枯草芽胞桿菌及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)及其應(yīng)用，其中枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)GLB191，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2014年10月29日，保藏編號為CGMCC NO.9870。本發(fā)明的枯草芽胞桿菌菌株，具有較廣的抑菌譜，本發(fā)明利用發(fā)酵生產(chǎn)的菌劑既能防病，又能保護(hù)環(huán)境，減少化學(xué)農(nóng)藥的殘留，在可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展中應(yīng)用前景廣闊。CGMCC NO.987020141029
【專利說明】
枯草芽胞桿菌及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，尤其涉及一種枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄是我國重要的果樹樹種，我國葡萄種植面積和產(chǎn)量均位居世界前列。但種植 現(xiàn)狀卻不容樂觀，特別是病蟲害種類多、危害嚴(yán)重，農(nóng)藥使用次數(shù)多、使用量大。葡萄霜霉病 是鮮食和釀酒葡萄上最為嚴(yán)重的世界性病害。引起葡萄霜霉病的病原菌是Plasmopara viticola(Berk.&Curtis.)Berl et de Toni,屬鞭毛菌門、霜霉目、單軸霉屬真菌，是專性 寄生菌。該病原菌主要侵染葡萄葉片，也可侵染花序和幼果。
[0003] 化學(xué)農(nóng)藥防治仍然是目前防治葡萄霜霉病的主要方法，被果農(nóng)廣泛接受，但施藥 次數(shù)過多帶來了許多嚴(yán)重問題?；瘜W(xué)防治不僅增加了生產(chǎn)成本，而且造成環(huán)境污染和果實(shí) 殘毒，降低了葡萄及其加工產(chǎn)品的品質(zhì)，也降低了葡萄和葡萄酒質(zhì)量;隨著殺菌劑大量和頻 繁使用，病菌的抗藥性問題在世界各地接連出現(xiàn);農(nóng)藥在抑制病原菌的同時(shí)，也使微生物活 動(dòng)受阻，有益生物量減少。
[0004] 隨著人們對食品安全和環(huán)境保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)，對農(nóng)藥殘留、病菌抗藥性等問題認(rèn) 識(shí)逐漸深入，對尋找和開發(fā)安全高效的殺菌劑要求日益迫切。所以生物防治因其對環(huán)境和 動(dòng)物有較好的安全性而逐漸成為人們所關(guān)注的焦點(diǎn)和熱點(diǎn)，尤其是芽胞桿菌在植物病害防 治中的應(yīng)用倍受人們的青睞。
[0005] 植物內(nèi)生菌是指，那些生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織 和器官內(nèi)部的微生物，被感染的宿主植物(至少是暫時(shí)的）不表現(xiàn)出外在病癥，可通過組織 學(xué)方法或從嚴(yán)格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內(nèi)直接擴(kuò)增出微生物DNA的方法 來證明其內(nèi)生，包括一切生活在植物體內(nèi)的腐生、寄生和共生真菌、細(xì)菌、防線菌等一類微 生物。葡萄內(nèi)生細(xì)菌的研究從20世紀(jì)90年代開始陸續(xù)有報(bào)道，已有研究結(jié)果顯示，葡萄內(nèi)生 細(xì)菌表現(xiàn)出豐富的多樣性，具有防病、促生、對環(huán)境脅迫抗性等生物學(xué)作用。
[0006] 芽胞桿菌生理特征豐富多樣，分布極其廣泛，極易分離培養(yǎng)，是土壤和植物體、根 際的重要微生物種群。具有很高的抗逆能力和抗菌防病作用；芽胞桿菌突出的特征是能產(chǎn) 生耐熱、抗逆的芽胞，這有利于生防菌劑的生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中存活、定殖與繁殖。批 量生產(chǎn)上工藝簡單，成本也較低，施用方便，儲(chǔ)存期長，是一種較理想的生防微生物。芽胞桿 菌在抑制病原菌的過程中有多種機(jī)制參與其中，主要包括抗生作用，競爭作用，誘導(dǎo)抗性及 微生態(tài)調(diào)控等機(jī)制。