專利名稱：一種重組染色質(zhì)修飾蛋白1a及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組蛋白，尤其涉及一種重組染色質(zhì)修飾蛋白IA及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
( 一 ) Chmp IA生物學(xué)特性染色質(zhì)修飾蛋白IA(Chromatin modifying protein 1A,Chmp 1A)屬于 ESCRT-III復(fù)合物家族成員。ESCRT-III成分及其相關(guān)蛋白統(tǒng)稱為Chmps，所有的Chmps蛋白有相似的結(jié)構(gòu)均編碼一個大約200個氨基酸的ORF ;具有一個coiled-coil區(qū)域和ujnnnnnn電荷基團(tuán)，堿性位于N-末端，酸性位于C-末端。ChmplA在哺乳動物中是高度保守的，開放閱讀 框(ORF)全長591個核苷酸，編碼197個氨基酸。ChmplA在囊泡和多泡體(MVB)的形成過程中起著關(guān)鍵作用，且與早期和晚期內(nèi)體膜結(jié)構(gòu)具有直接相關(guān)性。
Stauffer等將不同種類細(xì)胞的胞質(zhì)和核基質(zhì)進(jìn)行分離，然后通過western blot進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在胞質(zhì)和核基質(zhì)中均有ChmplA表達(dá),且在核基質(zhì)中出現(xiàn)32kD和34kD兩種蛋白表達(dá)形式，而在胞質(zhì)中只有32kD —種形式，在細(xì)胞有絲分裂的各個階段ChmplA在胞質(zhì)和核基質(zhì)中濃度的比率基本不變。但通過免疫細(xì)胞化學(xué)和共聚焦顯微鏡實時檢測發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞分裂早期ChmplA主要分布于胞質(zhì)，而在分裂末期主要聚集在核基質(zhì)，該現(xiàn)象可能由于ChmplA有一個抗原表位通常被屏蔽，以至于抗體不能有效識別。有研究表明，ChmplA可能是一種PcG蛋白，影響染色體結(jié)構(gòu)和細(xì)胞周期。PcG蛋白是一組通過染色質(zhì)修飾調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制子，從生化和功能上它可以分成兩個主要的核心蛋白復(fù)合體 PRCl (Polycomb repressive complex I)和 PRC2 (Polycomb repressivecomplex 2),生化和遺傳研究顯示PcG蛋白的沉默功能是通過對染色體結(jié)構(gòu)的修飾實現(xiàn)的。PRCI 蛋白由 M3 3/HPCI、Bmi -1、Me I -18、HPHI、HPH2、HPH3、HPC2、HPC3、SCMHI、RINGIA 和RINGlB組成一個約IMDa的異質(zhì)性多亞基蛋白復(fù)合體,PRC2蛋白由ESC (Extra Sex Combs)和Ez (Enhancer of Zeste)組成一個約600kDa核心復(fù)合體。PcG蛋白不僅控制個體正確的發(fā)育模式，而且與細(xì)胞的增殖、分化和腫瘤發(fā)生有關(guān)。在前列腺癌、非小細(xì)胞性肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中PcG蛋白表達(dá)均失調(diào)，且Mel-18已經(jīng)被證實是乳腺癌腫瘤抑制基因。通過酵母雙雜交篩選，ChmplA是一個與pci (PcG樣蛋白，可與多個PcG蛋白結(jié)合)結(jié)合的蛋白，激光掃描共聚焦顯示，ChmplA并不與染色體直接作用，而是與亞核結(jié)構(gòu)的外部結(jié)合，通過募集已知的PcG蛋白Bmi-I,使組蛋白磷酸化和乙?；?進(jìn)而濃縮染色質(zhì)，ChmplA與亞核結(jié)構(gòu)形成的復(fù)合物可以在一定程度上抵抗DNA酶的降解。爪蟾胚胎注射RNA顯示，ChmplA有著與PcG蛋白M33和Bmi-I相同的生物學(xué)效應(yīng)，均能抑制En_2and Rx2A的表達(dá)，并能破壞正常前神經(jīng)的生長發(fā)育。ChmplA與囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)有密切關(guān)系。囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)在生物合成、降解和細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中起著連接細(xì)胞器和運(yùn)輸?shù)淖饔谩?nèi)體在囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起著連接高爾基體、溶酶體和細(xì)胞膜的作用。