專利名稱：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗蟲棉的檢測方法，具體地說，涉及一種用單粒棉籽快速檢測轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的方法。
背景技術(shù)：
目前，檢測轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的方法主要有以下四種。
PCR(po1ymerase chains reaction)方法。針對現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花普遍含有的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Sad1、CaMV35S啟動子、nos終止子、以及各類型cry1A抗蟲基因，設(shè)計這些基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測棉花中是否含有轉(zhuǎn)基因成分。該方法僅限于實(shí)驗(yàn)室研究，且需要專門的檢測儀器如PCR擴(kuò)增儀等，檢測成本高，一般公司和育種單位或個人難于承受高昂的檢測費(fèi)用。
外源抗蟲基因表達(dá)殺蟲蛋白定量檢測方法。用ELISA方法檢測樣品中外源抗蟲基因表達(dá)的殺蟲蛋白量。需要專門的試驗(yàn)儀器酶標(biāo)儀和試劑盒，檢測成本高，檢測費(fèi)用偏高。
硫酸卡那霉素溶液涂抹法。子葉期或苗期在棉花葉片上涂抹卡那霉素溶液2000-3000ppm，7天后檢查葉片的顏色，葉片顏色正常的為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，葉片顏色變?yōu)辄S色的為非轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。該方法最大的缺點(diǎn)是準(zhǔn)確度不夠，研究標(biāo)明其準(zhǔn)確度只有80％左右，誤差很大，只能表明抗蟲基因的存在，不能表明基因是否表達(dá)和表達(dá)的效果即抗蟲性如何。其次是試驗(yàn)周期太長，必須用棉花的葉片進(jìn)行檢測。
生物測定的方法。田間或網(wǎng)室中種植受檢的棉花品種，苗期采摘上部嫩葉，接棉鈴蟲幼蟲，5-6天后觀察其死亡率。該檢測方法試驗(yàn)周期在30天以上，不能達(dá)到快速檢測轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的要求。
由于我國在轉(zhuǎn)基因抗蟲棉快速檢測方面缺乏真正快速、簡便、低成本而又準(zhǔn)確有效的方法，嚴(yán)重制約了轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的檢測和篩選，同時給農(nóng)業(yè)執(zhí)法部門增加了難度，致使種子市場良莠不齊、魚目混珠、坑農(nóng)的現(xiàn)象時有發(fā)生，阻礙了種子產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程。加速我國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花的育種進(jìn)程以及規(guī)范種子市場、保護(hù)棉農(nóng)的利益、使種子產(chǎn)業(yè)化走向良性軌道有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
為克服已有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是應(yīng)用單粒棉籽快速檢測轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。
本發(fā)明提供一種快速檢測轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的方法，其包括將待測轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的棉籽萌動，與棉鈴蟲人工飼料混合，放在養(yǎng)蟲盒內(nèi)并接棉鈴蟲幼蟲，測定該棉鈴蟲幼蟲的死亡率，將其與用轉(zhuǎn)基因抗蟲棉和非轉(zhuǎn)基因抗蟲棉在相同條件下測出的棉鈴蟲幼蟲死亡率比較，判別所測轉(zhuǎn)基因抗蟲棉是否為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。
本發(fā)明提供一種快速檢測轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的方法，可以包括(1)每品種(系)取待測棉的種子數(shù)粒，浸泡于常溫水中，重復(fù)幾次；(2)配制所述棉鈴蟲人工飼料，放于消毒過的養(yǎng)蟲盒中；(3)取浸泡的棉籽勻漿，轉(zhuǎn)入所述養(yǎng)蟲盒中，并與盒中的所述飼料攪拌均勻；(4)加入水瓊脂溶液，于所述養(yǎng)蟲盒中，并快速攪拌均勻待其凝固；(5)在所述養(yǎng)蟲盒接棉鈴蟲幼蟲，并將所述養(yǎng)蟲盒置于常溫光照培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)；(6)幾天后，統(tǒng)計所述養(yǎng)蟲盒的各孔中棉鈴蟲的存活數(shù)量，計算死亡率；(7)按照上述方法用常規(guī)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉和非轉(zhuǎn)基因抗蟲棉在相同條件下測出的棉鈴蟲幼蟲死亡率范圍；(8)將第(6)步計算出的死亡率與第(7)步的死亡率范圍比較，判別所測轉(zhuǎn)基因抗蟲棉是否為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。