近年來，已有不少文章陸續(xù)報(bào)道了芽胞桿菌對多種葡萄病原真菌具有 拮抗作用，如利用芽胞桿菌防治葡萄灰霉病、白粉病、枝干病害等。篩選有效防治葡萄霜霉 病的芽胞桿菌并探究其生防機(jī)制為葡萄霜霉病生物防治提供有效的菌株和重要指導(dǎo)意義， 為葡萄及葡萄酒的安全生產(chǎn)奠定了一定的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明旨在解決上面描述的問題。本發(fā)明的目的是提供一種枯草芽胞桿菌 GLB191，該枯草芽胞桿菌存在于葡萄葉片中，其無菌代謝液發(fā)揮主要生防作用，屬于葡萄內(nèi) 生細(xì)菌。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)GLB191， 保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，地址:北京市朝陽區(qū)北辰 西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏日期為2014年10月29日，保藏 編號為CGMCC N0.9870。
[0009] 其中，枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)GLB191為葡萄內(nèi)生細(xì)菌。
[0010]其中，枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)GLB191可分離于葡萄植株的健康葉片 中。
[0011]其中，枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)GLB191是包括葡萄座腔菌、葡萄枝枯病 菌、葡萄蔓枯病菌、蘋果輪紋病菌、蘋果斑點(diǎn)落葉病菌、蘋果黑腐皮殼菌、粉紅單端孢、鏈格 孢果生鏈核盤菌、葡萄孢菌、草莓灰霉病菌、膠孢炭疽菌、致病疫霉、尖孢鐮刀菌、小麥全蝕 病菌、小麥紋枯病菌、茄鏈格孢菌、棉花黃萎病菌在內(nèi)的致病菌的拮抗菌。
[0012] 其中，枯草芽胞桿菌GLB191的16S rRNA基因序列為：
[0013]
[0014]
[0015]其中，gyrA基因序列為：
[0016]
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種菌劑，其包含如權(quán)利要求1~4的任意一項(xiàng) 的枯草芽胞桿菌GLB191。
[0018] 其中，菌劑包括枯草芽胞桿菌GLB191的發(fā)酵液、無菌代謝液中的一種或兩種。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供一種如權(quán)利要求1~4的任一項(xiàng)枯草芽胞桿菌 GLB191或如權(quán)利要求5的菌劑在防治葡萄病害、梨病害、辣椒病害、馬鈴薯病害、草莓病害和 棉花病害中的用途。
[0020] 其中，葡萄病害包括葡萄霜霉病。
[0021] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0022] (1)與現(xiàn)有的枯草芽胞桿菌相比，本發(fā)明提供的枯草芽胞桿菌菌株GLB191，具有較 廣的抑菌譜，對葡萄、梨、辣椒、馬鈴薯、草莓和棉花等多種作物的致病菌均具有較強(qiáng)的拮抗 活性。
[0023] (2)本發(fā)明提供的枯草芽胞桿菌菌株GLB191，特別對葡萄的霜霉病具有良好的生 防作用，其對葡萄霜霉病的實(shí)驗(yàn)室生防效果可以達(dá)到69.0%，田間防效可達(dá)82.2%。
[0024] (3)本發(fā)明提供的菌劑，屬于生物防治菌劑，能夠減少化學(xué)農(nóng)藥的施用，避免環(huán)境 污染，促進(jìn)可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展。
【附圖說明】
[0025]并入到說明書中并且構(gòu)成說明書的一部分的附圖示出了本發(fā)明的實(shí)施例，并且與 描述一起用于解釋本發(fā)明的原理。在這些附圖中，類似的附圖標(biāo)記用于表示類似的要素。下 面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例。對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來 講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0026] 圖1是枯草芽胞桿菌GLB191菌株在LB培養(yǎng)基平板上的培養(yǎng)形態(tài)；