囊泡以出芽的方式從內(nèi)體中釋放蛋白到細(xì)胞表面或高爾基體，囊泡內(nèi)的蛋白是被降解還是參與再循環(huán)取決于內(nèi)體膜向內(nèi)或向外出芽的競爭，如果內(nèi)體膜向內(nèi)凹陷形成MVB，MVB會將蛋白和水解酶運(yùn)送到溶酶體中。囊泡分選蛋白(Vps)作用是使羧肽酶Y(CPY)轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體中，E類Vps作用是使羧肽酶S (CPS)轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體中。研究發(fā)現(xiàn)，敲除ChmplA的細(xì)胞溶酶體中未檢測到CPY和CPS，而CPY和CPS均聚集在溶酶體膜表面，細(xì)胞中重新轉(zhuǎn)染ChmplA質(zhì)粒后CPY和CPS也被導(dǎo)入溶酶體內(nèi)部，暗示ChmplA在囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起重要作用。ChmplA可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。超表達(dá)ChmplA的細(xì)胞系誘導(dǎo)表達(dá)24小時后，細(xì)胞分裂系數(shù)減小了十倍，能進(jìn)行DNA復(fù)制的細(xì)胞比例降低了四倍，TUNEL實驗結(jié)果顯示該情況并不是細(xì)胞凋亡的結(jié)果；流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)ChmplA的細(xì)胞系處于S期的細(xì)胞有了明顯的增加(約占總細(xì)胞的80%左右)，且大多處于S期末期。ChmplA使細(xì)胞生長停滯于S期和減弱細(xì)胞DNA復(fù)制活性的能力暗示其可能是潛在的腫瘤抑制因子。ChmplA可改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)。通過對細(xì)胞進(jìn)行Hoechst 33258和 propidiumiodide染色后發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)細(xì)胞高表達(dá)ChmplA后，細(xì)胞內(nèi)核酸由點(diǎn)狀分布變?yōu)榫奂植迹砻鰿hmplA可以濃縮染色質(zhì)。激光掃描共聚焦顯微鏡顯示，ChmplA定位于亞細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的外部，而濃縮的染色質(zhì)在亞細(xì)胞核內(nèi)部，說明ChmplA濃縮染色質(zhì)的過程中并不與染色質(zhì)直接作用。染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化必然伴隨著組蛋白的修飾，用特異性抗體檢測組蛋白H3磷酸化和乙?；斤@示，誘導(dǎo)細(xì)胞高表達(dá)ChmplA后，組蛋白H3磷酸化和乙酰化水平明顯增加，說明ChmplA是通過修飾組蛋白起到濃縮內(nèi)部染色質(zhì)的作用。( 二 ) ChmplA 與腫瘤前期對ChmplA的功能性研究暗示,ChmplA可能與ESCRT復(fù)合物的其它成員一樣，在腫瘤形成的過程中起重要作用，其可能通過控制細(xì)胞生長和調(diào)節(jié)MVB形成過程中信號活性來影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。最近，Li等首次提出ChmplA是一個新穎的腫瘤抑制基因。研究發(fā)現(xiàn)，在多種癌癥病人(特別是胰腺癌)腫瘤組織中ChmplA的mRNA和蛋白水平表達(dá)均明顯降低；敲除ChmplA的非腫瘤細(xì)胞HEK293T，體外培養(yǎng)表現(xiàn)為非停泊性生長，體內(nèi)接種后可以促使腫瘤的形成；同樣，誘導(dǎo)ChmplA超表達(dá)的腫瘤細(xì)胞PanC-I，體外試驗表現(xiàn)為生長抑制，體內(nèi)接種后可以抑制腫瘤的形成。正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)外試驗暗示，ChmplA在腫瘤細(xì)胞的形成和發(fā)展中均起到重要作用。ChmplA抑制腫瘤細(xì)胞生長的機(jī)制目前還不清楚，有研究認(rèn)為ChmplA和TIFl ^蛋白均有coiled-coil區(qū)域，兩種蛋白可能通過該區(qū)域結(jié)合，避免了 p53泛素化，上調(diào)p53和phospho-p53兩種蛋白的表達(dá),該兩種蛋白參與了 DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡及抑制血管生成等過程，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。