專(zhuān)利名稱(chēng)：(z)-2-苯基-3-(吡咯-2-基)-丙烯腈衍生物及其鹽、組合物以及制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類(lèi)丙烯腈衍生的化合物和它們?cè)谒幚砩峡梢越邮艿柠}、組合物以及
它們的合成方法和用途。
背景技術(shù)：
蛋白酪氨酸激酶是一類(lèi)能催化ATP上的磷酸基轉(zhuǎn)移到許多重要調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的酪 氨酸殘基上，使其發(fā)生磷酸化而調(diào)節(jié)這些調(diào)節(jié)蛋白的功能。根據(jù)蛋白酪氨酸激酶的結(jié)構(gòu)的 不同可分為受體型和非受體型。受體型酪氨酸激酶由含有配體結(jié)合位點(diǎn)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、 單次跨膜的疏水a(chǎn)螺旋區(qū)、含有酪氨酸蛋白激酶(RTK)活性的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成，它們的 配體是生物體內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和死亡的生長(zhǎng)因子；而非受體型蛋白酪氨酸激酶 只有具有酪氨酸蛋白激酶(RTK)活性的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成。 蛋白酪氨酸激酶在調(diào)節(jié)細(xì)胞的發(fā)育、生長(zhǎng)、分化、死亡等重要生物學(xué)過(guò)程中起著十 分重要的作用。大量的研究表明，蛋白酪氨酸激酶功能的失調(diào)和許多疾病，尤其是惡性腫瘤 的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。在惡性腫瘤中，蛋白酪氨酸激酶的異常主要表現(xiàn)在三個(gè)方面，一是受 體酪氨酸激酶以及它們的配體_生長(zhǎng)因子的高表達(dá)；二是酪氨酸激酶的突變或者缺失；三 是酪氨酸激酶和一種異常蛋白結(jié)合引起它的持續(xù)性活化。這些異常是腫瘤細(xì)胞異常增生、 異常分化、持續(xù)性生長(zhǎng)和不產(chǎn)生凋亡的重要原因之一。因此，以酪氨酸激酶為靶點(diǎn)來(lái)開(kāi)發(fā)新 一代高效、特異、低毒性的抗腫瘤藥是過(guò)去十多年抗腫瘤研發(fā)中最為熱門(mén)的領(lǐng)域，也取得了 許多令人鼓舞的成果。 美國(guó)專(zhuān)利5521184發(fā)現(xiàn)一類(lèi)嘧啶胺類(lèi)衍生物對(duì)蛋白酪氨酸激酶中的BCR/abl、 PDGFR、和c-kit都有明顯的抑制作用，其中的首選化合物伊馬替尼(imatinib)已被成功 用于臨床治療慢性粒細(xì)胞性白血病和無(wú)法用手術(shù)切除的胃腸道間質(zhì)瘤；美國(guó)專(zhuān)利5457105 發(fā)明了一類(lèi)喹唑啉類(lèi)化合物，具有抑制表皮生長(zhǎng)因子受體(印i dermal growth factor rec印tor， EGFR)酪氨酸激酶的作用，其中的首選化合物吉非替尼(gefitinib)已被成功 用于治療非小細(xì)胞性肺癌；美國(guó)專(zhuān)利5747498發(fā)明了另外一類(lèi)具有抑制EGFR酪氨酸激酶 的喹唑啉類(lèi)化合物，其中的首選化合物埃羅替尼(erlotinib)也被成功用于非小細(xì)胞性肺 癌的治療。美國(guó)專(zhuān)利7235576發(fā)明了一類(lèi)芳基脲類(lèi)化合物，對(duì)于多種蛋白酪氨酸激酶，包 括PDGFR， VEGFR， Kit和Raf等都具有抑制作用，其中的首選化合物索拉非尼(sorafenib) 被成功用于治療晚期肝癌和腎癌。美國(guó)專(zhuān)利6573293發(fā)明了另外一類(lèi)具有對(duì)多種蛋白酪 氨酸激酶有抑制作用的小分子化合物，它們屬于吲哚滿(mǎn)酮類(lèi)，其中的首選化合物舒尼替尼 (simitinib)已被臨床用于治療晚期腎癌和胃腸道間質(zhì)瘤。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一類(lèi)新的酪氨酸激酶抑制劑，它們?yōu)榫哂?如通式(I)的(Z)-2-苯基-3-(吡咯-2-基)-丙烯腈衍生物或其藥理上可接受的鹽
<formula>formula see original document page 7</formula>
(I) 其中 Rl、 R5獨(dú)立地從下列基團(tuán)中選擇-H、鹵素、烷基、環(huán)烷基、芳香基、雜芳香基、雜脂 環(huán)基、羥基、烷氧基、-C (0) NI^。Ri工、_NR15R16 、 - (CO) R17 、 - (CH2) rR18 ; R2從下列基團(tuán)中選擇-H、鹵素、烷基、三鹵甲基、羥基、烷氧基、氰基、芳香基、雜 芳香基、-NR15R16、 -NR15C (0) R16、 _C (0) R16、 _S (0) 2NR15R16 ; R3從下列基團(tuán)中選擇-H、鹵素、烷基、三鹵甲基、羥基、烷氧基、芳香基、雜芳香 基、-(CO) R17、 _NR15R16、 -NR15S (0) 2R16、 _S (0) 2N R15R16、 _N R15R16、 _NR15C (0) R16、 _S02R19， _S02R19 中的Rw可從下列基團(tuán)中選擇烷基、取代及未取代的芳香基、取代及未取代的芳烷基，取代 及未取代的雜芳香基，取代及未取代的雜芳烷基； R4從下列基團(tuán)中選擇-H、鹵素、烷基、羥基、烷氧基、-NR^6 ; R6、 R8從以下基團(tuán)中選擇-H、烷基、取代及未取代的芳香基、取代及未取代的雜
芳香基；R7是C (0) R12， C (0) R12中的R12是_NR13 (CH2) nR14， _NR13 (CH2) nR14中的R13是_H或者 未取代的低鏈烷基，_NR13(CH2)nR14中的R14是_NR15R16或-N+(0) R15R16， n是2或者3 ;
R9從以下基團(tuán)中選擇-H、烷基、環(huán)烷基、未取代或取代的芳香基、未取代或取代 的雜芳香基，R9和R8可以結(jié)合形成環(huán)烷，雜環(huán)基團(tuán)；
RIO和Rll獨(dú)立地從以下基團(tuán)中選擇-H、烷基、芳香基； R15和R16獨(dú)立地從以下基團(tuán)中選擇-H、烷基、以及被羥基、氨基烷基、氰基烷基、
環(huán)烷基、芳香基和雜芳香基取代的低鏈烷基；R15和R16可以結(jié)合形成雜環(huán)基團(tuán)； R17從以下基團(tuán)中選擇-H、羥基、烷氧基、芳氧基；R18從以下基團(tuán)中選擇羥基、-C(0)R『-N R15R16和-C (0) N R15R16 ; r是l，2，3，或者4。 上述化合物和其藥理上可接受的鹽能夠起到調(diào)控蛋白酪氨酸激酶的作用，由此作
用而產(chǎn)生對(duì)蛋白酪氨酸激酶相關(guān)的疾患例如惡性腫瘤的治療和預(yù)防效果。
優(yōu)選的本發(fā)明化合物為通式(I)化合物或其藥理上可接受的鹽，其中 R1，R5是-H; R2是-C1 ， -F， -Br ，或者氰基； R3是-C1 ， -F， -Br ，或者氰基； R4是-H ; R6是低鏈烷基； R7是-C (0) R12，這里R12是_N R13 (CH2)nR14，這里R13是_H或者未被取代的低鏈烷 基；n是2或者3 ;R14是-N R15R16，這里R15和R16是獨(dú)立的未被取代的低鏈烷基；
R8是低鏈烷基；
R9是_H。
本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的化合物為式(I)化合物或其藥理上可接受的鹽，其中R7優(yōu) 選自如下基團(tuán)(但不局限于)N-(2-二甲氨基乙基)胺基羰基，，N-甲基胺基羰基，N-(3-二 胺基羰基，N-(2-二乙基氨基乙基)胺基羰基』-(2-乙基氨基乙基)胺基 基氨基丙基)胺基羰基或N-(3-二乙基氨基丙基)胺基羰基。
本發(fā)明具體優(yōu)選的化合物為通式(I)化合物或其藥理上可接受的鹽，其特征在于
羰基，N-(3-乙
它為(但不局PI