[0027] 圖2是枯草芽胞桿菌GLB191與相關(guān)菌株的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹；
[0028] 圖3是枯草芽胞桿菌GLB191與相關(guān)菌株的gyrA系統(tǒng)發(fā)育樹；
[0029]圖4是霜霉病侵染的葡萄植物的離體葉片；
[0030]圖5是枯草芽胞桿菌GLB191菌株對葡萄霜霉病菌的離體葉片篩選圖片；
[0031] 圖6是實(shí)驗(yàn)點(diǎn)1的枯草芽胞桿菌GLB191對葡萄霜霉病的田間防治效果圖；
[0032] 圖7是實(shí)驗(yàn)點(diǎn)2的枯草芽胞桿菌GLB191對葡萄霜霉病的田間防治效果圖；
[0033]圖8是枯草芽胞桿菌GLB191的發(fā)酵液、菌懸液和無菌代謝液對葡萄霜霉病的防治 效果對比圖。
[0034]圖9是枯草芽胞桿菌GLB191的發(fā)酵液的作用下，葡萄霜霉病的致病菌的孢子囊萌 發(fā)圖片；
[0035]圖10是枯草芽胞桿菌GLB191的無菌代謝液的作用下，葡萄霜霉病的致病菌的孢子 囊萌發(fā)圖片；
[0036] 圖11是正常萌發(fā)的葡萄霜霉病的致病菌的孢子囊萌發(fā)圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例 附圖，對本發(fā)明的技術(shù)方案的實(shí)施例進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā) 明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒 有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。需要說明 的是，在不沖突的情況下，本申請中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互任意組合。
[0038] 實(shí)施例1:枯草芽胞桿菌GLB191的分離及篩選方法
[0039] (1)樣品米集：
[0040] 樣品采集自全國13個(gè)葡萄主產(chǎn)區(qū)的主栽葡萄品種葉片，用低溫箱保存帶回實(shí)驗(yàn) 室，24小時(shí)內(nèi)完成內(nèi)生細(xì)菌的分離。樣品采集地點(diǎn)及時(shí)間見表1。
[0041]表1樣品米集地點(diǎn)及時(shí)間
[0042]
[0044] (2)枯草芽胞桿菌菌株GLB191的獲得：
[0045]表面消毒：取新鮮的葡萄葉片，用無菌水沖洗干凈，分別用70%乙醇（20s)、2%次 氯酸鈉溶液(3min)、70%乙醇（20s)處理，再用無菌水沖洗4次，取100μΙ第4次漂洗水涂布 TSA平板，設(shè)3個(gè)重復(fù)，28 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-5天，無菌落形成說明表面消毒徹底。
[0046]分離方法:稱取表面消毒的葡萄葉片大約2.0g放入已滅菌的研缽中，加8mL無菌水 和少量滅菌的石英砂充分研磨，靜置lmin，吸200uL懸浮液涂布TSA平板，設(shè)3個(gè)重復(fù)，28°C 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)基里長出的菌落數(shù)平穩(wěn)后，將菌落形態(tài)差異的菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)管純 化并保存于4°C。
[0047] TSA培養(yǎng)基:每升培養(yǎng)基中含15g Tryptone(胰蛋白胨），5g大豆蛋白胨，5g NaCl， 15-18g瓊脂;pH 7 · 2-7 · 4; 121°C滅菌20min后備用。
[0048] LB液體培養(yǎng)基:每升培養(yǎng)基中含10g NaCl、10gTrypt〇ne(胰蛋白胨）和5g Yeast Extract(酵母膏）；pH 7.2_7.4;121°C滅菌20min后備用。
[0049] LB固體培養(yǎng)基:每升LB液體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂粉;121°C滅菌20min后備用。
[0050] 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯200g、葡萄糖15g、瓊脂20g，用蒸餾 水定容至l〇〇〇mL; 121°C滅菌20min后備用。