Li等實驗室的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)抑制胰腺癌也是通過ChmplA途徑。ATRA是最具生理活性的維甲酸類藥物，通過與受體RAR結(jié)合，抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡，該特性被用于抑制多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。CRBP-1 (Cellular retinol-binding protein I)是維甲酸生物合成和代謝的必須品，CRBP-I通過調(diào)節(jié)維甲酸的合成控制ATRA的活性。研究表明，在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌等腫瘤中CRBP-I的表達(dá)均明顯降低。ATRA、ChmplA和CRBP-I存在一個循環(huán)作用過程，ATRA上調(diào)ChmplA的表達(dá)，ChmplA又可以上調(diào)CRBP-I的表達(dá)，同時CRBP-I反過來提高ATRA的活性，ATRA最終通過ChmplA提高p53和ph0Sph0-p53兩種蛋白的活性，抑制腫瘤的生長。(三)TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)1997年，Vives等發(fā)現(xiàn)，TAT蛋白的47_57位氨基酸(YGRKKRRQRRR)是一個富含堿性氨基酸的多肽片段，該片段與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能相關(guān)，是蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的最小單位，稱為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)。TAT PTD介導(dǎo)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)過程不依賴于受體和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也不需要能量。一般認(rèn)為這一過程與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域中堿性氨基酸(精氨酸和賴氨酸)的存在有關(guān)，這些氨基酸帶有強(qiáng)的正電荷，可能通過直接與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜脂類相互作用而介導(dǎo)穿膜過程。應(yīng)用這一技術(shù)，已將相對分子質(zhì)量為15000 120000的數(shù)十種融合蛋白導(dǎo)人細(xì)胞內(nèi)，相當(dāng)于原來可通過細(xì)胞膜化合物的200倍。操作中只需將與PTD融合的分子直接加入到組織培養(yǎng)介質(zhì)中，15min內(nèi)胞內(nèi)便可達(dá)到最大濃度,且每個細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)濃度幾乎相同。Wadia等認(rèn)為PTD首先與細(xì)胞膜上的脂筏結(jié)合，并通過巨噬細(xì)胞胞飲作用迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部形成巨胞飲體，隨后，PH值的改變導(dǎo)致巨胞飲體膜穩(wěn)定性降低，最終釋放出PTD。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域在治療腫瘤性疾病已經(jīng)有深入研究。Chauhanc和Muthumani等報道了PTD能跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)抗原蛋白并增強(qiáng)抗原免疫性以抑制病毒復(fù)制及腫瘤的生長。Woo等設(shè)計的腫瘤疫苗將癌胚抗原(CEA)與PTD相連，可誘發(fā)有效的CTL反應(yīng)和INF-Y的分泌，對腫瘤動物進(jìn)行疫苗接種可顯著提高存活率。脆性組氨酸三聯(lián)體(FHIT)基因是在人類的一種抑癌基因，Zhao等利用HIV-TAT將外源的HlIT基因高效地導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，從而抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。Tasciotti等將TK與TAT融合并導(dǎo)入細(xì)胞，結(jié)果導(dǎo)致鄰近不表達(dá)該酶的細(xì)胞死亡。