艮于)5-[(Z)-2--腈基-2-(2-氯苯基)-乙烯基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸-(2-
乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2-(2-溴苯基)- 乙烯基]-2，4-二二甲基-1H-吡咯-3-羧
酸-(2_二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2-(2-甲基苯基)-乙烯基]-2，4-—二甲基-1H-吡咯-3-羧
酸-(2_二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)--2-腈基-2- (2-三氟甲基苯基)-乙烯基]-2 ， 4--二甲基-1H-吡咯-3-羧
酸-(2-二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2- (2-甲氧基苯基)-乙烯基]-2， 4-二甲基--1H--吡咯-3-羧
酸-(2_二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2-(3-甲基苯基)-乙烯基]-2，4-—二甲基-1H-吡咯-3-羧
酸-(2_二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)--2-腈基-2- (3-三氟甲基苯基)-乙烯基]-2 ， 4--二甲基-1H-吡咯-3-羧
酸-(2_二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2-(3，4- 二甲氧基苯基)-乙烯基]-2，4-二 E尹基-1H-妣
咯-3-羧酸-(2-二.乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2- (3， 4- 二氯苯基)-乙烯基]-2， 4-二甲基--1H--吡咯-3-羧
酸-(2_二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2- (4-甲氧基苯基)-乙烯基]-2， 4-二甲基--1H--吡咯-3-羧
酸-(2_二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)--2-腈基-2- (4-三氟甲基苯基)-乙烯基]-2 ， 4--二甲基-1H-吡咯-3-羧
酸-(2_二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2-(3-氟苯基)-乙烯基]-2，4-二二甲基-1H-吡咯-3-羧
酸-(2_二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2-(3-氯苯基)-乙烯基]-2，4-二二甲基-1H-吡咯-3-羧
酸-(2_二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2-(3-溴苯基)-乙烯基]-2，4-二二甲基-1H-吡咯-3-羧
酸-(2-二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)--2-腈基-2- (3 ， 4- 二甲基苯基)-乙烯基]-2 ， 4--二甲基-1H-吡咯-3-羧
酸-(2_二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2- (3-甲基-4-甲氧基苯基)-乙烯基]-2， 4-—___甲基-1H-妣咯-3_羧酸-(2-二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2- (3-甲氧基-4-甲基苯基)-乙烯基]-2， 4甲基-1H-妣
咯-3_羧酸-(2-二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2- (3-甲氧基苯基)-乙烯基]-2， 4-二甲基-1H--吡咯-3-羧
酸-(2--二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2-(4-甲基苯基)-乙烯基]-2，4-二甲基--1H-吡咯-3-羧
酸-(2--二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2- (2， 4- 二氯苯基)-乙烯基]-2， 4-二甲基-1H--吡咯-3-羧
酸-(2--二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2- (2， 3- 二氯苯基)-乙烯基]-2， 4-二甲基-1H--吡咯-3-羧
酸-(2--二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2-(3-氟-4-苯磺酸基)-乙烯基]-2，4-二甲基-1H-妣
咯-3_羧酸-(2-二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2-(3-氟苯基)-乙烯基]-2，4-二二甲基-1H-吡咯-3-羧
酸-(2--二乙氨基-乙基)_酰胺_ (2S)-羥基丁二酸鹽，或5-[(Z)-2-腈基-2-(3-氯苯基)-乙烯基]-2，4-二二甲基-1H-吡咯-3-羧
酸-(2--二乙氨基-乙基)_酰胺_ (2S)-羥基丁二酸鹽，或5-[(Z)-2-腈基-2- (3， 4- 二氯苯基)-乙烯基]-2， 4-二甲基-1H--吡咯-3-羧
酸-(2--二乙氨基-乙基)_酰胺_ (2S)-羥基丁二酸鹽，或5-[(Z)-2-腈基-2- (2， 4- 二氯苯基)-乙烯基]-2， 4-二甲基-1H--吡咯-3-羧
酸-(2--二乙氨基-乙基)_酰胺_ (2S)-羥基丁二酸鹽，或5-[(Z)-2-腈基-2- (2， 3- 二氯苯基)-乙烯基]-2， 4-二甲基-1H--吡咯-3-羧
酸-(2--二乙氨基-乙基)_酰胺_ (2S)-羥基丁二酸鹽。 本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)"烷基"指的是包括直鏈和支鏈基團(tuán)的飽和脂肪烴。所述烷 基優(yōu)選具有1-20個(gè)碳原子，更優(yōu)選為中等大小的具有1-10個(gè)碳原子的烷基，最優(yōu)選為1-4 個(gè)碳原子的低鏈烷基。所述烷基可為取代的或未取代的。當(dāng)被取代時(shí)，取代基優(yōu)選為一個(gè) 或多個(gè)各自選自以下的基團(tuán)環(huán)烷基、芳基、雜芳基、雜脂環(huán)基、羥基、氨基，烷氧基、芳氧基、 硫代羰基、0-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、0-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲?；?、C-酰 氨基、N-酰氨基、C-羧基、0-羧基、硝基、甲硅烷基。"環(huán)烷基"指的是全部為碳的單環(huán)或稠和的環(huán)(即帶有一個(gè)相鄰對(duì)碳原子的環(huán))基 團(tuán)，其中一個(gè)或多個(gè)環(huán)不具有完全連接的Pi-電子系統(tǒng)。環(huán)烷基的實(shí)例(不局限于)為環(huán) 丙烷、環(huán)丁烷、環(huán)戊烷、環(huán)戊烯、環(huán)己烷、金剛烷、環(huán)己二烯、環(huán)庚烷和環(huán)庚三烯。環(huán)烷基可為 取代的或未取代的。當(dāng)被取代時(shí)，取代基優(yōu)選為一個(gè)或多個(gè)各自選自以下的基團(tuán)烷基、芳 基、雜芳基、雜脂環(huán)基、羥基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷硫基、芳硫基、氰基、鹵代、羰基、硫代 羰基、C-羧基、0-羧基、0-氨基甲?；-氨基甲?；-酰氨基、N-酰氨基、硝基、氨基。
"芳香基"指的是所有為碳的單環(huán)或是稠和環(huán)的具有完全連接的Pi-電子系統(tǒng)的多 元環(huán)(即其帶有相鄰對(duì)碳原子的環(huán))基團(tuán)。芳香基可為取代的或未取代的。當(dāng)被取代時(shí)， 取代基優(yōu)選為一個(gè)或多個(gè)選自以下的基團(tuán)，包括鹵代、三鹵代甲基、烷基、羥基、烷氧基、芳 氧基、巰基、烷硫基、芳硫基、氨基甲?；?、0-疏代氨基甲?；-硫代氨基?；?、C-酰氨基、
