專(zhuān)利名稱(chēng)：一種壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素截短片段重組蛋白及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素截短片段重組蛋白，本發(fā)明還公開(kāi)了所述的蛋白的制備方法，具體涉及壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素主要抗原表位融合基因的構(gòu)建及真核表達(dá)，屬于生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腐蹄病(footrot)是發(fā)生于牛、羊、鹿等家養(yǎng)和野生動(dòng)物蹄部的一種常見(jiàn)疾病，由壞死梭妖舊QFusobacterium necrophorum，F(xiàn). necrophorum)引起，具有高度接觸傳染性。該病不僅影響動(dòng)物的正常活動(dòng)與生活能力，還能導(dǎo)致動(dòng)物生產(chǎn)性能明顯下降，如果處理不當(dāng)甚 至造成動(dòng)物被淘汰，給我國(guó)反芻動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，其預(yù)防和控制已直接關(guān)系到我國(guó)反芻動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)能否持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。然而傳統(tǒng)滅活疫苗因細(xì)菌培養(yǎng)困難、滅活不完全等缺點(diǎn)，影響了疫苗的生產(chǎn)與應(yīng)用。白細(xì)胞毒素是ー種對(duì)反芻動(dòng)物白細(xì)胞具有特異性細(xì)胞毒性作用的細(xì)菌外毒素，被認(rèn)為是F. flecroMoriffl 感染反芻動(dòng)物形成腐蹄病的主要毒力因子,并成為了研制預(yù)防鹿、牛腐蹄病基因工程疫苗的首選靶標(biāo)。但是由于白細(xì)胞毒素全基因表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性差，易降解；其結(jié)構(gòu)基因ジ重組蛋白又對(duì)表達(dá)宿主有裂解作用而造成無(wú)法通過(guò)基因工程手段獲得重組白細(xì)胞毒素蛋白；后來(lái)Narayanan等另辟蹊徑將IktA截?cái)嘈纬?個(gè)彼此部分重疊，但覆蓋從M整個(gè)ORF的基因片段(bsbse、X、GAS、SH和FINAL)后，成功表達(dá)鑒定出bsbse和·^兩個(gè)重要抗原表位；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)存在眾多抗原表位以及在白細(xì)胞毒素天然結(jié)構(gòu)正確折疊過(guò)程中有重要的作用的^as基因。這些研究結(jié)果提示，截短表達(dá)的白細(xì)胞毒素重組蛋白具有抗原獲取方便，保護(hù)性抗原區(qū)域精確等優(yōu)勢(shì)，可以作為研制新型重組疫苗以取代傳統(tǒng)滅活疫苗。但迄今為止一直未見(jiàn)有商品化疫苗出現(xiàn)；究其原因可能與単獨(dú)重組蛋白BSBSE和SH成本太高，抗原的免疫原性較低等緣故；另外從經(jīng)濟(jì)角度考慮，原核表達(dá)系統(tǒng)也不適合于大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)有夫。目前利用酵母表達(dá)系統(tǒng)開(kāi)發(fā)牛、羊、鹿等反芻動(dòng)物腐蹄病重組亞單位疫苗在國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道，但在理論上是可行的。酵母菌培養(yǎng)簡(jiǎn)單、方便、所需培養(yǎng)基價(jià)格也較低。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)粗提即可應(yīng)用。因此，利用酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)牛、羊、鹿等反芻動(dòng)物腐蹄病重組亞單位疫苗具有良好的前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素截短片段重組蛋白，目的之一在于該蛋白不僅能用于生產(chǎn)疫苗、還能作為血清抗體的捕獲劑。本發(fā)明還提供一種壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素截短片段重組蛋白的制備方法，該方法可用于壞死梭桿菌截短重組蛋白エ業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下
本發(fā)明公開(kāi)的壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素截短片段重組蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ No. 12所示、其DNA序列如SEQ No. 11所示。本發(fā)明所述的壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素截短片段重組蛋白的制備方法，包括如下步驟
(1)以壞死梭桿菌FN(4)株基因組DNA為模板，
結(jié)合引物對(duì)I :
上游引物5’ -TACTACGTAAGCGGCATCAAAAGTAACGTTCAG-3,
下游引物5’ -TACGGATCCTCCACCTCCATCTACTGGAATGATTCCAT-3’ ；
結(jié)合引物對(duì)2 :
上游引物5 ’ - GTGAACAATGAAGTTTCTGCA-3 ’，
下游引物5’ -TACTCCGGCTGCAAGAATTCCA-3’ ； 擴(kuò)增gas-sh基因片段；
(2)連接gas-sh基因片段至pMD 18-T載體，并以連接產(chǎn)物為模板，
結(jié)合引物對(duì)3 :
上游引物5 ’ -CAAGGATCCGGAGGTGGAGGCAGCGTGAACAATGAAGTTTCTGCA-3，，