Guelen等構(gòu)建了一種新的融合蛋白TAT-Apoptin,與細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，TAT-Apoptin融合蛋白能誘導(dǎo)大部分的腫瘤細(xì)胞凋亡，而對正常細(xì)胞無殺傷性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種重組染色質(zhì)修飾蛋白1A，解決了 ChmplA蛋白不易分離純化且難于導(dǎo)入靶細(xì)胞，導(dǎo)致其對抗腫瘤效果較差的問題。 一種重組染色質(zhì)修飾蛋白1A，包括染色質(zhì)修飾蛋白1A，所述染色質(zhì)修飾蛋白IA的C端連接His-Tag，N端連接PTD序列，所述PTD序列的氨基酸序列為YGRKKRRQRRR，所述重組染色質(zhì)修飾蛋白IA的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所述His-Tag為多聚組氨酸標(biāo)簽，本發(fā)明由6個His連接組成。本發(fā)明還提供了一種編碼所述重組染色質(zhì)修飾蛋白IA的基因，堿基序列如SEQ IDNO. 4所示。本發(fā)明提供了一種包括所述基因的重組載體。優(yōu)選的，所述重組載體的原始載體為PPIC9K載體本發(fā)明提供了一種包括所述基因的轉(zhuǎn)化子。優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)化子的宿主細(xì)胞為畢赤酵母(Pichia pastoris)KM17。本發(fā)明提供了所述組染色質(zhì)修飾蛋白IA的制備方法，包括(I)提取人胎盤組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；(2)以cDNA為模板，利用堿基序列分別如SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示的引物P3和引物P4，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)將步驟⑵的擴(kuò)增產(chǎn)物連接于載體pGEM-T Easy中，得到質(zhì)粒pGEM-T-ChmplA ；(4)以質(zhì)粒pGEM-T-ChmplA為模板，利用堿基序列分別如SEQ ID NO. 7和SEQ IDNO. 8所示的引物PI和引物P2，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(5)步驟⑷的PCR產(chǎn)物回 收后，經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切，連接于載體pPIC9K中，得到質(zhì)粒 pPIC9K-PTD-ChmplA ；(6)將質(zhì)粒 pPIC9K-PTD-ChmplA 轉(zhuǎn)入畢赤酵母 KM17 ；(7)對內(nèi)含質(zhì)粒pPIC9K-PTD-ChmplA的畢赤酵母KM17進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，從培養(yǎng)基中分離純化得到所述的組染色質(zhì)修飾蛋白1A。本發(fā)明利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)和His-Tag純化技術(shù)得到的重組蛋白PTD-ChmplA具有天然蛋白的折疊結(jié)構(gòu)，且可以高效地導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞中。本發(fā)明又提供了所述的重組染色質(zhì)修飾蛋白IA在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明有益效果在于(I)在野生型ChmplA中引入His-tag標(biāo)簽,不會改變ChmplA的結(jié)構(gòu)且可以很容易地通過Ni-NTA Argarose蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化。(2)外源性野生型ChmplA蛋白不能進(jìn)入細(xì)胞,在野生型ChmplA中引入PTD序列，同樣不會改變ChmplA的結(jié)構(gòu)和活性,在PTD的引導(dǎo)下ChmplA可以有效的進(jìn)入腫瘤細(xì)胞,發(fā)揮ChmplA的抗腫瘤活性。(3)利用畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的PTD-ChmplA蛋白具有較高的穩(wěn)定性和活性。(4)畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)誘導(dǎo)后，PTD-ChmplA主要以分泌物形式存在于酵母工程菌培養(yǎng)基中，PTD-ChmplA蛋白粗制品獲得容易，且比菌體中的蛋白活性高。(5)所用的Ni-NTA Argarose蛋白純化系統(tǒng)操作簡單，得到的蛋白純度高。(6)PTD-ChmpIA蛋白作為腫瘤治療藥物效果顯著。