9N-酰氨基、亞硫?；⒒酋；被?。"雜芳香基"指的是單環(huán)或稠和環(huán)(即帶有相鄰對(duì)原子的環(huán))基團(tuán)，其在環(huán)上具有 一個(gè)或多個(gè)選自氮、氧和硫的原子并且另外具有完全連接的？卜電子系統(tǒng)。雜芳香基的實(shí) 例(不局限于)為吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、妣唑、妣啶、嘧啶、喹啉、異喹啉、嘌呤 或咔唑。雜芳基可為取代的或未取代的。當(dāng)被取代時(shí)，取代基優(yōu)選為一個(gè)或多個(gè)選自以下 的基團(tuán)，包括烷基環(huán)烷基、卣代、三卣代甲基、羥基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷硫基、芳硫基、
氰基、硝基、羰基、硫代羰基、亞磺酰氨基、c-羧基、o-羧基、亞硫?；⒒酋；?、o-氨基甲酰 基、N-氨基甲酰基、0-硫代氨基甲?；-硫代氨基甲?；-酰氨基、N-酰氨基、氨基。
"雜脂環(huán)基"指的是在環(huán)上具有一個(gè)或多個(gè)選自氮、氧和硫的原子的單環(huán)或稠和 環(huán)。所述環(huán)也可含有一個(gè)或多個(gè)雙鍵。然而，所述環(huán)不具有完全連接的Pi-電子系統(tǒng)。雜脂 環(huán)可為取代的或未取代的。當(dāng)被取代時(shí)，取代基優(yōu)選為一個(gè)或多個(gè)選自以下的基團(tuán)，包括烷 基、環(huán)烷基、卣代、三卣代甲基、羥基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷硫基、芳硫基、氰基、硝基、羰 基、硫代羰基、C-羧基、0-羧基、0-氨基甲?；-氨基甲?；?-硫代氨基甲?；?、N-硫 代氨基甲?；?、亞硫?；?、磺酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、氨基。"烷氧基"指的是其中R為直鏈或支鏈的如在此定義的烷基的-OR基團(tuán)。其中優(yōu)選 1 6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷氧基，如甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧 基、叔丁氧基、仲丁氧基、戊氧基、新戊氧基、己氧基等。更優(yōu)選具1 4個(gè)碳原子的直鏈或 支鏈烷氧基，最優(yōu)選甲氧基或乙氧基。
"羥基"指的是-0H基團(tuán)。
"鹵素"指的是氟、氯、溴或碘。"三鹵甲基"指的是其中X為如在此定義的鹵代基團(tuán)的-CX3基團(tuán)。
"氰基"指的是-C e N基團(tuán)。 如上所述，本發(fā)明的化合物也可以以藥理上可接受的鹽類(lèi)的形式存在，即通式(I) 的(Z)-2-苯基-3-(吡咯-2-基)-丙烯腈衍生物的藥理上可接受的鹽。藥學(xué)上可接受的 鹽類(lèi)形式包括藥理上可接受的酸性/陰離子鹽或堿性/陽(yáng)離子鹽。具有代表性的有機(jī)或無(wú) 機(jī)酸包括(當(dāng)然不僅限于此)鹽酸，氫溴酸，氫氟酸，高氯酸，硫酸，硝酸，磷酸，乙酸，丙酸， 羥基乙酸，乳酸，琥珀酸，馬來(lái)酸，酒石酸，檸檬酸，安息香酸，扁桃酸，甲磺酸，羥乙基磺酸， 苯磺酸，草酸，棕櫚酸，2-萘磺酸，對(duì)甲苯磺酸，環(huán)乙胺基磺酸，水楊酸，己糖酸，三氟乙酸。藥 學(xué)上可接受的堿性/陽(yáng)離子鹽類(lèi)包括(當(dāng)然不僅限于此)鋁，鈣，氯普魯卡因，膽堿，二乙醇 胺，乙二胺，鋰，鎂，鉀，鈉和鋅。 本發(fā)明還包括發(fā)明的化合物所構(gòu)成的前體藥物。所謂前體藥物是指一些其它已知
的或者沒(méi)有公開(kāi)的化合物和本發(fā)明所描述的活性化合物結(jié)合后達(dá)到比較容易給藥的目的，
當(dāng)它進(jìn)入體內(nèi)后可以轉(zhuǎn)化為本發(fā)明所描述的有活性化合物的而起功能作用。 本發(fā)明另一個(gè)所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種藥物組合物，其至少具有上述化合
物的功能和效果。為此本發(fā)明采用以下技術(shù)方案，它含有 通式(I)化合物或者/和其藥理上可接受鹽， 任選的藥理上可接受的輔劑， 或者，所述藥物組合物還含有任選的含有一種或多種已知藥物化合物。 本發(fā)明另一個(gè)所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供制備具有如上述通式(I)的(Z)-2-苯基-3-(吡咯-2-基)-丙烯腈衍生物的方法。它由通式(II)化合物與通式(III)化合物
在堿性條件下縮合得到通式(I)化合物，
<formula>formula see original document page 11</formula>(HI) (II) (I) 此方法可以通過(guò)下列有代表性的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明。本發(fā)明所涉及制備方法可通過(guò)標(biāo) 準(zhǔn)有機(jī)化學(xué)方法得到必需原料，或通過(guò)一般有機(jī)化學(xué)中所闡述的方法的類(lèi)似方法獲得必需 原料。 所述的反應(yīng)在堿性條件下進(jìn)行優(yōu)選為反應(yīng)在以下適宜的堿的存在下進(jìn)行可為有 機(jī)胺堿，如吡啶、三乙胺、N-甲基嗎啉、4-二甲基氨基吡啶；或?yàn)閴A金屬或堿土金屬的碳酸 鹽或氫氧化物，如碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸鈣、氫氧化鈉、氫氧化鉀；或者，為堿金屬或堿土金屬 氨化物，如氨基化鈉或雙(三甲硅烷基)氨化鈉。 制備具有如上述通式(I)的(Z)-2-苯基-3-(吡咯-2-基)-丙烯腈衍生物的反 應(yīng)可在以下適宜的溶劑或稀釋劑存在下進(jìn)行反應(yīng)，溶劑或稀釋劑包括鏈烷醇或酯或醇如甲 醇、乙醇、異丙醇或乙酸乙酯；鹵代溶劑如二氯甲烷、氯仿或四氯化碳；醚如四氫呋喃或1， 4_ 二烷；芳族溶劑如甲苯；或偶極性非質(zhì)子傳遞溶劑如N，N- 二甲基甲酰胺J，N- 二甲基乙 酰胺、N-甲基吡咯烷_(kāi)2-酮、二甲基亞砜。 本發(fā)明所述的反應(yīng)溫度一般為10 15(TC，優(yōu)選為20 12(TC范圍內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)， 最優(yōu)選為30 90°C。 本發(fā)明所述的上述通式(I)的(Z)-2-苯基-3-(吡咯-2-基)-丙烯腈衍生 物的藥理上可接受的鹽可采用下述方法制備在制備通式(I)的(Z)-2-苯基-3-(吡 咯_2-基)_丙烯腈衍生物后，然后再與適宜的酸制備加成鹽。 本發(fā)明再一個(gè)所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述任一化合物或其藥理上可接受的 鹽和任選的藥理上可接受的輔劑制備的藥物制劑在治療或者預(yù)防有機(jī)體中和蛋白激酶相 關(guān)疾病中的應(yīng)用。 本發(fā)明所描述的化合物的一個(gè)重要生物學(xué)作用是可以調(diào)控蛋白酪氨酸激酶的活 性。這里的蛋白酪氨酸激酶是指受體蛋白路氨酸激酶(RTKs)、非受體或〃 細(xì)胞〃 酪氨酸激 酶(CTKs)。調(diào)控是指本發(fā)明所描述的化合物可以使RTKs和CTKs的催化活性發(fā)生改變，尤 其是抑制RTKs和CTKs的催化活性。
受本發(fā)明化合物調(diào)控的受體蛋白激酶包括(但不局限于)VEGFR、 EGFR、 HER2、 HER3、HER4、IR、IGF-1R、IRR、PDGFR alpha、PDGFR beta、KIT(CD117)、CSFlR、C-kit、C-fms、 Flk-1R、 Flk4、 KDR/Flk-L Flt-l、 FGFR-1R、 FGFR-2R、 FGFR-3R和FGFR-4R，其中優(yōu)選的是 VEGFR、 PDGFRs和c-KIT，其中優(yōu)選調(diào)控的受體酪氨酸激酶是PDGFRs、 VEGFRs和c-KIT。
受本發(fā)明化合物調(diào)控的非受體酪氨酸激酶選自(但不局限于)Src、Frk、Btk、Csk、 Abl、 ZAp70、 Fes/Fps、 Fak、 Jak、 Ack、 Yes、 Fyn、 Lyn、 1xk、 Blk、 Hck、 Fgr禾口 Yrk.