下游引物5’ - TCCGCGGCCGCTACTCCGGCTGCAAGAATTCCA-3’ ；
PCR擴(kuò)增基因片段；
(3)體外連接bsbse和gas-sh基因片段，
結(jié)合引物對(duì)4 :
上游引物5’ _ CAAGGATCCGGAGGAGGAGGCAGCACAGAGTCTGATGCGGTAATTGC-3，,
下游引物5’ - TCAGCGGCCGCTACTCCGGCTGCAAGAATTCCA-3’ ；
PCR擴(kuò)增獲得bsbse-gas-sh融合基因，其核苷酸序列如SEQ No. 13所示；
(4)BamEI和ZAo I分別酶切融合基因bsbse-gassh和pPIC9K，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K - bsbse-gassh ；
(5)線(xiàn)性化表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌誘導(dǎo)表達(dá)，得壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素截短片段重組蛋白。本發(fā)明所述的壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素截短片段重組蛋白制備方法，其特征在于 步驟5)中宿主菌為畢赤酵母KM71H，在甲醇誘導(dǎo)終濃度為1%吋，連續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)4d。本發(fā)明所述的壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素截段重組蛋白制備方法的引物為
(1)引物I:
上游引物 I :5’ -TACTACGTAAGCGGCATCAAAAGTAACGTTCAG-3,
下游引物 2 :5’ -TACGGATCCTCCACCTCCATCTACTGGAATGATTCCAT-3> ；
(2)引物II
上游引物 3 :5’ - GTGAACAATGAAGTTTCTGCA-3’，
下游引物 4 :5’ -TACTCCGGCTGCAAGAATTCCA-3 ； ’
(3)引物III
上游引物 5 :5’ -CAAGGATCCGGAGGTGGAGGCAGCGTGAACAATGAAGTTTCTGCA-3，,
下游引物 6 :5’ - CCGCGGCCGCTACTCCGGCTGCAAGAATTCCA-3’ ；
(4)引物IV
上游引物7:
5’ - CAAGGATCCGGAGGAGGAGGCAGCACAGAGTCTGATGCGGTAATTGC-3，,
下游引物 8 :5’ - TCAGCGGCCGCTACTCCGGCTGCAAGAATTCCA-3。
本發(fā)明的積極效果在于利用甲醇酵母作為轉(zhuǎn)化受體菌，其表達(dá)產(chǎn)物活性高，生產(chǎn)規(guī)模容易放大，成本低廉。在同一個(gè)表達(dá)宿主體內(nèi)同時(shí)表達(dá)/7. flecroMorw 白細(xì)胞毒素的2個(gè)主要抗原(かかe和i)以及與毒素天然構(gòu)象形成有關(guān)的^^基因，有利于生產(chǎn)具有高生物活性的壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素重組蛋白?？梢杂糜谏a(chǎn)預(yù)防當(dāng)下流行的鹿、牛腐蹄病的疫苗。在另一方面，新型基因工程疫苗相對(duì)于傳統(tǒng)疫苗具有更低成本，能有效地減少腐蹄病發(fā)生,降低鹿、牛的養(yǎng)殖成本。


圖I為本發(fā)明的壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素/ / fgas-i融合基因庫(kù)的載體示意 圖2為壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素bsbse基因和gas-sh基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；
圖3為bsbse-gas-sh融合基因PCR鑒定結(jié)果；
圖 4 為 ρΜ0 18- 5ν^5(9"ν<3·5-5 酶切鑒定結(jié)果；
圖5為畢赤酵母轉(zhuǎn)化子PCR鑒定結(jié)果；
圖6為重組蛋白BSBSE GAS-SH的SDS-PAGE分析；
圖7為重組蛋白BSBSE GAS-SH的Western Blot分析。
具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本本發(fā)明作進(jìn)ー步闡述，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于 例證目的，絕不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例I
壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素主要抗原基因重組酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
I材料和方法
I. I菌種、載體和宿主
壞死梭桿菌{Fusobacterium necrophorum, FN) FN ⑷株、大腸桿菌{Escherichiaco 11) TOPlO均為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所省部共建特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；pMD18-T質(zhì)粒購(gòu)自TaKaRa公司，KM71H畢赤酵母、pPICZC與pPIC9K表達(dá)載體購(gòu)自Invitrogen公司。主要試劑
T4 DNA Ligase，位Taq聚合酶，限制性?xún)?nèi)切酶Afoi I、ガa H I^aB I，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和高范圍蛋白Marker均購(gòu)自TaKaRa公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自中杉金橋；G418購(gòu)于上海前塵生物科技有限公司；藤黃節(jié)桿菌酶(zymolyase)購(gòu)于合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。試劑與培養(yǎng)基配制