圖I是本發(fā)明PTD-ChmplA蛋白對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制曲線。圖2是野生型ChmplA蛋白和本發(fā)明PTD-ChmplA蛋白對腫瘤細(xì)胞遷移的抑制情況。圖3是野生型ChmplA蛋白和本發(fā)明PTD-ChmplA蛋白對腫瘤細(xì)胞克隆形成的抑制情況。圖4是PTD-ChmplA對腫瘤細(xì)胞侵襲作用的抑制情況；A. 5u g/ml PTD-ChmplA對A498和786-0腎腫瘤細(xì)胞侵襲作用的抑制情況；B.不同劑量PTD-ChmplA對A498細(xì)胞侵襲作用的抑制情況。圖5是野生型ChmplA蛋白和本發(fā)明PTD-ChmplA蛋白對腫瘤生長的抑制情況。圖6是野生型ChmplA蛋白和本發(fā)明PTD-ChmplA蛋白對腫瘤體積的抑制曲線。圖7是野生型ChmplA蛋白和本發(fā)明PTD-ChmplA蛋白對腫瘤重量的抑制情況。圖8是ChmplA基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列。圖9是PTD-ChmplA基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列。
具體實施例方式實施例I人胎盤組織mRNA的提取取50ug液氮中保存的人胎盤組織，用Trizol試劑盒一步法提取人胎盤組織總RNA，并用DNase (RNase-free)處理，除去肌肉中殘留的質(zhì)粒DNA。實施例2 RT-PCR 擴(kuò)增人 ChmplA取5ul人胎盤組織總RNA,利用引物oligo(dT)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成第一鏈cDNA ;以cDNA為模板，利用引物P3和P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后PCR產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳分析。P3 :5’ -CGGAATTCGCCATGGACGATACCCTGTT-3’P4 :5’ -TTGTCGACCGGGGCACGGC TAGTTCCTCAA-3’ PCR 反應(yīng)體系10 X PCR Buffer 5u IUOmM dNTPs 2 y I、P3 和 P4 引物各 2 y I、cDNA I u I、Taq plus DNA polymerase 2 U I> ddH20 36 U I,共計 50 U I。PCR 反應(yīng)條件94 °C 45s,54 °C 45s、72°C Imin 進(jìn)行 30 個循環(huán)，最后 72 °C 延伸IOmin0實施例3測序載體的構(gòu)建和序列測定用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化上述RT-PCR產(chǎn)物，利用T-A克隆策略直接連接于pGEM-T Easy載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐青霉素、X_gal和IPTG的LB平板上進(jìn)行篩選。對PCR和酶切鑒定陽性克隆進(jìn)行測序鑒定，ChmplA測序結(jié)果及推導(dǎo)的氨基酸序列見圖8。實施例4 PTD-ChmplA突變體的構(gòu)建根據(jù)克隆的Chmp IA序列，設(shè)計上下游引物PI和P2。PI : 5，-AGAATTCATG TA CGGCCGC4A GA4A CGCCGCCA GCGCCGCCGC
GACGATACCCTGTTCCAGTTGAAG-3，P 2 5，-AC GCGGCCGCC T A A TGA TGATGATGATGATG G T
TCCTCAAGGCGGCCAACC-3，，其中上游引物Pl引入了 PTD序列(斜體加粗)和EcoR I酶切位點(diǎn)(下劃線)，下游引物P2引入了 His-tag標(biāo)簽(斜體加粗)和Not I酶切位點(diǎn)(下劃線)。以pGEM-T-ChmplA 為模板，利用引物 Pl 和 P2，在 94°C lmin、58°C 45s,72°C Imin環(huán)境下30個循環(huán)進(jìn)行PCR，最后72°C延伸IOmin。PCR 反應(yīng)體系為10XPCR Buffer, 5 U I ；10mM dNTPs, I U I ；P1,1 U I ；P2,1 U I ；模板，I U I ;Taq plus DNA polymerase, I U I ;ddH20,40 U I。PCR 產(chǎn)物回收后，經(jīng) EcoR I和Not I雙酶切，酶切產(chǎn)物在T4 DNA連接酶的作用下連接到酵母誘導(dǎo)型表達(dá)載體PPIC9K中，從而構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-PTD-ChmplA，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐青霉素、X-gal和IPTG的LB平板上進(jìn)行篩選，PCR和酶切鑒定陽性克隆進(jìn)行測序鑒定。