圖2和表2。
[0079] 表2、8ml Monolith-QA柱 16ml HBsAg樣品上樣層析結(jié)果
[0080]
[0081J 從圖2和表2結(jié)果可以看出，當(dāng)使用8ml Monolith-QA柱，將HBsAg浴于含500mM NaCl的20mM PB(pH7.2)中在QA柱上16ml進(jìn)行上樣，穿透峰中HBsAg的收率約為89.3~ 95.2%之間，穿透峰中每10yg HBsAg中的DNA約為1.0~4. lng，每20yg HBsAg中的DNA約為 2·0~8·2ng0
[0082] (2)24ml 上樣量
[0083] 24ml上樣量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見(jiàn)圖3和表3。
[0084] 表3、8ml Monolith-QA柱24ml樣品上樣層析結(jié)果
[0086] 從圖3和表3結(jié)果可以看出，當(dāng)使用8ml Monolith-QA柱，將24ml溶于含500mM NaCl 的20mM PB(pH7.2)中HBsAg精制樣品上樣至QA柱，穿透峰中HBsAg的收率約為93.6-99.3% 之間，穿透峰中每lOyg HBsAg中的DNA約為2 · 7~3 · 2ng，每20yg HBsAg中的DNA約為5 · 4~ 6·4ng〇
[0087] (3) 120ml 上樣量
[0088] 120ml上樣量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見(jiàn)圖4和表4。
[0089] 表4、8ml Monolith-QA柱 120ml HBsAg樣品上樣層析結(jié)果
[0090]
[0091] 從圖4和表4結(jié)果可以看出，用8ml Monolith-QA柱，將120ml溶于含500mM NaCl的 201^?8(口!17.2)中冊(cè)848上樣至]\1〇11〇1丨讓-04柱上，穿透峰中冊(cè)848的收率約為95.9~ 99 · 3 %之間，穿透峰中每10yg HBsAg中的DNA約為3 · 9~7 · 9ng，每20yg HBsAg中的DNA約為 7 · 8~15 · 8ng〇
[0092] 綜合表2、表3和表4顯示，上樣量為16ml、24ml、120ml (8ml Monolith-QA柱）時(shí)，每 10yg HBsAg中的DNA均低于10ng;上樣量為16ml、24ml時(shí)，每20yg HBsAg中的DNA也低于 10ng。當(dāng)8ml Monolith-QA柱上樣量為120ml時(shí)，雖然每10yg HBsAg中的DNA仍低于10ng，但 是已經(jīng)有一批樣品20100201 (表4，c)上樣后，每20yg HBsAg中的DNA超過(guò)1 Ong，為15.8ng。
[0093] 實(shí)施例3
[0094] 取20121110、20121111和20121112三批經(jīng)刖丨71-48疏水層析精制純化后的冊(cè)8八 8料液樣品，將采用超濾裝置以液體置換方式溶于含500mM NaCl的20mM 1?溶液(pH7.2)中作 為上樣液，用80ml Monolith-QA柱進(jìn)行去除游離DNA放大試驗(yàn)，上料量為800ml。
[0095]洗脫緩沖液為含2M NaCl的20mM PB(pH7.2)，收集穿透峰料液并測(cè)量其體積，檢測(cè) 穿透峰HBsAg濃度和DNA濃度。評(píng)價(jià)穿透峰中DNA水平及HBsAg收率和DNA去除率。
[0096] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見(jiàn)表5。
[0097] 表5、80ml QA柱800ml HBsAg料液上柱層析結(jié)果
[0098]
