缺血性腦卒中多種生物標志物臨床檢測試劑盒的制作方法
【專利說明】
1、技術領域:
[0001]本發(fā)明涉及在缺血性腦卒中血清差異表達的多個和單個生物標志物的鑒定和選擇與在缺血性腦卒中血清中差異表達的生物標志物任意組合或單個標志物的鑒定和選擇，以及選擇所述生物標志物組合的方法。本發(fā)明還涉及生物標志物以用于缺血性腦卒中疾病的預警、診斷、監(jiān)測、健康狀態(tài)評價和預測以及判斷預后和治療效果平價的臨床檢測用途及其試劑盒。本發(fā)明還涉及監(jiān)測干預方案效果。該發(fā)明專利屬于臨床醫(yī)學、急診醫(yī)學、臨床診斷學、實驗診斷學和生物技術領域交叉學科的創(chuàng)新技術研究，
2、【背景技術】:
[0002]腦卒中是我國最常見的慢性病之一。2000年我國腦卒中死亡率在城市地區(qū)為127.96/10萬，農村地區(qū)為115.2/10萬。每年用于卒中的治療費用400億，如果按各類危險因素人群(糖尿病患者1.36億，血脂異常2億，高血壓患者2.66億，吸煙人群3.5億，房顫患者800萬人，肥胖者7000萬人)計10.3億人次已處于腦卒中危險地帶。目前腦卒中已成為我國第一大致殘和第二大致死疾病，位于世界腦卒中發(fā)病地圖中處于“高死亡帶”。
[0003]隨著中國邁向老齡化社會的腳步不斷加快，全國> 60歲老人2億，每年因腦卒中死亡270萬，是歐美4-5倍，每年還有250萬的新發(fā)病例正以8.7%速度增長，超過⑶P的增長速度，幸存病例750萬。腦卒中的死亡率還在不斷攀升。據(jù)統(tǒng)計目前每12秒鐘就有I名腦卒中新發(fā)病者，每21秒鐘就有I人死于腦卒中[1，2]。
[0004]腦卒中病程進展慢，但發(fā)病率、病死率和致殘率都很高，給患者、家庭、社會帶來了巨大的精神負擔和經濟負擔。因此，對于腦卒中患者來說早期預警和診斷、評價并迅速實施干預治療是非常重要的。目前，對于急性缺血性腦卒中(AIS)的診斷主要依賴于患者的臨床表現(xiàn)和神經影像學資料，如CT或MRI。然而CT對于缺血性腦卒中尤其是程度較輕的病例作用不大；而腦部的MRI價格昂貴、耗費時間長，且很多急診醫(yī)療部門無能力配置，同時由于一些患者自身的原因限制了 MRI的廣泛使用。因此建立蛋白質微陣列芯片近紅外熒光標記技術聯(lián)合檢測急性缺血性腦卒中血清8種血清標志物水平與急性缺血性腦卒中臨床評價非常重要。解決目前還尚無MR1、CT的醫(yī)療機構對急性缺血性腦卒中病人的診療問題和影像學診斷時間窗的問題。用于腦卒中危險因素人群的篩查，以便早期干預治療，節(jié)約醫(yī)療資源。
[0005]本發(fā)明的8種血清蛋白標志物應用蛋白質微陣列芯片近紅外熒光標記技術、酶免技術、發(fā)光技術等與其配對抗原/抗體結合的原理，在固相基質中結合此8種標志物的單克隆抗體，捕捉被檢測血清中特異蛋白，并經特異的化學反應產生光信號，根據(jù)光強度的強弱對蛋白標志物進行定量分析；擬研發(fā)的蛋白質微陣列芯片試劑盒將解決目前缺血性腦卒中診斷方法主要依賴MR1、CT、成本高、時間窗長等局限性問題，為這一重大疾病的預警和早期診斷提供技術支撐。該試劑盒的問世給缺血性腦卒中的早期預警、早期臨床診斷和早期干預治療提供幫助，對于降低醫(yī)療費用，提高診療率和生存質量具有明顯的社會經濟意義。為解決目前還沒有MRI和CT檢查設備的中小醫(yī)院、社區(qū)衛(wèi)生院提供更好的診斷工具，縮短缺血性腦卒中的診斷時間，為其救治爭取更多的機會，從而加強對腦卒中的三級預防防控措施產生深遠影響。該試劑盒的問世也填補了國內尚無用于缺血性腦卒中(AIS)特異性的臨床實驗室診斷工具。
3、
【發(fā)明內容】
[0006]本發(fā)明涉及SHIP-1，IGF-1, SDPR, MBL, I CAM-1, Hs-CRP, LP (a)，MMP-9 芯片臨床診斷試劑，除Hs-CRP生化試劑外的其余項目的任意組合或單味的任意方法學的臨床診斷試劑和方法學包含在權利要求書1-6項，以及8種血清蛋白標志物的鑒定和選擇及其生物標志物任意組合的鑒定和選擇，所述8種血清蛋白標志物在血液中差異表達并可用于缺血性腦卒中疾病的預警、診斷、監(jiān)測、健康狀態(tài)評價和預測以及判斷預后和治療效果平價的臨床檢測。本發(fā)明生物標志物和生物標志物組合的測定結果被用于缺血性腦卒中的預警、診斷及判斷預后。為了測定本發(fā)明生物標志物的血清表達量，所述的8種生物標志物的任意組合和所述方法學研發(fā)的臨床應用試劑盒及其用途均在本發(fā)明范圍內。本發(fā)明還包括所述8種生物標志物的抗原和其對應抗體的制備方法和質量標準。本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的生物標志物的鑒定方法。
[0007](I)利用基因擴增技術構建工程菌以獲得8種蛋白的純化抗原和抗原質量標準