PTD-ChmplA突變體的測序結(jié)果及推導(dǎo)的氨基酸序列見圖9。實施例5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞重組質(zhì)粒鑒定正確后，取20 ii g質(zhì)粒用Sac I酶切線性化后溶解于10 U ITE溶液中，與80ii I酵母感受態(tài)細(xì)胞(Pichia pastoris KMl7)混勻,轉(zhuǎn)至遇冷的電轉(zhuǎn)化杯中，將電轉(zhuǎn)化杯冰浴5min，按照電轉(zhuǎn)參數(shù)(電壓I. 5kV，電容25 U F，電阻200 Q，電擊時間4. 00ms)電擊完畢后，加入Iml冰預(yù)冷的山梨醇溶液將菌體混勻，轉(zhuǎn)至I. 5ml的EP管中，將菌體重懸液涂布MD平板上，28°C培養(yǎng)24h后將菌體用300 u I DDff重懸涂布于200 u g/ml G418的抗性平板上。置于28°C培養(yǎng)到肉眼可見，選取酵母單菌落用煮-凍-煮方法制備模板，用PCR法進(jìn)行鑒定，確認(rèn)重組菌株。實施例6 PTD-ChmplA突變體蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)先將轉(zhuǎn)化pPIC9K-PTD-ChmplA 的畢赤酵母(Pichia pastoris) KM17 接種于 YPD平板上，28°C培養(yǎng)2d進(jìn)行活化；然后接種在50ml BMGY培養(yǎng)液中，28°C 250rpm/min培養(yǎng)至OD6tltlnm為2 6，室溫1500Xg離心5min，棄上清后，用BMMY培養(yǎng)液重懸細(xì)胞至OD6tltol為1，28°C、250rpm/min繼續(xù)震蕩培養(yǎng)4d，每24h補(bǔ)加5 %的甲醇使終濃度為0. 5 %，離心分別收集上清和沉淀，SDS-PAGE電泳進(jìn)行PTD-ChmplA表達(dá)鑒定，結(jié)果酵母表達(dá)載體表達(dá)的PTD-ChmplA蛋白主要以分泌物形式存在于含pMETB-PTD-ChmplA的畢赤酵母(Pichiapastoris) KMl7的BMMY培養(yǎng)基中，Bradford法測定PTD-ChmplA在畢赤酵母KM17中的表達(dá)量為約10 12%。實施例7 PTD-ChmplA突變體蛋白的純化甲醇誘導(dǎo)后的含pMETB-PTD-ChmplA的畢赤酵母KM17，4°C，5000 X g離心lOmin，取上清。向表達(dá)上清溶液緩緩加入硫酸銨固體至65%飽和度，攪拌20min，靜置30min，4°C，12000 X g離心20min，沉淀用PBS溶解，與4°C對PBS溶液透析36h，每12h更換PBS透析緩沖液，將透析袋中的蛋白質(zhì)溶液用Ni-NTA Argarose蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化。將蛋白質(zhì)溶液與I. 5ml 50%的Ni-NTA樹脂漿混合，4°C溫和混勻30min，2000Xg離心 30s 把樹脂沉淀下來,用 3ml Wash buffer (50mmol NaH2P04, 300mmol NaCl, 20mmo1咪唑，pH 8. 0)清洗3次,2000 X g離心30s,小心地棄去上清,用Elution buffer (50mmolNaH2P04,300mmol NaCl,250mmol 咪唑，pH 8. 0)洗脫 3 次，2000Xg 離心 lmin，上清透析去除咪唑后即為純化的PTD-ChmplA蛋白。實施例8純化后PTD-ChmplA蛋白的鑒定PTD-ChmplA純蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，利用ChmplA單克隆抗體進(jìn)行Westernblot檢測，并通過HPLC檢定純度> 98%。實施例9重組基因工程酵母菌的保存與穩(wěn)定性工程菌(轉(zhuǎn)化pPIC9K-PTD_ChmplA的酵母菌KM17)加30%的甘油，_70°C保存。為檢查工程菌的穩(wěn)定性，將原始菌種和傳代10次的菌種分別提取質(zhì)粒進(jìn)行序列測定。結(jié)果序列完全相同，證明本發(fā)明中的工程菌是十分穩(wěn)定的。實施例10 PTD-ChmplA突變體蛋白的保存與穩(wěn)定性PTD-ChmplA純蛋白加入磷酸緩沖液中，完全溶解后用微空濾膜過濾除菌，分裝后-20°C保存；或?qū)⒓兊鞍准尤胼o料制成凍干粉，分裝后-20°C保存。實施例11 PTD-ChmplA蛋白體外抑制腫瘤細(xì)胞的增殖取對數(shù)生長期的腎癌細(xì)胞A549，以5000個/孔的細(xì)胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板，37°C，5%的CO2條件下培養(yǎng)，24h后分成5組，分別加入終濃度為20 y g/ml PTD-ChmplA,5 u g/ml PTD-Chmp 1A> I u g/ml PTD-Chmp 1A>5 u g/ml 野生型 ChmplA 和 PBS,每組做 5 個重復(fù)。