專利名稱：水稻瘤矮病毒熒光定量rt-pcr檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種水稻瘤矮病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法，屬于植物檢疫技術(shù)領(lǐng)域，不僅適用于ロ岸檢驗檢疫部門對水稻瘤矮病毒的快速檢測，還可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)部門對水稻瘤矮病毒的實時監(jiān)測和預(yù)警預(yù)報。
背景技術(shù)：
水稻瘤矮病韋(Ricegall dwarf virus,RGDV)屬于呼腸孤病韋科(Reoviridae)、植物呼腸孤病毒屬(Phytoreovirus)成員之一,病毒粒子為等軸的二十面體結(jié)構(gòu),外觀為球形，直徑大約65nm-70nm。RGDV基因組包含12條雙鏈RNA片段，大小為3. 2 X 105-3. I X IO6Da
之間。該病毒在自然界中主要由黑尾葉蝶(Nephotettix cincticeps)和電光葉蝶(Reciladorsalis)以持久性方式經(jīng)卵傳播,不能以機械方式傳播。RGDV的自然寄主為水稻(Oryzasativa),在人工接種條件下，可侵染小麥(Triticum aestivum)、黑麥(Secale cereale)、大麥(Hordeum vu lgare Linn)、燕麥(Avena sativa)、思.大利黑麥草(Lolium multiflorum lam)、野生稻(Oryza ruf ipogon)和看麥娘(Alopecurus aequulis)。RGDV 侵染水稻可產(chǎn)生一系列的典型癥狀，包括植株嚴重矮縮，葉片短窄、硬直，葉色濃綠，莖節(jié)變短，分蘗減少，開花延遲，在葉背和葉鞘上長出淡黃緑色近圓形小瘤(大小約2mmX0. 5mm),帶有不完全的花序以及干癟的谷粒。RGDV引起的水稻瘤矮病自1980年首次在泰國發(fā)現(xiàn)以來，已相繼在馬來西亞、中國、日本、朝鮮和韓國等東南亞國家發(fā)生。水稻瘤矮病能夠引起水稻產(chǎn)量嚴重減產(chǎn)，重病田減產(chǎn)4500公斤/公頃，甚至絕收。鑒于RGDV侵染水稻后造成的危害大，迫切需要加強該病毒的檢測，以有效防止該病毒的傳播、蔓延及危害，保護我國水稻生產(chǎn)安全。目前，水稻瘤矮病毒缺乏商品化的血清學檢測試劑，因此該病毒的檢測主要采用普通RT-PCR方法(Deng等，Virologica Sinica, 2007, 22(4):294 300 ;Zhang等，Archivesof Virology, 2007,152 (9) : 1593 1602 ;王元平等，植物病理學報，2003，33 (2) :192)。近年來，隨著檢測技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的分子檢測方法被應(yīng)用到植物病毒檢測領(lǐng)域。熒光定量RT-PCR是在RT-PCR基礎(chǔ)上建立的病毒檢測方法，具有快速、準確、靈敏、不易污染和假陽性率低的優(yōu)點，該方法的原理是將熒光物質(zhì)加入到RT-PCR反應(yīng)體系中，通過對反應(yīng)過程中熒光信號強度的實時監(jiān)測，達到檢測PCR擴增產(chǎn)物的目的。TaqMan探針法是ー種應(yīng)用廣泛的熒光RT-PCR方法，迄今已成功應(yīng)用于多種植物病毒的快速檢測。但到目前為止，尚未見專門用于水稻瘤矮病毒檢測的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問題是提供ー種水稻瘤矮病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法，能夠快速、準確地檢測水稻瘤矮病毒，具有檢測時間短、特異性強、靈敏度高和操作簡便的優(yōu)點。本發(fā)明技術(shù)方案如下
(一)本發(fā)明為解決上述問題，以水稻瘤矮病毒外殼蛋白CP基因為靶目標，設(shè)計特異性引物和熒光探針，并經(jīng)過大量篩選實驗，確定適合的引物和熒光探針。