本發(fā)明所描述的化合物對(duì)酪氨酸激酶的調(diào)控可以用本領(lǐng)域中技術(shù)人員熟知的一 些體外實(shí)驗(yàn)方法來(lái)證明，用這種方法還可以測(cè)定這些化合物的IC50而達(dá)到優(yōu)選化合物的 目的。用于這些實(shí)驗(yàn)方法中的酪氨酸激酶可以從細(xì)胞中提取，也可以用基因工程的方法通 過(guò)體外表達(dá)來(lái)得到。 本發(fā)明所描述的化合物對(duì)酪氨酸激酶調(diào)控后產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)可以用研究人員 熟知的方法，例如體外細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)觀(guān)察。其中的方法之一是觀(guān)察本發(fā)明所描述的化合物作 用于腫瘤細(xì)胞后抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或引起的細(xì)胞的凋亡效應(yīng)。 本發(fā)明所描述的化合物對(duì)酪氨酸激酶相關(guān)疾病的治療作用可以在疾病的動(dòng)物模 型中得到驗(yàn)證。典型的例子之一是用腫瘤的異體移植模型將人的腫瘤移植到動(dòng)物例如小鼠 中，然后給動(dòng)物服用有效治療劑量的本發(fā)明的化合物達(dá)到一定時(shí)間，可以觀(guān)察到服藥后動(dòng) 物的腫瘤會(huì)停止增長(zhǎng)、體積縮小或者消失(和對(duì)照組相比)。 根據(jù)對(duì)本發(fā)明所描述的化合物進(jìn)行的生物學(xué)和藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化后得到的最佳 化合物是5-[ (Z) -2-腈基-2- (3， 4- 二氯苯基)-乙烯基]-2， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧 酸-(2- 二乙氨基_乙基)_酰胺和其藥理上可以接受的鹽，在以下將此優(yōu)選化合物稱(chēng)為8 號(hào)化合物。 由于酪氨酸激酶功能的失控，尤其是功能過(guò)強(qiáng)和許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)， 因此本發(fā)明所描述的化合物對(duì)酪氨酸激酶的調(diào)控可以用來(lái)治療許多和酪氨酸激酶相關(guān)的 疾病。這些疾病中最重要的是惡性腫瘤，包括源自各種上皮細(xì)胞的癌癥、來(lái)源于中胚層細(xì)胞 的惡性肉瘤、來(lái)源于血液系統(tǒng)的白血病和來(lái)源于淋巴系統(tǒng)的惡性淋巴瘤以及來(lái)源于生殖細(xì) 胞的惡性腫瘤，具體包括(但不局限于)肺癌、肝癌、腎癌、胃癌、大腸癌、前列腺癌、乳腺癌、 食道癌，胰腺癌，卵巢癌、宮頸癌、白血病、淋巴瘤、腦瘤、甲狀腺癌、泌尿生殖道癌以及惡性 肉瘤。 這些疾病還包括(但并不局限于)代謝性疾病(例如糖尿病)、自身免疫性疾病、 炎癥性疾病、過(guò)度增殖性疾病、心腦血管疾病、以及骨關(guān)節(jié)疾病。 本發(fā)明的另一個(gè)方面是，在此描述的化合物、或者它的鹽或前藥可與其它的化學(xué) 治療藥物聯(lián)合用于治療以上討論的疾病和失調(diào)以獲得更好的效果。典型的例證是本發(fā)明描 述的化合物和已知的抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用可以獲得更好的治療腫瘤的目的。這些已知的抗 腫瘤藥物包括(但不局限于)細(xì)胞毒類(lèi)藥物、激素類(lèi)藥物、生物類(lèi)抗腫瘤藥、單克隆抗體類(lèi) 藥物和最新的分子靶向性藥物。 為了達(dá)到治療上述疾病的目的，本發(fā)明所描述的化合物或者其藥理上可接受的鹽 需要和合適的載體、賦形劑和其它輔劑混合，根據(jù)所選擇的給藥方法，用常規(guī)的制劑方法例 如混合、溶解、制粒、包衣、研磨、乳化、包裹、包埋或冷凍干燥的方法制備成合適的劑型。
對(duì)注射劑而言，可以將本發(fā)明化合物溶解在生理學(xué)上合適的緩沖液如Hank氏溶
12液、林格氏溶液或生理鹽水緩沖液配制成水溶液制劑，也可以分散在合適的液體載體例如 油性或水溶性的介質(zhì)中形成混懸液、脂質(zhì)體或乳劑。對(duì)透膜給藥，可在制劑中使用適于穿過(guò) 屏障的滲透劑。這樣的滲透劑一般為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。 對(duì)口服制劑而言，通過(guò)使活性化合物與本領(lǐng)域已知的藥學(xué)上可接受的載體、賦形 劑和輔劑混合，用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的制劑方法能夠配制成片劑、丸劑、膠囊劑、溶液劑、 凝膠劑、糖漿劑、漿劑、混懸劑等。其中的賦形劑和填充劑可以是糖類(lèi)，包括乳糖、蔗糖、甘露 糖醇或山梨糖醇、纖維素制劑如玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉和馬鈴薯淀粉，也可以是其 它的材料例如明膠、甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯 烷酮(PVP)。如果需要，還可加入崩解劑如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或藻酸或藻酸鈉。
片劑可以用適宜的包衣材料通過(guò)包衣技術(shù)制成糖衣片。包衣材料可使用濃的糖溶 液和任選自阿拉伯膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、carbopo1膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆 用溶液和適宜的有機(jī)溶劑或溶劑混合物以及無(wú)害的顏料或染料組成。常用的口服制劑還包 括以凝膠組成的的硬膠囊劑以及用明膠和增塑劑如甘油或山梨糖醇組成的軟膠囊劑。硬膠 囊劑中活性成分需要和填充劑如乳糖、粘合劑如淀粉和/或潤(rùn)滑劑如滑石粉或硬脂酸銳以 及任選的穩(wěn)定劑混合。在軟膠囊中活性化合物可溶解或懸浮于適宜的液體如脂肪油、液體 石蠟或液體聚乙二醇中，也可將穩(wěn)定劑加入到這些制劑中。 對(duì)吸入給藥，使用加壓填充或霧化器和適宜的拋射劑例如(不局限于)二氯二氟 甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳，以氣溶膠噴霧劑的形式來(lái)傳輸本發(fā)明用途的 化合物。 本發(fā)明的化合物還可以用緩釋制劑技術(shù)制成緩釋膠囊或者其它緩釋制劑而用于 長(zhǎng)期給藥。 為了達(dá)到治療的目的，可以根據(jù)上述不同制劑的特征來(lái)采取不同的給藥方法。這 些給藥方法包括(但不局限于)口服、直腸，、透過(guò)粘膜或腸道給藥；或者肌肉內(nèi)、皮下、髓 內(nèi)、鞘內(nèi)、直接心室內(nèi)、靜脈、動(dòng)脈、玻璃體內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射。給藥的優(yōu)選途徑為 口服和非腸道。 給藥的方法還可以采用局部而非全身的方式給予所述化合物，例如將液體制劑的 化合物直接注射到實(shí)體瘤中。此外，還可以用靶向藥物傳遞系統(tǒng)例如以腫瘤特異性抗體包 被的脂質(zhì)體給予藥物。這些脂質(zhì)體將選擇性地將藥物運(yùn)送到腫瘤組織。 本發(fā)明活性成分的藥物組合還包括有效的治療劑量，也就是指需要達(dá)到有效預(yù) 防、緩解或改善疾病癥狀或者延長(zhǎng)受治療者的存活率的一定化合物能的量。藥物有效劑量 的研究和計(jì)算是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。常規(guī)的方法是根據(jù)體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物藥效學(xué)的數(shù) 據(jù)來(lái)推算。有效劑量的范圍大約在每天每公斤體重0. 001毫克至300毫克之間，比較常用 的是每天每公斤體重0. 01毫克至100毫克，更合適的是每天每公斤體重0. 1毫克至30毫 克。