[0051 ]芽胞桿菌GLB191菌株在LB培養(yǎng)基平板上的培養(yǎng)形態(tài)見圖1。
[0052] (3)菌株GLB191的鑒定
[0053] 通過對菌株GLB191 16SrRNA和gyrA基因序列的分析，如圖2和圖3所示，鑒定菌株 GLB191為枯草芽胞桿菌，并在GenBank(美國國家生物技術(shù)信息中心的DNA序列數(shù)據(jù)庫)上獲 取登錄號分別為KR233009、KR233007。
[0054]實(shí)施例2:枯草芽胞桿菌GLB191的拮抗譜測定
[0055] 在PDA培養(yǎng)基上相距3cm處分別接入制備好的病原菌餅作對峙培養(yǎng)，以單獨(dú)接種各 供試菌的菌餅為對照，置于培養(yǎng)箱25°C黑暗培養(yǎng)，每處理設(shè)3次重復(fù)。3d后測量菌落直徑，計(jì) 算供試菌株對病原菌生長的抑制率。結(jié)果顯示枯草芽胞桿菌GLB191對葡萄、梨、辣椒、馬鈴 薯、草莓和棉花等多種作物致病菌具有較強(qiáng)的拮抗活性?？莶菅堪麠U菌GLB191菌株的抑菌 譜見表2。
[0056] 表2枯草芽胞桿菌GLB191抑菌譜
[0057]
[0058]
[0059] 其中，+，++和+++分別代表在PDA培養(yǎng)基中的抑菌效果的三個(gè)檔次，即31~50%，51 ~70%和多71 %，注:表中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為三次重復(fù)的平均值。
[0060] 實(shí)施例3:枯草芽胞桿菌GLB191對葡萄霜霉病的實(shí)驗(yàn)室防治實(shí)驗(yàn)
[0061] 從田間采回新鮮的葡萄霜霉病病葉，帶回實(shí)驗(yàn)室過夜保濕培養(yǎng)，用毛筆將新鮮的 孢子囊刷洗配制成1X104個(gè)/mL的懸浮液待用?？莶菅堪麠U菌GLB191接種LB液體培養(yǎng)基， 180rpm搖陪至95 %以上菌體產(chǎn)孢。取新鮮的葡萄葉片，打成1.5cm直徑的葉盤，用芽胞桿菌 菌懸液10倍稀釋液浸泡處理30min，取出后在超凈工作臺(tái)晾干。在滅菌的空磁盤內(nèi)鋪4層用 無菌水潤濕的紗布，將晾干的葉盤放置于磁盤中，每盤放30個(gè)葉盤，保鮮膜封口保濕，以無 菌水浸泡的葉盤為對照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，20°C放置1天后噴施病原菌，20°C，98 %相對 濕度培養(yǎng)，從對照發(fā)病開始調(diào)查，記錄各級病葉數(shù)及調(diào)查總?cè)~數(shù)，結(jié)果見表4。
[0062] 葡萄霜霉病調(diào)查分級標(biāo)準(zhǔn)見表3(GB/T 17980.122-2004)。
[0063] 表2葡萄霜霉病分級調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)
[0064]
[0066] 生防效果計(jì)算公式：
[0067] 發(fā)病率（％ )=發(fā)病葉盤數(shù)/調(diào)查總?cè)~盤數(shù)X 100
[0068] 病情指數(shù)=Σ (各級發(fā)病葉盤數(shù)X相對級數(shù)值)/(調(diào)查總?cè)~盤數(shù)X 9) X 100
[0069]防治效果（％ )=(對照區(qū)病情指數(shù)一處理區(qū)病情指數(shù))/對照區(qū)病情指數(shù)X 100。
[0070]表4枯草芽胞桿菌GLB191對葡萄霜霉病離體葉片防效測定
[0071] L〇〇72」注：數(shù)據(jù)為三次里復(fù)的平均值
[0073]枯草芽胞桿菌GLB191對葡萄霜霉病的作用見圖4和圖5的對比。
[0074]實(shí)施例4:枯草芽胞桿菌GLB191田間防治試驗(yàn)
[0075] 試驗(yàn)中所用到的生防菌劑芽胞桿菌GLB191在中農(nóng)綠康(北京)生物技術(shù)有限公司 發(fā)酵生產(chǎn)。
[0076] 試驗(yàn)點(diǎn)1:天津市武清區(qū)天津農(nóng)科院林果所，品種為鮮食葡萄玫瑰香，該果園葡萄 霜霉病相對比較嚴(yán)重，選樹齡在3年左右產(chǎn)量穩(wěn)定的果樹，每個(gè)處理約30棵果樹。
[0077] 試驗(yàn)點(diǎn)2:河北省懷來縣中法莊園。品種為釀酒葡萄赤霞珠，該果園葡萄霜霉病每 年都發(fā)生，選樹齡在8年左右產(chǎn)量穩(wěn)定的果樹，每個(gè)處理約50棵果樹。