其中正向引物的序列為5 ’ -TGATGTACTGCGCCAGGTTAATA-3，;反向引物的序列為:5’ -CCTTCAGAACCCCAAGTTGTCT-3’ ；熒光探針的序列為5’ -FAM-TGCAGCCAATGGAAAATCCAAAACTGAT-TAMRA-3’，熒光探針5’端標記的熒光報告基團是FAM，3’端標記的熒光淬滅基團是TAMRA0(ニ)本發(fā)明提供了 ー種用于水稻瘤矮病毒檢測的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其中包括上述引物和熒光探針，具體包括I)反轉(zhuǎn)錄酶200U/y L ；2) RNA 酶抑制劑40U/ μ L ；3) 5XRT Buffer ；4) dNTPs IOmmoI/L ；5) 2XBuffer ；6)正向引物10ymol/L ；7)反向引物10ymol/L ；8)熒光探針10ymol/L;9)水稻瘤矮病毒的陽性對照樣品；10)不含水稻瘤矮病毒的陰性對照樣品；11)RNase-freeddH20o (三)本發(fā)明還提供了上述水稻瘤矮病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑盒的檢測方法，具體包括以下步驟I)在PCR管中加入待測樣品總RNA 3 μ L、濃度為10 μ mol/L反向引物I μ L，95°C水浴7min后，迅速冷卻5min，再按每管加5XRT Buffer 2. 5 μ L、濃度為10mmol/LdNTPs O. 5 μ L、濃度為40U/ μ L RNA酶抑制劑O. 5 μ L、濃度為200U/ μ L反轉(zhuǎn)錄酶O. 5 μ L、RNase-free ddH20 4 μ L ;經(jīng) 37°C Ih 后，再 95°C IOmin 合成 cDNA ；2)取步驟 I)合成的 cDNA 3 μ L，加入 2XBuffer 12. 5 μ L、濃度為 10 μ mol/L正向引物I μし、濃度為10 μ mol/L反向引物I μ L、濃度為10 μ mol/L突光探針O. 5 μ L、RNase-free ddH20 7 μ L，使反應(yīng)總體積為25 μ L ;混合后的反應(yīng)液，95°C預(yù)變性30s，然后950C 5s,600C 30s,如此共40個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束；3)結(jié)果判定反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴增曲線判定結(jié)果，若待測樣品產(chǎn)生典型的擴增曲線，且Ct值小于35，則判定檢測到水稻瘤矮病毒，反之，則判定未檢測到水稻瘤矮病毒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的水稻瘤矮病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法有益效果在于1)檢測時間更短整個檢測過程在2-3小時內(nèi)即可完成；2)特異性更強特異性引物和熒光探針在PCR過程中可以對靶目標進行雙重控制；3)靈敏度更高熒光定量RT-PCR綜合了熒光標記、PCR、激光及數(shù)碼顯像等多種技術(shù)，使其靈敏度顯著提高；4)結(jié)果判定簡單PCR擴增結(jié)果在電腦上直接顯示，無需電泳、染色及紫外觀察等步驟，避免了使用有毒試劑和肉眼判斷結(jié)果的主觀性。


圖I為實施例2的水稻瘤矮病毒熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果。其中I :陽性對照；2 :攜帯有水稻瘤矮病毒的樣品；3 :陰性對照。圖2為實施例3的水稻樣品上水稻瘤矮病毒的檢測結(jié)果。其中I :陽性對照；2_3 待檢測的水稻樣品；4 :陰性對照。圖3為實施例4的特異性驗證結(jié)果。其中I :水稻瘤矮病毒(RGDV)樣品；2 :水稻矮縮病毒(RDV)樣品；3 :水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)樣品；4 :水稻鋸齒葉矮縮病毒(RRSV)樣品；5 :水稻條紋病韋(RSV)樣品；6 :水稻早狀矮化病韋(RGSV)樣品；7 :健康水稻樣品。
具體實施例方式以下通過具體實施例對本發(fā)明作進ー步說明。實施例I :水稻瘤矮病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑盒的配置(10次檢測量)I)反轉(zhuǎn)錄酶200υ/μ L，1 管(5μ L);2) RNA 酶抑制劑:40U/y L，I 管(5μ L);3) 5XRT Buffer，I 管(25μ L);4) dNTPs :10mmol/L，I 管(5μ L);
5) 2XBuffer，I 管(125 μ L);6)正向引物10 μ mol/L, I 管(30μ L)；7)反向引物10 μ mol/L, I 管(30μ L)；8)突光探針10 μ mol/L, I 管(10 μ L);9)水稻瘤矮病毒的陽性對照樣品，I管(30 μ L);10)不含水稻瘤矮病毒的陰性對照樣品，I管(30 μ L);11) RNase-free ddH20,1 管(lmL)。實施例2 :水稻瘤矮病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑盒的檢測方法上述水稻瘤矮病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟I)在PCR管中加入待測樣品總RNA 3 μ L、濃度為10 μ mol/L反向引物I μ L，95°C水浴7min后，迅速冷卻5min，再按每管加5XRT Buffer 2. 