24、48、72小時后分別加入IOiU 5mg/ml的MTT，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去培養(yǎng)液，加入150 u I 二甲基亞砜(DMSO)，15min后酶標(biāo)儀上測各孔的0D490nm值。如圖I所示，與野生型ChmplA相比，3個劑量的PTD-ChmplA均可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，且呈劑量相關(guān)性；而、與PBS組比較，野生型ChmplA沒有出現(xiàn)明顯的腫瘤細(xì)胞抑制作用。實施例12 PTD-ChmplA蛋白抑制腫瘤細(xì)胞的遷移取對數(shù)生長期的腎癌細(xì)胞A549，以2X IO5個/孔的細(xì)胞濃度接種于6孔培養(yǎng)板，37°C，5%的CO2條件下培養(yǎng)。A498細(xì)胞生長到融合度達(dá)到95%時用200 yl移液槍槍頭在單層細(xì)胞上成“一”字劃痕，洗滌3次后加入5ml/孔不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，并分別加入終濃度為5 u g/ml PTD-ChmplA和5 y g/ml野生型ChmplA，觀察加藥后0h、24h、72h的腫瘤細(xì)胞遷移情況，如圖2所示，與野生型ChmplA比較，PTD-ChmplA蛋白可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。實施例13 PTD-ChmplA蛋白抑制腫瘤細(xì)胞的克隆形成能力 60mm的培養(yǎng)皿中接種5000個A498細(xì)胞，37°C，5%的CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞生長24h后分別加入終濃度為5 u g/ml PTD-ChmplA和5 y g/ml野生型ChmplA，加藥后72h觀察腫瘤細(xì)胞克隆形成情況，如圖3所示，與野生型ChmplA比較，PTD-ChmplA蛋白可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的克隆形成能力。實施例14 PTD-ChmplA蛋白抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力60mm的培養(yǎng)皿中分別接種2 X IO5個A498和786-0細(xì)胞，24h后分別加入PTD-ChmpIA和野生型ChmplA，37°C，5%的CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48h，棄上清，消化細(xì)胞，重懸于無血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為5 X IO5個/ml。取200 細(xì)胞懸液加入到Transwell的上室，將含5%胎牛血清的RPMI1640加入小室下室，37°C培養(yǎng)24h后移去Transwells,倒置,風(fēng)干。24孔板中加入500 y I含0. I %結(jié)晶紫,將小室置于其中，使膜浸沒在結(jié)晶紫中，37°C 30min后取出，PBS清洗多余結(jié)晶紫，24孔板中加入500 ill 33%醋酸，將小室置于其中，浸膜，振蕩lOmin，充分溶解。取出小室，24孔板于酶標(biāo)儀上595nm測OD值，反應(yīng)發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)。如圖4所示，PTD-ChmplA作用于腫瘤細(xì)胞A498和786-0后顯著降低了腫瘤細(xì)胞的侵襲能力(與野生型ChmplA比較P < 0. 05)，且PTD-Chmp IA抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力呈劑量相關(guān)性，而野生型ChmplA對腫瘤細(xì)胞的侵襲能力影響較小(與PBS比較 P > 0. 05)。實施例15 PTD-ChmplA蛋白體內(nèi)抑制腫瘤的生長對數(shù)生長期的A498細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后用無血清的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌2次，BALB/c裸鼠前肢腋下接種A498細(xì)胞，每只接種量為200000個細(xì)胞。接種2周后，對腫瘤分別多點(diǎn)注射20 ii g PTD-ChmplA蛋白、20 y g野生型ChmplA蛋白和PBS，給藥容量為200 yl，每周給藥I次，并在接種后第2、3、4、5周分別測量腫瘤的體積，并在第5周取出腫瘤進(jìn)行稱量。如圖5、圖6和圖7所示，注射PTD-ChmplA蛋白后，腫瘤的體積增長速度明顯下降(在第4、5周與野生型ChmplA比較P < 0. 01)，且在接種后第5周，腫瘤的重量明顯低于注射野生型ChmplA后的腫瘤重量(P < 0. 01)，而與PBS組比較，野生型ChmplA對腫瘤的體積和重量未見顯著影響(P > 0. 05)。