具體實(shí)施例方式
第一部分化合物部分 以下實(shí)施例為本發(fā)明選取的有代表性化合物的合成，并不構(gòu)成對(duì)關(guān)于本發(fā)明合成 方法或在本發(fā)明包括的化合物的限制。
實(shí)施例1 5- [ (Z) -2-腈基-2- (3-氟苯基)-乙烯基]-2， 4- 二甲基-1H-吡咯_3_羧酸-(2_二 乙氨基-乙基)-酰胺的制備 將5-甲?；鵢2，4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2_ 二乙基氨基-乙基)酰胺(1) (1. 33g，5. 0,1)，間氟苯乙月青(0. 85g，6. 7,1)和異丙醇(30mL)加入三頸瓶中，攪拌溶解 后，滴加入4N氫氧化鈉溶液(lOmL)，體系室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，減壓濃縮除去溶劑，濃縮物用乙酸 乙酯(lOOmL)稀釋?zhuān)謩e用水(2X50mL)和飽和食鹽水(50mL)洗滌，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉 干燥后，減壓蒸干，濃縮物用乙酸乙酯-正己烷處理，過(guò)濾析出固體，8(TC干燥4h，即得黃色 固體目標(biāo)化合物5-[ (Z) -2-腈基-2- (3-氟苯基)-乙烯基]-2， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧 酸-(2- 二乙氨基_乙基)_酰胺(1. 2g， 62.8%)
m. p. 156. 7 157. 8°C 'H-NMR (500MHz, DMS0_d6) S 10. 93 (s， 1H) ， 7. 73 (s， 1H) ， 7. 69 (d， 1H) ， 7. 50 (m， 2H)， 7. 40 (m， 1H) ， 7. 18 (t， 1H) ， 3. 27 (m， 2H) ， 2. 52 (m， 6H) ， 2. 41 (s， 3H) ， 2. 28 (s， 3H) ， 0. 97 (t， 6H)
(l)J.Med. Chem. 1999,42,5120
實(shí)施例2 5- [ (Z) -2-腈基-2- (3-氯苯基)-乙烯基]-2， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧酸-(2-二 乙氨基-乙基)-酰胺的制備 同實(shí)施例l操作，用相應(yīng)的間氯苯乙腈制備得到黃色固體目標(biāo)化合物 5_[ (Z) -2-腈基-2- (3-氯苯基)-乙烯基]-2， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧酸-(2- 二乙氨 基-乙基)-酰胺(1.51g，75.7% )
m. p. 143. 2 145. 3°C 丄H-NMR (500MHz, DMS0_d6) S 10. 89 (s， 1H) ， 7. 76 (s， 1H) ，7. 72 (s， 1H) ， 7. 62 (d， 1H)， 7. 47 (dd， 1H) ， 7. 439 (d， 1H) ， 7. 37 (t， 1H) ， 3. 26 (m， 2H) ， 2. 50 (m， 6H) ， 2. 41 (s， 3H) ， 2. 28 (s， 3H) ，0. 97(t，6H).
實(shí)施例3 5- [ (Z) -2-腈基-2- (3-溴苯基)-乙烯基]-2， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧酸-(2-二 乙氨基-乙基)-酰胺的制備 同實(shí)施例l操作，用相應(yīng)的間溴苯乙腈制備得到黃色固體目標(biāo)化合物 5_[ (Z) -2-腈基-2- (3-溴苯基)-乙烯基]-2， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧酸-(2- 二乙氨 基-乙基)-酰胺(1.47g，66.3%)
m. p. 143. 4 144. 8°C 丄H-NMR (500MHz, DMS0_d6) S 10. 89 (s， 1H) ， 7. 88 (s， 1H) ，7. 71 (s， 1H) ， 7. 66 (d， 1H)， 7. 53 (d， 1H) ， 7. 41 (dd， 1H) ， 7. 36 (t， 1H) ， 3. 26 (m， 2H) ， 2. 50 (m， 6H) ， 2. 40 (s， 3H) ， 2. 27 (s， 3H) ，0. 97(t，6H).
實(shí)施例4 5- [ (Z) -2-腈基-2- (3-氟苯基)-乙烯基]_2， 4_ 二甲基_1H_吡咯_3_羧酸-(2_二 乙氨基_乙基)_酰胺_ (2S)-羥基丁二酸鹽的制備 將5- [ (Z) -2-腈基-2- (3-氟苯基)-乙烯基]-2 ， 4- 二甲基_1H_吡咯_3_羧 酸-(2-二乙氨基-乙基)-酰胺(0. 63g， 1.63,1)及甲醇(lOOmL)加入到三頸瓶中，再加
14入(2S)-羥基丁二酸(0. 236g， 1. 76mmol)，室溫?cái)嚢?. 5h，溶解后減壓濃縮除去溶劑，濃縮 物中加入乙腈(25. 0mL)，加熱回流0. 5h后，攪拌冷卻至室溫，再放置冰箱(5°C )冷析，過(guò)濾 析出物，6(TC減壓烘干(4h)，即得淺黃褐色固體物5-[(Z)-2-腈基-2-(3-氟苯基)-乙烯 基]-2， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧酸-(2- 二乙氨基-乙基)-酰胺-(2S)-羥基丁二酸鹽 (0. 66g，78. 4% )。
m. p. 95. 4 99. 8°C 力-NMR (500MHz, DMS0_d6) S卯m 1.18(t， J = 7. lOHz， 6H) ， 2. 30 (s， 3H) ， 2. 38 (dd， J = 5. 5Hz， 1H) ，2. 44(s，3H) ，2. 57(dd， J = 8. OHz， 1H) ， 3. 03(m，6H) ，3. 50(br，2H) ，4. 04(dd， J = 6. OHz， 1H) ， 7. 18 (br， 1H) ， 7. 50 (s， 1H) ， 7. 58 (d， J = 10. 5Hz， 1H) ， 7. 71 (m， 2H) ， 10. 98 (s，
1H) 實(shí)施例5 5-[ (Z) -2-腈基-2-(2， 3- 二氯苯基)-乙烯基]-2， 4- 二甲基_1H_吡咯_3_羧 酸-(2- 二乙氨基_乙基)_酰胺的制備 同實(shí)施例1操作，用相應(yīng)的2，3_ 二氯苯乙腈制備得到黃色固體目標(biāo)化合物 5- [ (Z) -2-腈基-2- (2 ， 3- 二氯苯基)-乙烯基]-2 ， 4- 二甲基-1H-吡咯_3_羧
酸-(2- 二乙氨基_乙基)_酰胺(1. 36g， 62.8%)。 實(shí)施例6 5- [ (Z) -2-腈基-2- (2 ， 4- 二氯苯基)-乙烯基]-2 ， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧 酸-(2- 二乙氨基_乙基)_酰胺的制備 同實(shí)施例1操作，用相應(yīng)的2，4_ 二氯苯乙腈制備得到黃色固體目標(biāo)化合物 5- [ (Z) -2-腈基-2- (2 ， 4- 二氯苯基)-乙烯基]-2 ， 4- 二甲基-1H-吡咯_3_羧
酸_(2- 二乙氨基_乙基)_酰胺(1. 21g， 55. 9% )。 實(shí)施例7 5- [ (Z) -2-腈基-2- (3-氟_4_苯磺酸基)_乙烯基]_2， 4_ 二甲基_1H_吡咯_3_羧 酸-(2- 二乙氨基_乙基)_酰胺的制備 將5- [ (Z) -2-腈基-2- (3-氟苯基)-乙烯基]-2 ， 4- 二甲基_1H_吡咯_3_羧 酸-(2-二乙氨基-乙基)-酰胺(0. 63g， 1. 63mmo1)及濃硫酸(5. OmL)加入到三頸瓶中，室 溫?cái)嚢璺磻?yīng)20h，反應(yīng)體系倒入一定量的水中，過(guò)濾析出物，IO(TC烘干(4h)，即得黃色固體 5_ [ (Z) -2-腈基-2- (3-氟-4-苯磺酸基)-乙烯基]-2， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧酸-(2- 二 乙氨基_乙基)_酰胺(0. 69g， 91. 2 % )。