[0008](2)利用雜交瘤技術生產8種蛋白的特異性單克隆抗體(含二抗的單抗和多抗，人源的和合成的)質量標準
[0009](3)將8種血清蛋白標志物的配對抗體，應用蛋白質微陣列芯片技術和抗原抗體結合的原理，在固相基質中結合此8種標志物的配對單克隆抗體，捕捉被檢測血清中特異蛋白，并經特異的化學反應產生光信號，根據(jù)光強度的強弱對蛋白標志物進行定量分析。
[0010](4)試制蛋白質微陣列芯片臨床診斷試劑盒，分析病例組和條件匹配的對照組，確定檢測結果與急性缺血性腦卒中診斷的符合程度，確定該試劑對于疾病早期預警和早期診斷的時間敏感性和特異性
[0011]4、原材料質量控制
[0012]A、進行反應模塊的研究及蛋白芯片最佳反應模塊；
[0013]B、對抗體稀釋緩沖液、芯片封閉液體系進行研究及最佳配制方案；
[0014]C、進行抗體點樣量的研究及抗體點樣時稀釋方案設計原則；
[0015]D、對蛋白芯片點樣生產工藝及蛋白芯片點樣生產工藝流程；
[0016]E、對蛋白芯片裝配工藝及蛋白芯片裝配工藝流程及質量控制標準。
[0017]5、反應液體系生產
[0018]I)濃縮洗滌液的生產:
[0019]2)反應體系的確定:
[0020]3)廣品質量標準的確定:
[0021]4)產品性能評估
[0022]A、分析靈敏度:達到pg/ml水平；
[0023]B、檢測信號線性范圍:106數(shù)量級；
[0024]C、檢測濃度線性范圍:104數(shù)量級；
[0025]D、檢測準確性:90%?110% ;
[0026]E、檢測精密性:小于15% ；
[0027]F、熒光檢測分辨力小于50um;
[0028]G、探測靈敏度:0.2熒光分子/um2 ；
[0029]H、準確度:90%?110% ；
[0030]1、分析靈敏度:小于各指標l/10cutoff值濃度；
[0031]J、檢測濃度線性范圍:0.5cutoff?50cutoff值濃度；
[0032]K、檢測精密性:小于15% ；
[0033]L、臨床靈敏度:大于80% ；
[0034]M、臨床特異度:大于90 %。
6、【具體實施方式】:
[0035]本發(fā)明涉及從血液中鑒定和選擇在缺血性腦卒中患者與正常人之間差異表達和可單獨和聯(lián)合用于診斷的試劑。如此，本發(fā)明涉及能用于檢測和監(jiān)測生物標志物和生物標志物組合的差異蛋白表達以用于缺血性腦卒中疾病的預警、診斷、監(jiān)測、健康狀態(tài)評價和預測以及判斷預后和治療效果平價的臨床檢測。本發(fā)明還涉及鑒定特別有用的生物標志物各組合的方法。
[0036]I)定義除非另外指明，本發(fā)明的實施將利用細胞生物學、分子生物學、微生物學和重組DNA技術的常規(guī)技術，它們在本領域技術人員能力范圍內。這些技術在文獻中已被解釋。
[0037]2)本發(fā)明所述的缺血性腦卒中患者血清8種生物標志物的任意組合和方法學技術均經引用并入本文。
[0038]3)本文設計的“擴增”為分子生物學范圍
[0039]4)本文涉及的“微陣列”包括固定到固相支持物上的一組特異性蛋白，或一組對應的特異性抗體以獲得缺血性腦卒中診斷的相同結果。
[0040]5)術語“抗體”還包括抗體的抗原結合片段。本文所用的術語抗體的“抗原結合片段”(或簡稱“抗體部分”或“片段”)表示保留特異性結合多肽能力的全長抗體的一個或多個片段
[0041]6)本文所用術語“生物標志物”表示在缺血性腦卒中患者個體和正常個體(無缺血性腦卒中個體)之間受差異調節(jié)的蛋白。
[0042]7)本文所用術語“差異表達”表示與對照樣品中相同的一種或多種本發(fā)明生物標志物的表達水平比較
[0043]8)適用于本發(fā)明的可檢測標記物包括可以通過光譜、光化學、生物化學、免疫化學、電、光或化學手段檢測的任何組分?？捎糜诒景l(fā)明的標記物包括用標記的鏈親合素偶聯(lián)物染色的生物素、磁珠、熒光染料(如熒光素、德克薩斯紅、羅丹明、綠色熒光蛋白等)、放射性標記物(如3H、1251、35S、14C或32P)、酶(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和其它常用于ELISA的酶)和比色標記物如膠體金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等)珠。檢測這些標記物的手段對本領域技術人員是公知的。
[0044]9)在一個優(yōu)選實施方案中,用于比較的一種或多種樣品用產生可區(qū)分檢測信號的不同的突光染料標記，不同標記的革G樣品同時雜交到同一微陣列上。在一個優(yōu)選實施方案中，蛋白樣品將包括一種或多種對照分子，它們與微陣列上的特異性抗原或抗體結合以標準化微陣列產生的信號。優(yōu)選的是，標記的標準化蛋白樣品是與上述點到微陣列上的特異性抗原或抗體完全對應。標準化對