常見(jiàn)試劑與培養(yǎng)基的配制參照試劑說(shuō)明書(shū)及分子克隆試驗(yàn)指南完成。主要儀器
垂直板電泳槽、電泳儀、水平搖床北京市六一儀器廠(chǎng)；PCR儀(美國(guó)MJ公司);凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；
I.6實(shí)驗(yàn)方法
質(zhì)粒提取、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、酶切反應(yīng)、DNA片段回收、連接和轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主等基因工程研究領(lǐng)域常規(guī)操作方法，參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》完成；重組蛋白鑒定和免疫原性分析分別參照《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》和《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》完成。具體詳述如下
1.7壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素ガ融合基因的構(gòu)建 1.7.1引物設(shè)計(jì)
根據(jù)GeneBank已公布?jí)乃浪髼U菌白細(xì)胞毒素序列(AF312861)，并結(jié)合牛腐蹄病壞死梭桿菌H05菌株從M的抗原表位的分析，利用Primer Premier 5. O軟件和Oligo 6. O設(shè)計(jì)Mse (528 bv), gassh (2913 bp)基因片段的擴(kuò)增引物，引物由生エ上海生物工程公司合成。
權(quán)利要求
1.一種壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素截短片段重組蛋白，其特征在于 其氨基酸序列如SEQ No. 12所示,其DNA序列如SEQ No. 11所示。
2.構(gòu)建權(quán)利要求I所述的壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素截短片段重組蛋白的方法，包括如下步驟 (1)以壞死梭桿菌FN(4)株基因組DNA為模板，結(jié)合引物對(duì)I擴(kuò)增bsbse基因片段；結(jié)合引物對(duì)2擴(kuò)增gas-sh基因片段； (2)連接gas-sh基因片段至pMD 18-T載體，并以連接產(chǎn)物為模板，結(jié)合引物對(duì)3進(jìn)行PCR擴(kuò)增gas-sh基因片段； (3)體外連接bsbse和gas_sh基因片段,結(jié)合弓I物對(duì)4進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得bsbse_gas_sh融合基因，其核苷酸序列如SEQ No. 11所示； (4)BamH I和Xho I分別酶切融合基因bsbse-gas-sh和pPIC9K，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K - bsbse-gas-sh ； (5)線(xiàn)性化表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌誘導(dǎo)表達(dá)，得壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素截短片段重組蛋白。
3.權(quán)利要求2所述的壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素截短片段重組蛋白制備方法，其特征在于步驟5中宿主菌為畢赤酵母KM71H，在甲醇誘導(dǎo)終濃度為1%吋，連續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)4d。
4.權(quán)利要求2所述的壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素截短片段重組蛋白制備方法，其特征在于所述的引物對(duì)為 Cl)引物對(duì)I : 上游引物5’ -TACTACGTAAGCGGCATCAAAAGTAACGTTCAG-3, 下游引物5’ -TACGGATCCTCCACCTCCATCTACTGGAATGATTCCAT-3’ ； (2)引物對(duì)2: 上游引物5’ - GTGAACAATGAAGTTTCTGCA-3’， 下游引物5’ -TACTCCGGCTGCAAGAATTCCA-3 ； ’ (3)引物對(duì)3: 上游引物5’ -CAAGGATCCGGAGGTGGAGGCAGCGTGAACAATGAAGTTTCT-GCA-3， 下游引物5’ - CCGCGGCCGCTACTCCGGCTGCAAGAATTCCA-3’ ； (4)引物對(duì)4: 上游引物5’ _ CAAGGATCCGGAGGAGGAGGCAGCACAGAGTCTGATGCGGTAATTGC-3’， 下游引物5’ - TCAGCGGCCGCTACTCCGGCTGCAAGAATTCCA-3。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素截短片段重組蛋白及其制備方法。重組蛋白的核苷酸序列如SEQNo.11所示，氨基酸序列如SEQNo.12所示；利用基因工程技術(shù)，克隆核苷酸序列并連接至pPIC9K表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71H并誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。Westernblot檢測(cè)證明，重組蛋白具有免疫原性。
文檔編號(hào)C12N15/31GK102690337SQ20121019383
公開(kāi)日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月13日
發(fā)明者馮二凱, 劉曉穎, 徐晶, 陳立志 申請(qǐng)人:陳立志