MS m/z 463[m+l]
實(shí)施例8 5- [ (Z) -2-腈基-2- (3 ， 4- 二氯苯基)-乙烯基]-2 ， 4- 二甲基-1H-吡咯_3_羧 酸-(2- 二乙氨基_乙基)_酰胺的制備 同實(shí)施例1操作，用相應(yīng)的3，4_ 二氯苯乙腈制備得到黃色固體目標(biāo)化合物
5- [ (Z) -2-腈基-2- (3 ， 4- 二氯苯基)-乙烯基]-2 ， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧 酸-(2- 二乙氨基_乙基)_酰胺(1. 36g， 62.8%)。
m. p. 157. 0 159. 3°C 丄H-NMR (500MHz ， DMS0—d6) S 10. 89(s， 1H) ， 7. 96(s， 1H) ，7. 74(s， 1H) ， 7. 69(d， 1H)，7. 64 (d， 1H) ， 7. 37 (t， 1H) ， 3. 27 (m， 2H) ， 2. 51 (m， 6H) ， 2. 40 (s， 3H) ， 2. 28 (s， 3H) ， 0. 97 (t， 6H)
實(shí)施例9 5- [ (Z) -2-腈基-2- (3-氯苯基)-乙烯基]_2， 4_ 二甲基_1H_吡咯_3_羧酸-(2-二 乙氨基_乙基)_酰胺_ (2S)-羥基丁二酸鹽的制備 將5- [ (Z) -2-腈基-2— (3-氯苯基)-乙烯基]-2 ， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧 酸-(2-二乙氨基-乙基)-酰胺(0. 72，1.8mmo1)及甲醇(100mL)加入到三頸瓶中，再加 入(2S)-羥基丁二酸(0. 265g， 1. 98mmo1)，室溫?cái)嚢?. 5h，溶解后減壓濃縮除去溶劑，濃縮 物中加入乙腈(25. 0mL)，加熱回流0. 5h后，攪拌冷卻至室溫，再放置冰箱(5°C )冷析，過(guò)濾 析出物，6(TC減壓烘干(4h)，即得淺黃褐色固體物5-[(Z)-2-腈基-2-(3-氯苯基)-乙烯 基]-2， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧酸-(2- 二乙氨基_乙基)_酰胺_ (2S)-羥基丁二酸鹽 (0. 63g，65. 7% )。 力-NMR(500MHz， DMS0-d6) S卯m 1.14(t， J = 7. 00Hz， 6H) ， 2. 30 (s， 3H) ， 2. 35 (dd， J = 5. 5Hz， 1H) ，2. 43(s，3H) ，2. 54(dd， J = 8. 0Hz， 1H) ， 2. 96(m，6H) ，3. 47(br，2H，2x 0H)， 4. 00 (m， 1H) ， 7. 38 (d， J = 8. 0， 1H) ， 7. 47 (m， 1H) ， 7. 62 (d， J = 8. 0Hz， 1H) ， 7. 67 (br， 1H)， 7. 73 (s， 1H) ， 7. 76 (s， 1H) ， 10. 97 (s， 1H)
實(shí)施例10 5- [ (Z) -2-腈基-2- (3 ， 4- 二氯苯基)-乙烯基]-2 ， 4- 二甲基-1H-吡咯_3_羧 酸-(2- 二乙氨基_乙基)_酰胺_ (2S)-羥基丁二酸鹽的制備 將5- [ (Z) -2-腈基-2- (3， 4- 二氯苯基)-乙烯基]_2， 4_ 二甲基-1H-吡咯-3-羧 酸-(2-二乙氨基-乙基)-酰胺(0. 35g，0.81mmo1)及甲醇(30mL)加入到三頸瓶中，再加入 (2S)-羥基丁二酸(0. 12g， 0. 89mmo1)，室溫?cái)嚢?. 5h，溶解后減壓濃縮除去溶劑，濃縮物中 加入乙腈(5. OmL)，加熱回流O. 5h后，攪拌冷卻至室溫，再放置冰箱(5°C )冷析，過(guò)濾析出 物，60°C減壓烘干(4h)，即得黃色固體物5-[ (Z) -2-腈基-2- (3， 4- 二氯苯基)-乙烯基]-2， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧酸-(2- 二乙氨基-乙基)-酰胺-(2S)-羥基丁二酸鹽(0. 4g， 87. 0% )。 力-NMR(500MHz， DMS0-d6) S卯m 1.13(t， J = 7. OOHz， 6H) ， 2. 29 (s， 3H) ， 2. 36 (dd， J = 5. 5Hz， 1H) ，2. 42(s，3H) ，2. 54(m， 1H) ， 2. 93(m，6H) ，3. 45(br，2H) ，4. 02(dd， J = 5. 50Hz， 1H) ， 7. 63 (m， 2H) ， 7. 70 (d， J = 8. 5Hz， 1H) ， 7. 77 (s， 1H) ， 7. 97 (m， 2H) ， 10. 99 (s， 1H)
第二部分生物學(xué)和藥效學(xué)
實(shí)施例11 化合物在體外對(duì)酪氨酸激酶活性抑制實(shí)驗(yàn) 本發(fā)明所描述的化合物或者其藥理上可接受的鹽對(duì)酪氨酸激酶的作用可以用標(biāo) 準(zhǔn)的試劑盒來(lái)檢測(cè)，例如TaKaRa Bio Inc.的Universal Tyrosine Kinase Assay Kit。其 原理是觀(guān)察化合物對(duì)不同的酪氨酸激酶催化酪氨酸底物磷酸化的作用，以下是檢測(cè)化合物 對(duì)腫瘤細(xì)胞中蛋白酪氨酸激酶抑制作用的具體操作步驟，化合物對(duì)特定的酪氨酸激酶例如 不同類(lèi)別的受體酪氨酸激酶也可以用同樣的方法來(lái)測(cè)定
1.酪氨酸激酶樣品的制備 1)在10cm平皿中培養(yǎng)H印2喉癌細(xì)胞1-5X106細(xì)胞，移去培養(yǎng)基，用PBS洗三次；
2)加入lml提取緩沖液，用細(xì)胞刮刀小心收集細(xì)胞，4度下10000xg離心IO分鐘，
16留取上清作為樣品。
2.檢領(lǐng)[J : 1)樣品用激酶反應(yīng)緩沖液做合適的稀釋?zhuān)瑫r(shí)加入不同濃度的化合物；
2)每個(gè)反應(yīng)孔加入40ul的標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋樣品； 3)每孔加入10ul的40mM ATP — 2Na溶液，充分混勻，37度反應(yīng)30分鐘； 4)棄反應(yīng)液，用洗滌液充分洗4次； 5)每孔加入lOOul的封閉溶液，37度反應(yīng)30分鐘； 6)棄封閉液，每孔加入50ul酶標(biāo)抗體，37度反應(yīng)30分鐘； 7)棄抗體反應(yīng)液，用洗滌液充分洗4次； 8)每孔加入lOOul底物溶液，37度反應(yīng)15分鐘； 9)每孔加入lOOul反應(yīng)終止液； 10)檢測(cè)450mM OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算化合物對(duì)酪氨酸激酶樣品抑制的IC50。
用本法測(cè)得合成化合物對(duì)酪氨酸激酶抑制的IC50值在6-600nM之間，其中優(yōu)選的 8號(hào)化合物的IC50為6nM。
實(shí)施例12 化合物在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用 本發(fā)明優(yōu)選化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用可以在體外用細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)來(lái) 測(cè)定具體操作步驟如下 1.在96孔培養(yǎng)板上加入一定量腫瘤細(xì)胞(每孔加入細(xì)胞的數(shù)量根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的 速度而定， 一般在2000到200000之間)； 2.細(xì)胞培養(yǎng)4小時(shí)后，把培養(yǎng)液換成含0. 5% FBS的1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜；