[0078]處理:每個(gè)處理選樹勢大小一致的果樹，設(shè)4個(gè)重復(fù)小區(qū)。在葡萄展葉后開始噴灑， 葉片正反面噴霧處理，滴水為度，生防菌劑芽胞桿菌GLB191芽胞量為1 X 108CFU/mL，生長季 共噴施處理8次，間隔10天。
[0079] 從對照發(fā)病開始調(diào)查，每隔7-8天調(diào)查一次，每個(gè)小區(qū)調(diào)查中間連續(xù)的3株樹，每 株在上、中、下三個(gè)部位各選擇1個(gè)枝條，調(diào)查全部葉片，記錄各級病葉數(shù)及調(diào)查總?cè)~數(shù)，葡 萄霜霉病調(diào)查分級標(biāo)準(zhǔn)見表5(GB/T 17980.122-2004)，其中，試驗(yàn)點(diǎn)1的防治效果見圖6和 表6，試驗(yàn)點(diǎn)2的防治效果見圖7和表6。
[0080] 表5葡萄霜霉病分級調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)
[0081]
[0082]生防效果計(jì)算公式：
[0083]病情指數(shù)=Σ (各級發(fā)病葉片數(shù)X相對級數(shù)值)/(調(diào)查總?cè)~片數(shù)X 9) X 100
[0084] 防治效果（％ )=(對照區(qū)病情指數(shù)一處理區(qū)病情指數(shù))/對照區(qū)病情指數(shù)X 100
[0085] 表6枯草芽胞桿菌GLB191對葡萄霜霉病的田間防效
[0086]
[0087] 其中，需要說明的是，試驗(yàn)點(diǎn)1處理18d和試驗(yàn)點(diǎn)2處理19d的防效較低，是因?yàn)楫?dāng)時(shí) 處于園間修剪期，對照組病枝被修剪，病情指數(shù)降低，防效降低，屬特殊因素，不計(jì)為正常實(shí) 驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)。
[0088] 實(shí)施例5:枯草芽胞桿菌GLB191抑菌效果對比實(shí)驗(yàn)
[0089]制備枯草芽胞桿菌GLB191的無菌代謝液:將枯草芽胞桿菌GLB191接種LB液體培養(yǎng) 基，180rpm搖陪發(fā)酵至95 %以上菌體產(chǎn)孢，離心培養(yǎng)液，收集菌體和上清液，上清液過濾滅 菌獲得無菌代謝液。
[0090]制備枯草芽胞桿菌GLB191的菌懸液:將上一過程的得到的菌體用無菌水重懸獲得 菌懸液。
[0091 ]取新鮮的葡萄葉片，打成1.5cm直徑的葉盤，分別用發(fā)酵液、無菌代謝液、菌懸液的 10倍稀釋液浸泡處理30min，取出后在超凈工作臺(tái)晾干。在滅菌的空磁盤內(nèi)鋪4層用無菌水 潤濕的紗布，將晾干的葉盤放置于磁盤中，每盤放30個(gè)葉盤，保鮮膜封口保濕，以無菌水浸 泡的葉盤為對照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，20°C放置1天后噴施病原菌孢子囊懸浮液，濃度IX 104個(gè)/mL，20°C，98%相對濕度培養(yǎng)，從對照發(fā)病開始調(diào)查，記錄各級病葉數(shù)，計(jì)算病情指 數(shù)，三種菌液對葡萄霜霉病的防治對比如圖8所示。
[0092] 由圖8可以看出，在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的第4~6天，發(fā)酵液和無菌代謝液均對葡萄霜霉病產(chǎn) 生了明顯的防治效果，而菌懸液則對葡萄霜霉病完全沒有防治效用。
[0093] 并且，根據(jù)掃描電鏡進(jìn)一步的觀察發(fā)現(xiàn)，GLB191發(fā)酵液和無菌代謝液可以抑制孢 子囊萌發(fā)，具體分別如圖9和圖10所示，圖11為正常的孢子囊萌發(fā)的電鏡圖片，根據(jù)以上三 幅電鏡圖片和上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的對比，大致可以推斷，枯草芽胞桿菌GLB191防治葡萄霜霉病 的原理，應(yīng)該與GLB191分泌的某些胞外物質(zhì)能夠抑制病原菌Plasmopara viticola的孢子 囊萌發(fā)有關(guān)。
[0094]綜上所述，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0095] (1)與現(xiàn)有的枯草芽胞桿菌相比，本發(fā)明提供的枯草芽胞桿菌菌株GLB191，具有較 廣的抑菌譜，對葡萄、梨、辣椒、馬鈴薯、草莓和棉花等多種作物的致病菌均具有較強(qiáng)的拮抗 活性。