權(quán)利要求
1.一種重組染色質(zhì)修飾蛋白1A，包括染色質(zhì)修飾蛋白1A，其特征在于，所述染色質(zhì)修飾蛋白IA的C端連接His-Tag，N端連接PTD序列，所述PTD序列的氨基酸序列為YGRKKRRQRRR，所述重組染色質(zhì)修飾蛋白IA的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2.—種編碼權(quán)利要求I所述重組染色質(zhì)修飾蛋白IA的基因，堿基序列如SEQ ID NO. 4所示。
3.一種包括權(quán)利要求2所述基因的重組載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于，原始載體為PPIC9K載體。
5.一種包括權(quán)利要求2所述基因的轉(zhuǎn)化子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化子，其特征在于，宿主細(xì)胞為畢赤酵母(Pichiapastoris)KM17。
7.如權(quán)利要求I所述的重組染色質(zhì)修飾蛋白IA在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求I所述的重組染色質(zhì)修飾蛋白IA的制備方法，包括 (1)提取人胎盤組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA； (2)以cDNA為模板，利用堿基序列分別如SEQID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示的引物P3和引物P4，進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (3)將步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物連接于載體pGEM-TEasy中，得到質(zhì)粒pGEM-T-ChmplA ; (4)以質(zhì)粒pGEM-T-ChmplA為模板，利用堿基序列分別如SEQID NO. 7和SEQ ID NO. 8所示的引物Pl和引物P2，進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (5)步驟⑷的PCR產(chǎn)物回收后，經(jīng)EcoRI和Not I雙酶切，連接于載體pPIC9K中，得到質(zhì)粒 pPIC9K-PTD-ChmplA ； (6)將質(zhì)粒pPIC9K-PTD-ChmplA轉(zhuǎn)入畢赤酵母KM17； (7)對內(nèi)含質(zhì)粒pPIC9K-PTD-ChmplA的畢赤酵母KM17進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，從培養(yǎng)基中分離純化得到所述的組染色質(zhì)修飾蛋白1A。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組染色質(zhì)修飾蛋白1A及其編碼基因和應(yīng)用，所述重組染色質(zhì)修飾蛋白1A包括染色質(zhì)修飾蛋白1A，所述染色質(zhì)修飾蛋白1A的C端連接His-Tag，N端連接PTD序列，所述PTD序列的氨基酸序列為YGRKKRRQRRR，所述重組染色質(zhì)修飾蛋白1A的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明在野生型Chmp1A中引入His-tag標(biāo)簽，不會改變Chmp1A的結(jié)構(gòu)且可以很容易地通過Ni-NTA Argarose蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化。在野生型Chmp1A中引入PTD序列，在PTD的引導(dǎo)下Chmp1A可以有效的進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮Chmp1A的抗腫瘤活性。
文檔編號C12N15/81GK102718856SQ20121019412
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月12日
發(fā)明者周國亮, 宣堯仙, 張立將, 徐潘生, 李峰, 楊紅忠, 由振強(qiáng), 辛艷飛, 陳云祥, 陳國燦, 陳穎 申請人:浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院