本發(fā)明的方法可以包括
(1)每品種(系)取待測棉的種子24粒，浸泡于25℃水中，浸泡時間為72h，每個品種均重復(fù)三次；(2)配制棉鈴蟲人工飼料，并用萬分之一電子天平稱量，放于24孔養(yǎng)蟲盒中，每孔0.5g，試驗(yàn)前用10％次氯酸鈉(NaClO)水溶液對養(yǎng)蟲盒進(jìn)行消毒；(3)于72h后，對浸泡的棉籽人工去殼，分別取所述單粒棉籽仁在研缽(內(nèi)徑5cm)中勻漿，分別將所述勻漿迅速轉(zhuǎn)入所述24孔養(yǎng)蟲盒中，并與盒中的所述飼料攪拌均勻；(4)按每1000ml蒸餾水17.5g瓊脂的比例，配置水瓊脂溶液，待熔化的瓊脂溫度降至約40～50℃時，分別取該水瓊脂溶液約1ml放于所述24孔養(yǎng)蟲盒中，并快速攪拌均勻待其凝固；(5)在所述24孔養(yǎng)蟲盒的各孔中接1頭棉鈴蟲的2日齡幼蟲，并將所述24孔養(yǎng)蟲盒置于25℃光照培養(yǎng)箱(濕度75％、光暗比為14∶10)中飼養(yǎng)；(6)3天后，統(tǒng)計養(yǎng)蟲盒的各孔中棉鈴蟲的存活數(shù)量，計算死亡率，判別是否為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉；判別標(biāo)準(zhǔn)為棉鈴蟲死亡率高于65％以上的棉花品種為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，而死亡率低于40％的棉花品種為非轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。
應(yīng)用本發(fā)明的檢測方法對轉(zhuǎn)基因抗蟲棉進(jìn)行檢測，具有以下優(yōu)點(diǎn)1、檢測周期短，一般為7天左右。和硫酸卡那霉素溶液涂抹法和生物測定法相比，試驗(yàn)周期縮短23天左右。
2、檢測成本低廉。本發(fā)明的檢測方法只需要購買瓊脂、養(yǎng)蟲盒等常用試驗(yàn)用品，棉鈴蟲的價格為每頭0.03元人民幣，成本降低50％～80％。
3、準(zhǔn)確性高。對100多個品種的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉和常規(guī)棉(非轉(zhuǎn)基因抗蟲棉)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，準(zhǔn)確率為100％，比現(xiàn)有檢測方法提高約20個百分點(diǎn)。
4、重復(fù)性好。在相同條件下，重復(fù)檢測，結(jié)果一致性好，比現(xiàn)有方法提高約20個百分點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
下面將通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，這些描述并不是對本發(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一步的限定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，對本發(fā)明內(nèi)容所作的等同替換，或相應(yīng)的改進(jìn)，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1(1)分別取待測棉1、2和待測棉3、4的種子24粒，浸泡于25℃水中，浸泡時間為72h，每個品種均重復(fù)三次；(2)配制棉鈴蟲人工飼料，并用萬分之一電子天平稱量，放于24孔養(yǎng)蟲盒中，每孔0.5g，試驗(yàn)前用10％次氯酸鈉(NaClO)水溶液對養(yǎng)蟲盒進(jìn)行消毒；(3)于72h后，對浸泡的棉籽人工去殼，分別取所述單粒棉籽仁在研缽(內(nèi)徑5cm)中勻漿，分別將所述勻漿迅速轉(zhuǎn)入所述24孔養(yǎng)蟲盒中，并與盒中的所述飼料攪拌均勻；(4)按每1000ml蒸餾水17.5g瓊脂的比例，配置水瓊脂溶液，待熔化的瓊脂溫度降至約40～50℃時，分別取該水瓊脂溶液約1ml放于所述24孔養(yǎng)蟲盒中，并快速攪拌均勻待其凝固；(5)在所述24孔養(yǎng)蟲盒的各孔中接1頭棉鈴蟲的2日齡幼蟲，并將所述24孔養(yǎng)蟲盒置于25℃光照培養(yǎng)箱(濕度75％、光暗比為14∶10)中飼養(yǎng)；(6)3天后，統(tǒng)計養(yǎng)蟲盒的各孔中棉鈴蟲的存活數(shù)量，計算出待測棉1、2和待測棉3、4的棉鈴蟲死亡率分別為68％、75％和38％、20％，故待測棉1、2為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，且待測棉3、4為非轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。