5 μ L、濃度為10mmol/LdNTPs O. 5 μ L、濃度為40U/ μ L RNA酶抑制劑0. 5 μ L、濃度為200U/ μ L反轉(zhuǎn)錄酶0. 5 μ L、RNase-free ddH20 4 μ L ;經(jīng) 37°C Ih 后，再 95°C IOmin 合成 cDNA ；2)取步驟 I)合成的 cDNA 3 μ L，加入 2XBuffer 12. 5 μ L、濃度為 10 μ mol/L正向引物I μし、濃度為10 μ mol/L反向引物I μ L、濃度為10 μ mol/L突光探針O. 5 μ L、RNase-free ddH20 7 μ L，使反應(yīng)總體積為25 μ L ;混合后的反應(yīng)液，95°C預(yù)變性30s，然后950C 5s,600C 30s,如此共40個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束；3)結(jié)果判定反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴增曲線判定結(jié)果，若待測樣品產(chǎn)生典型的擴增曲線，且Ct值小于35，則判定檢測到水稻瘤矮病毒(圖1)，反之，則判定未檢測到水稻瘤矮病毒。實施例3 :水稻樣品上水稻瘤矮病毒的檢測I)水稻樣品總RNA的提取取0. Ig水稻樣品，用液氮研磨成粉末狀，迅速轉(zhuǎn)移至I. 5mL離心管中，加入ImL Trizol,劇烈震蕩搖勻,4°C下12000g離心IOmin除去不溶物,將上清轉(zhuǎn)入新的I. 5mL離心管中，室溫下靜置5min，加入0. 2mL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫下靜置3min后,4°C下12000g離心15min,將水相轉(zhuǎn)入新的I. 5mL離心管中，加入0. 5mL異丙醇，將管中液體輕輕顛倒混勻，室溫靜置5min后，4°C下12000g離心lOmin，棄上清。沉淀用75%こ醇(RNase-freeddH20配置)洗滌沉淀2次，每次4°C下7500g離心5min，棄こ醇。沉淀干燥后，加入25 μ LRNase-free ddH20溶解，_70°C保存?zhèn)溆茫?)在PCR管中加入待測樣品總RNA 3 μ L、濃度為10 μ mol/L反向引物I μ L，95°C水浴7min后，迅速冷卻5min，再按每管加5XRT Buffer 2. 5 μ L、濃度為10mmol/LdNTPs O. 5 μ L、濃度為40U/ μ L RNA酶抑制劑0. 5 μ L、濃度為200U/ μ L反轉(zhuǎn)錄酶0. 5 μ L、RNase-free ddH20 4 μ L ;經(jīng) 37°C Ih 后，再 95°C IOmin 合成 cDNA ；3)取步驟 I)合成的 cDNA 3 μ L，加入 2XBuffer 12. 5 μ L、濃度為 10 μ mol/L正向引物Iu L、濃度為10 μ mol/L反向引物I μ L、濃度為10 μ mol/L突光探針O. 5 μ L、RNase-free ddH20 7 μ L，使反應(yīng)總體積為25 μ L ;混合后的反應(yīng)液，95°C預(yù)變性30s，然后950C 5s,600C 30s,如此共40個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束；4)結(jié)果判定反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴增曲線判定結(jié)果，采用上述步驟檢測的樣品I、樣品2產(chǎn)生典型的擴增曲線，Ct值分別為26. 34和29. 59，表明樣品I和樣品2檢測到水稻瘤矮病毒，結(jié)果見圖2。實施例4 :水稻瘤矮病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑盒的特異性驗證分別以攜帶有水稻瘤矮病韋(RGDV)、水稻矮縮病韋(Rice dwarf virus, RDV)、水 稻黑條矮縮病韋(Rice black streaked dwarf virus,RBSDV)、水稻銀齒葉矮縮病韋(Riceragged stunt virus, RRSV)、水稻條紋病毒(Rice stripe virus, RSV)、水稻草狀矮化病毒(Rice grassy stunt virus, RGSV)的水稻樣品為材料,采用實施例3方法提取樣品總RNA后進行檢測。從圖3可見，僅水稻瘤矮病毒樣品有產(chǎn)生典型的擴增曲線(Ct值為26. 55)，其他病毒樣品和健康樣品均無，說明本發(fā)明試劑盒具有良好的特異性。