[0099] 從表5結(jié)果可以看出，用80ml Monolith-QA柱，將800ml溶于含500mM NaCl的20mM PB(pH7.2)中精制純化HBsAg料液上至Monolith-QA柱，穿透峰中HBsAg的收率約為88.8~ 90 · 8%之間，穿透峰中每10yg HBsAg中的DNA約為2 · 5~4· 5ng，每20yg HBsAg中的DNA約為 5.0~9.Ong。可以滿(mǎn)足國(guó)家藥典三部(2010版)對(duì)重組乙型肝炎疫苗(漢遜酵母)宿主細(xì)胞殘 留DNA低于每劑10ng的要求。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種去除重組漢遜酵母乙肝表面抗原中宿主細(xì)胞殘留DNA的方法，該方法包括： 步驟a、將待去除殘留宿主DNA的重組漢遜酵母乙肝表面抗原樣品溶于含400~500mM NaCl的10~30mM PB溶液中； 步驟b、以上述溶有重組漢遜酵母乙肝表面抗原樣品的含NaCl的PB溶液作為上樣液，利 用Monoliths QA陰離子交換柱進(jìn)行層析純化，得到去除宿主細(xì)胞殘留DNA的重組漢遜酵母 乙肝表面抗原樣品。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述待去除宿主細(xì)胞殘留DNA的重組漢遜酵母乙 肝表面抗原樣品為經(jīng)過(guò)Buty 1-4B疏水層析精制純化后的HBsAg料液樣品。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述待去除宿主細(xì)胞殘留DNA的重組漢遜酵母乙 肝表面抗原樣品中，HBsAg純度大于99% ;上樣液中，HBsAg濃度為200~600μg/ml，宿主細(xì)胞 殘留DNA濃度為180~1000ng/ml。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述待宿主細(xì)胞殘留DNA的重組漢遜酵母乙肝表 面抗原樣品中，每l〇yg HBsAg中的宿主細(xì)胞殘留DNA含量為10~50ng。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，步驟a中采用超濾技術(shù)將HBsAg料液樣品中的緩沖 液置換為含400~500mM NaCl的10~30mM PB溶液，制備得到上樣液;優(yōu)選地，所述PB溶液的 pH值為7.0~7.4。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟b中采用使宿主細(xì)胞殘留DNA結(jié)合在 Monolith-QA層析介質(zhì)上、而HBsAg流穿出去的穿透模式進(jìn)行層析，收集穿透峰得到去除宿 主細(xì)胞殘留DNA的重組漢遜酵母乙肝表面抗原樣品。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，每毫升Monolith-QA柱，上樣量為2~15ml，優(yōu)選上 樣量為2~10ml。8. 根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的方法，其中，每毫升Monolith-QA柱，上料速度為：1~4ml/ min〇9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，該方法還包括： 在利用Monoliths QA陰離子交換柱進(jìn)行層析純化前，采用含400~500mM NaCl的10~ 30mM 1?溶液對(duì)Monoliths QA陰離子交換柱進(jìn)行平衡的過(guò)程;優(yōu)選地，所述PB溶液的pH值為 7.0~7.4〇10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，該方法還包括在步驟b后對(duì)使用過(guò)的Mono 1 iths QA陰 離子交換柱進(jìn)行洗脫和介質(zhì)再生的過(guò)程，其中： 洗脫液為含1.9~2.11似(：1的？!17.0~7.4的10~3〇11^?8溶液，洗脫流速為每1111 Mono 1 i th-QA為1~4ml/min，洗脫8~12個(gè)柱床體積； 再生過(guò)程為：先用1M NaOH溶液，以lml/min流速再生1~2h;再用30 %異丙醇，以lml/ min流速再生1~2h;之后用注射用水，以每ml Monolith-QAl~4ml/min的流速?zèng)_洗lh;接著 用20%乙醇，以每ml Monolith-QAl~4ml/min的流速?zèng)_洗。
【文檔編號(hào)】C07K1/18GK105837667SQ201610329460
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年5月18日
【發(fā)明人】楊旭琴, 李彩梅, 張德有, 李津, 楊云凱, 趙鎧, 馬銳, 許寧, 劉英微, 王曦
【申請(qǐng)人】北京天壇生物制品股份有限公司