待測棉1、2實(shí)際為中棉所41、中棉所45，均由中國農(nóng)科院棉花研究所育種室提供，其棉鈴蟲死亡率分別約為68％、75％，是轉(zhuǎn)基因抗蟲棉；且待測棉3、4實(shí)際為中棉所35和中棉所23，均由中國農(nóng)科院棉花研究所育種室提供，其棉鈴蟲死亡率分別約為38％、20％，是非轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。因此本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際相符。
權(quán)利要求
1.一種快速轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的檢測方法，其特征所述檢測方法包括將待測轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的棉籽萌動，然后與棉鈴蟲人工飼料混合，接棉鈴蟲幼蟲，測定該棉鈴蟲幼蟲的死亡率，以此判別是否為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征是該方法包括(1)每品種(系)取待測棉的種子數(shù)粒，浸泡于常溫水中，重復(fù)幾次；(2)配制所述棉鈴蟲人工飼料，放于消毒過的養(yǎng)蟲盒中；(3)取浸泡的棉籽勻漿，轉(zhuǎn)入所述養(yǎng)蟲盒中，并與盒中的所述飼料攪拌均勻；(4)加入水瓊脂溶液，于所述養(yǎng)蟲盒中，并快速攪拌均勻待其凝固；(5)在所述養(yǎng)蟲盒接棉鈴蟲幼蟲，并將所述養(yǎng)蟲盒置于常溫光照培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)；(6)幾天后，統(tǒng)計所述養(yǎng)蟲盒的各孔中棉鈴蟲的存活數(shù)量，計算死亡率；(7)按照上述方法用常規(guī)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉和非轉(zhuǎn)基因抗蟲棉在相同條件下測出的棉鈴蟲幼蟲死亡率范圍；(8)將第(6)步計算出的死亡率與第(7)步的死亡率范圍比較，判別所測轉(zhuǎn)基因抗蟲棉是否為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征是該方法包括(1)每品種(系)取待測棉的種子24粒，浸泡于25℃水中，浸泡時間為72h，每個品種均重復(fù)三次；(2)配制棉鈴蟲人工飼料，并用萬分之一電子天平稱量，放于24孔養(yǎng)蟲盒中，每孔0.5g，試驗(yàn)前用10％次氯酸鈉(NaClO)水溶液對養(yǎng)蟲盒進(jìn)行消毒；(3)于72h后，對浸泡的棉籽人工去殼，分別取所述單粒棉籽仁在研缽(內(nèi)徑5cm)中勻漿，分別將所述勻漿迅速轉(zhuǎn)入所述24孔養(yǎng)蟲盒中，并與盒中的所述飼料攪拌均勻；(4)按每1000ml蒸餾水17.5g瓊脂的比例，配置水瓊脂溶液，待熔化的瓊脂溫度降至約40～50℃時，分別取該水瓊脂溶液約1ml放于所述24孔養(yǎng)蟲盒中，并快速攪拌均勻待其凝固；(5)在所述24孔養(yǎng)蟲盒的各孔中接1頭棉鈴蟲的2日齡幼蟲，并將所述24孔養(yǎng)蟲盒置于25℃光照培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，濕度75％、光暗比為14∶10；(6)3天后，統(tǒng)計養(yǎng)蟲盒的各孔中棉鈴蟲的存活數(shù)量，計算死亡率；如死亡率高于65％以上，則待測棉為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，如死亡率低于40％，則待測棉為非轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。
全文摘要
一種快速轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的檢測方法，其特征所述檢測方法包括將待測轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的棉籽萌動，然后與棉鈴蟲人工飼料混合，放在養(yǎng)蟲盒內(nèi)并接棉鈴蟲幼蟲，測定該棉鈴蟲幼蟲的死亡率，判別是否為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。優(yōu)選判別標(biāo)準(zhǔn)為棉鈴蟲死亡率高于65％以上的棉花品種為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，而死亡率低于40％的棉花品種為非轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。該方法具有檢測周期短、檢測成本低廉、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號A61K49/00GK1818641SQ20061006487
公開日2006年8月16日 申請日期2006年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月16日
發(fā)明者崔金杰, 雒珺瑜, 申春玲, 馬艷, 白雪莉 申請人:崔金杰