3.棄上清液，每孔加入180ul無(wú)血清的1640培養(yǎng)液，然后再加入20ul預(yù)先配制好 的不同濃度的化合物；1小時(shí)后，每孔再加入FBS使其終濃度為0. 5%，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；
4.每孔加20ul MTT，孵育4小時(shí)；棄上清液，每孔加入200ul DMSO溶液，混勻，在 570nm測(cè)吸光度。 5.根據(jù)不同濃度化合物的光吸收值可以計(jì)算出該化合物的IC50。 經(jīng)測(cè)定，本發(fā)明所述化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制的IC50值在1. 92-25. 6uM之間，
其中優(yōu)選的8號(hào)化合物對(duì)H印2喉癌細(xì)胞增殖的IC50濃度是1. 97uM，對(duì)S怖20大腸癌細(xì)胞
增殖的IC50是1. 92uM。 實(shí)施例13 優(yōu)選8號(hào)化合物在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制藥效實(shí)驗(yàn) 本發(fā)明優(yōu)選的8號(hào)化合物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)可以用人類(lèi)腫瘤細(xì)胞在裸鼠 的異種移植模型來(lái)進(jìn)行，具體操作如下 1.將人體H印2喉癌腫瘤細(xì)胞植入裸鼠的后脅腹，每只動(dòng)物植入5xl06細(xì)胞，每組 8只動(dòng)物； 2.在植入細(xì)胞的同一天起給動(dòng)物每天口服8號(hào)化合物一次，劑量分別為每天每公 斤體重25mg， 50mg， 100mg，連續(xù)服用21天； 3.每隔三天測(cè)定對(duì)照組和給藥組腫瘤的大小，以長(zhǎng)x寬x高來(lái)計(jì)算腫瘤的體積
4.根據(jù)給藥組和對(duì)照組腫瘤體積的大小來(lái)計(jì)算8號(hào)化合物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制率實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)8號(hào)化合物在21天后對(duì)H印2腫瘤生長(zhǎng)的抑制率為85. 6% ，經(jīng)t檢驗(yàn)和對(duì)照
組有著顯著差異。
權(quán)利要求
具有如通式(I)的(Z)-2-苯基-3-(吡咯-2-基)-丙烯腈衍生物或其藥理上可接受的鹽其中R1、R5獨(dú)立地從下列基團(tuán)中選擇-H、鹵素、烷基、環(huán)烷基、芳香基、雜芳香基、雜脂環(huán)基、羥基、烷氧基、-C(O)NR10R11、-NR15R16、-(CO)R17、-(CH2)rR18；R2從下列基團(tuán)中選擇-H、鹵素、烷基、三鹵甲基、羥基、烷氧基、氰基、芳香基、雜芳香基、-NR15R16、-NR15C(O)R16、-C(O)R16、-S(O)2NR15R16；R3從下列基團(tuán)中選擇-H、鹵素、烷基、三鹵甲基、羥基、烷氧基、芳香基、雜芳香基、-(CO)R17、-NR15R16、-NR15S(O)2R16、-S(O)2NR15R16、-NR15R16、-NR15C(O)R16、-SO2R19，-SO2R19中的R19可從下列基團(tuán)中選擇烷基、取代及未取代的芳香基、取代及未取代的芳烷基，取代及未取代的雜芳香基，取代及未取代的雜芳烷基；R4從下列基團(tuán)中選擇-H、鹵素、烷基、羥基、烷氧基、-NR15R16；R6、R8從以下基團(tuán)中選擇-H、烷基、取代及未取代的芳香基、取代及未取代的雜芳香基；R7是C(O)R12，C(O)R12中的R12是-NR13(CH2)nR14，-NR13(CH2)nR14中的R13是-H或者未取代的低鏈烷基，-NR13(CH2)nR14中的R14是-NR15R16或-N+(O)R15R16，n是2或者3；R9從以下基團(tuán)中選擇-H、烷基、環(huán)烷基、未取代或取代的芳香基、未取代或取代的雜芳香基，R9和R8可以結(jié)合形成環(huán)烷，雜環(huán)基團(tuán)；R10和R11獨(dú)立地從以下基團(tuán)中選擇-H、烷基、芳香基；R15和R16獨(dú)立地從以下基團(tuán)中選擇-H、烷基、以及被羥基、氨基烷基、氰基烷基、環(huán)烷基、芳香基和雜芳香基取代的低鏈烷基；R15和R16可以結(jié)合形成雜環(huán)基團(tuán)；R17從以下基團(tuán)中選擇-H、羥基、烷氧基、芳氧基；R18從以下基團(tuán)中選擇羥基、-C(O)R17、-NR15R16和-C(O)NR15R16；r是1，2，3，或者4。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物或其藥理上可接受的鹽，其特征在于 Rl， R5是-H ;R2是-Cl、-F、-Br或者氰基； R3是-Cl、-F、-Br或者氰基； R4是-H ; R6是低鏈烷基；R7是-C (0) R12， C (0) R12中的R12是_NR13 (CH2) nR14， _NR13 (CH2) nR14中的R13是_H或者未取 代的低鏈烷基，_NR13(CH2)nR14中的R14是_NR15R16， _NR15R16是獨(dú)立的未被取代的低鏈烷基，n是2或者3 ;R8是低鏈烷基； R9是-H。
3. 如權(quán)利要求1所述的化合物或其藥理上可接受的鹽，其特征在于R7選自N-(2-二 甲氨基乙基)胺基羰基、N-甲基胺基羰基、N-(3-二甲基氨基丙基)胺基羰基、N-(2-二乙 基氨基乙基)胺基羰基、^(2-乙基氨基乙基)胺基羰基、^(3-乙基氨基丙基)胺基羰基 或N-(3-二乙基氨基丙基)胺基羰基。
4. 如權(quán)利要求1所述的化合物或其藥理上可接受的鹽，其特征在于它為5_ [ (Z) -2-腈基-2- (2-氯苯基)-乙烯基]-2， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧酸-(2- 二乙 氨基-乙基)-酰胺，或5- [ (Z) -2-腈基-2- (2-溴苯基)-乙烯基]-2， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧酸-(2- 二 乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2-(2-甲基苯基)-乙烯基]-2，4-二甲基-lH-吡咯_3_羧 酸-(2-二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[ (Z) -2-腈基-2- (2-三氟甲基苯基)-乙烯基]-2， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧 酸-(2-二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2-(2-甲氧基苯基)-乙烯基]-2，4-二甲基-111-吡咯-3-羧 酸-(2-二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2-(3-甲基苯基)-乙烯基]-2，4-二甲基-lH-吡咯_3_羧 酸-(2-二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[ (Z) -2-腈基-2- (3-三氟甲基苯基)-乙烯基]-2， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧 酸-(2-二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2-(3，4-二氯苯基)-乙烯基]-2，4-二甲基-lH-吡咯_3_羧 酸-(2-二乙氨基-乙基)-酰胺，或5- [ (Z) -2-腈基-2- (4-甲基苯基)-乙烯基]-2 ， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧 酸-(2-二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2-(4-甲氧基苯基)-乙烯基]-2，4-二甲基-111-吡咯-3-羧 