序列表<110>福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>水稻瘤矮病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法〈130〉<160>3<170>PatentIn version 3. 3〈210〉I<211>23<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉Itgatgtactg cgccaggtta ata23<210>2<211>22<212>DNA〈213〉人工序列<400>2ccttcagaac cccaagttgt ct22<210>3<211>28<212>DNA〈213〉人工序列<400>3tgcagccaat ggaaaatcca aaactgat28
權(quán)利要求
1.ー種水稻瘤矮病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括1)反轉(zhuǎn)錄酶200υ/μ L ;2) RNA 酶抑制劑40U/y L ；3)5XRT Buffer ；4)dNTPs 10mmol/L ；5)2XBuffer ;6)正向引物10 μ mol/L，引物序列為 5，-TGATGTACTGCGCCAGGTTAATA-3’ ；7)反向引物10ymol/L，引物序列為 5，-CCTTCAGAACCCCAAGTTGTCT-3’ ；8)熒光探針=IOymol/し探針序列為 5’ -FAM-TGCAGCCAATGGAAAATCCAAAACTGAT-TAMRA-3’，熒光探針 5’ 端標記的突光報告基團是FAM, 3’端標記的突光淬滅基團是TAMRA ；9)水稻瘤矮病毒的陽性對照樣品；10)不含水稻瘤矮病毒的陰性對照樣品；11) RNase-free ddH20。
2.利用權(quán)利要求I所述的水稻瘤矮病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 1)在PCR管中加入待測樣品總RNA3 μ L、濃度為10 μ mol/L反向引物lyL，95°C水浴7min后，迅速冷卻5min,再按甸管加5XRT Buffer 2. 5 μ L、濃度為10mmol/L dNTPsO.5 μ L、濃度為40U/ μ L RNA酶抑制劑O. 5 μ L、濃度為200U/ yL反轉(zhuǎn)錄酶O. 5yL、RNase-free ddH20 4 μ L ;經(jīng) 37°C Ih 后，再 95°C IOmin 合成 cDNA ； 2)取步驟I)合成的cDNA3 μ L，加入2XBuffer 12. 5 μ L、濃度為10 μ mol/L正向引物I μ L、濃度為10 μ mol/L反向引物I μ L、濃度為10 μ mol/L熒光探針0. 5 μ L,RNase-freeddH20 7 μ L，使反應(yīng)總體積為25 μ L ;混合后的反應(yīng)液，95 °C預(yù)變性30s，然后95 °C 5s、60°C 30s,如此共40個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束； 3)結(jié)果判定反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴增曲線判定結(jié)果，若待測樣品產(chǎn)生典型的擴增曲線，且Ct值小于35，則判定檢測到水稻瘤矮病毒，反之，則判定未檢測到水稻瘤矮病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種水稻瘤矮病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法，專用于水稻瘤矮病毒的檢測。該試劑盒包括反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、5×RT Buffer、dNTPs、2×Buffer、正向引物、反向引物、熒光探針、水稻瘤矮病毒的陽性對照樣品、不含水稻瘤矮病毒的陰性對照樣品和RNase-free ddH2O。利用該試劑盒檢測水稻瘤矮病毒，具有操作簡便、靈敏度高、特異性強和準確度好的顯著優(yōu)點，可有效應(yīng)用于口岸檢疫及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上水稻瘤矮病毒的快速檢測，應(yīng)用前景十分廣泛。
文檔編號C12Q1/68GK102676702SQ20121019428
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月10日
發(fā)明者沈建國, 蔡偉, 閆誠, 高芳鑾 申請人:福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心