[0096] (2)本發(fā)明提供的枯草芽胞桿菌菌株GLB191，特別對葡萄的霜霉病具有良好的生 防作用，其對葡萄霜霉病的實(shí)驗(yàn)室生防效果可以達(dá)到69.0%，田間防效可達(dá)82.2%。
[0097] (3)本發(fā)明提供的菌劑，屬于生物防治菌劑，能夠減少化學(xué)農(nóng)藥的施用，避免環(huán)境 污染，促進(jìn)可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展。
[0098]最后應(yīng)說明的是:在本文中，術(shù)語"包括"、"包含"或者其任何其他變體意在涵蓋 非排他性的包含，從而使得包含一系列要素的過程、方法、物品或者設(shè)備不僅包括那些要 素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設(shè)備 所固有的要素。在沒有更多限制的情況下，由語句"包括一個(gè)…"限定的要素，并不排除在包 括所述要素的過程、方法、物品或者設(shè)備中還存在另外的相同要素。
[0099]以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制。盡管參照前述實(shí)施例 對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解:其依然可以對前述各實(shí)施 例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換;而這些修改或者 替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的精神和范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)GLB191，保藏于中國微生物菌種保藏管理 委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2014年10月29日，保藏編號為CGMCC NO.9870。2. 如權(quán)利要求1所述的枯草芽胞桿菌GLB191，其特征在于， 所述枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)GLB191為葡萄內(nèi)生細(xì)菌。3. 如權(quán)利要求1所述的枯草芽胞桿菌GLB191，其特征在于， 所述枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)GLB191可分離于葡萄植株的健康葉片中。4. 如權(quán)利要求1所述的枯草芽胞桿菌GLB191，其特征在于， 所述枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)GLB191是包括葡萄座腔菌、葡萄枝枯病菌、葡 萄蔓枯病菌、蘋果輪紋病菌、蘋果斑點(diǎn)落葉病菌、蘋果黑腐皮殼菌、粉紅單端孢、鏈格孢果生 鏈核盤菌、葡萄孢菌、草莓灰霉病菌、膠孢炭疽菌、致病疫霉、尖孢鐮刀菌、小麥全蝕病菌、小 麥紋枯病菌、茄鏈格孢菌、棉花黃萎病菌在內(nèi)的致病菌的拮抗菌。5. -種菌劑，其包含如權(quán)利要求1~4的任意一項(xiàng)所述的枯草芽胞桿菌（Baci Ilus subtilis)GLB191。6. 如權(quán)利要求5所述的菌劑，其特征在于， 所述菌劑包括所述枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)GLB191的發(fā)酵液、無菌代謝液 中的一種或兩種。7. 如權(quán)利要求1~4任一所述的枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)GLB191或如權(quán)利要 求5所述的菌劑在防治葡萄病害、梨病害、辣椒病害、馬鈴薯病害、草莓病害和棉花病害中的 用途。8. 如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于， 所述葡萄病害包括葡萄霜霉病。
【文檔編號】A01N63/02GK105907662SQ201610218211
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月8日
【發(fā)明人】王 琦, 張珣, 周瑩瑩, 李燕
【申請人】中國農(nóng)業(yè)大學(xué)