酸-(2-二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[ (Z) -2-腈基-2- (4-三氟甲基苯基)-乙烯基]-2， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧 酸-(2-二乙氨基-乙基)-酰胺，或5- [ (Z) -2-腈基-2- (3-氟苯基)-乙烯基]-2， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧酸-(2- 二 乙氨基-乙基)-酰胺，或5- [ (Z) -2-腈基-2- (3-氯苯基)-乙烯基]-2， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧酸-(2- 二 乙氨基-乙基)-酰胺，或5- [ (Z) -2-腈基-2- (3-溴苯基)-乙烯基]-2， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧酸-(2- 二 乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[ (Z) -2-腈基-2- (3， 4- 二甲基苯基)_乙烯基]_2， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧 酸-(2-二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2-(3-甲基-4-甲氧基苯基)-乙烯基]-2，4-二甲基-lH-吡咯-3_羧酸_ (2- 二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2-(3-甲氧基_4-甲基苯基)-乙烯基]-2，4-二甲基-lH-吡 咯_3-羧酸_(2- 二乙氨基-乙基)_酰胺，或5- [ (Z) -2-腈基-2- (3， 4- 二甲氧基苯基)-乙烯基]-2， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧 酸-(2-二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2-(3-甲氧基苯基)-乙烯基]-2，4-二甲基-111-吡咯-3-羧 酸-(2-二乙氨基-乙基)-酰胺，或5-[(Z)-2-腈基-2-(2，4-二氯苯基)-乙烯基]-2，4-二甲基-lH-吡咯_3_羧 酸-(2-二乙氨基-乙基)-酰胺，或5- [ (Z) -2-腈基-2- (2 ， 3- 二氯苯基)-乙烯基]-2 ， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧 酸-(2-二乙氨基-乙基)-酰胺，或5- [ (Z) -2-腈基-2- (3-氟-4-苯磺酸基)-乙烯基]-2， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧 酸-(2-二乙氨基-乙基)-酰胺，或5- [ (Z) -2-腈基-2- (3-氟苯基)-乙烯基]-2， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧酸-(2- 二 乙氨基_乙基)_酰胺_ (2S)-羥基丁二酸鹽，或5- [ (Z) -2-腈基-2- (3-氯苯基)-乙烯基]-2， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧酸-(2- 二 乙氨基_乙基)_酰胺_ (2S)-羥基丁二酸鹽，或5-[(Z)-2-腈基-2-(3，4-二氯苯基)-乙烯基]-2，4-二甲基-lH-吡咯_3_羧 酸-(2- 二乙氨基-乙基)-酰胺-(2S)-羥基丁二酸鹽，或5-[(Z)-2-腈基-2-(2，4-二氯苯基)-乙烯基]-2，4-二甲基-lH-吡咯_3_羧 酸-(2- 二乙氨基-乙基)-酰胺-(2S)-羥基丁二酸鹽，或5- [ (Z) -2-腈基-2- (2 ， 3- 二氯苯基)-乙烯基]-2 ， 4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧 酸-(2- 二乙氨基-乙基)-酰胺-(2S)-羥基丁二酸鹽。
5.制備權(quán)利要求1 4所含具有通式(I)的任意一種化合物的方法，由通式(II)化合 物與通式(III)化合物在堿性條件下縮合得到通式(I)化合物。<formula>formula see original document page 4</formula>
6. —種藥物組合物，其特征在于它含有 通式(I)化合物或者/和其藥理上可接受鹽，任選的藥理上可接受的輔劑，或者，所述藥物組合物還含有任選的含有一種或多種已知藥物化合物。
7. —種藥物組合物，其特征在于它含有權(quán)利要求2和權(quán)利要求4中任意一種化合物或者/和權(quán)利要求2和權(quán)利要求4中任意 一種化合物的藥理上可接受的鹽， 任選的藥理上可接受的輔劑。或者，所述藥物組合物還含有任選的含有一種或多種已知藥物化合物。
8. 權(quán)利要求1、權(quán)利要求2、和權(quán)利要求4所述的任一化合物或其藥理上可接受的鹽和 任選的藥理上可接受的輔劑制備的藥物制劑在治療或者預(yù)防有機(jī)體中和蛋白激酶相關(guān)疾 病中的應(yīng)用。
9. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述蛋白激酶相關(guān)疾病選自受體酪氨酸激酶相關(guān)的 疾病。
10. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述蛋白激酶相關(guān)疾病選自表皮生長(zhǎng)因子受體 相關(guān)的疾病、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體相關(guān)的疾病、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體相關(guān)的疾病和 C-KIT相關(guān)的疾病。
11. 如權(quán)利要求8所述的用途，其中所述蛋白激酶相關(guān)疾病選自良性腫瘤。
12. 如權(quán)利要求8所述的用途，其中所述蛋白激酶相關(guān)疾病選自惡性腫瘤，所述惡性腫 瘤包括所有來(lái)源于上皮細(xì)胞的癌癥、來(lái)源于中胚層細(xì)胞的惡性肉瘤、來(lái)源于血液系統(tǒng)的白 血病、來(lái)源于淋巴系統(tǒng)的惡性淋巴瘤以及來(lái)源于生殖細(xì)胞的惡性腫瘤。
13. 如權(quán)利要求8所述的用途，其中所述蛋白激酶相關(guān)疾病選自肺癌、肝癌、腎癌、胃 癌、大腸癌、前列腺癌、乳腺癌、食道癌，胰腺癌，卵巢癌、宮頸癌、白血病、淋巴瘤、腦瘤、甲狀 腺癌、泌尿生殖道癌以及惡性肉瘤。
14. 如權(quán)利要求8所述的用途，其中所述蛋白激酶相關(guān)疾病選自代謝性疾病、自身免疫 性疾病、炎癥性疾病、過(guò)度增殖性疾病、心腦血管疾病、以及骨關(guān)節(jié)疾病。
15. 如權(quán)利要求8至14任一所述的用途，其特征在于所述疾患的受累有機(jī)體是哺乳動(dòng) 物，特別是人類(lèi)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一類(lèi)新的酪氨酸激酶抑制劑，它們?yōu)榫哂腥缤ㄊ?I)的(Z)-2-苯基-3-(吡咯-2-基)-丙烯腈衍生物或其藥理上可接受的鹽，其制備方法及其在治療或者預(yù)防有機(jī)體中和蛋白激酶相關(guān)疾病中的應(yīng)用；本發(fā)明還提供了含有通式(I)化合物或者/和其藥理上可接受鹽的藥物組合物。
文檔編號(hào)A61P9/00GK101696183SQ200910154428
公開(kāi)日2010年4月21日 申請(qǐng)日期2009年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月27日
發(fā)明者丁佳逸, 陳鴻翔 申請(qǐng)人:杭州新瑞佳生物醫(yī)藥技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;